CN110974908A - 一种抗抑郁天麻发酵提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗抑郁天麻发酵提取物及其制备方法和应用，此提取物是蛹虫草发酵天麻后的产物经水提制备而成，其发酵菌种为蛹虫草，蛹虫草的菌株保藏号为：CCTCC M 2019789，于2019年10月9日在中国典型培养物保藏中心保藏发酵提取物；该提取物的制备方法包括发酵培养基制备、一定条件下的发酵、发酵产物提取制备等步骤。本发明提供了一种全新的利用蛹虫草发酵天麻获得的发酵产物，该产物具有明显的抗抑郁作用，可以应用于制备治疗抗抑郁的药物中，为进一步研发疗效显著、抗抑郁效果理想的中药抗抑郁药物提供了基础，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药微生物发酵转化产物及其制备方法和应用，尤其是一种抗抑郁的天麻发酵提取物及其制备方法和应用。
背景技术
抑郁症是一种常见的精神疾病，表现为情绪低落、对事物失去兴趣、不快乐、罪恶感、自卑、睡眠或食欲异常、低能量、注意力不集中等。这种疾病会严重影响患者的日常生活，给自己及家人带来身体和精神上的痛苦，更糟糕的是严重时会引起患者自杀。
随着现代社会多种应激因素的加剧，抑郁症已成为现代社会的常见病，全世界每年约有80万人因抑郁自杀，其发病率正在快速上升。据报道我国目前抑郁症的发病率在4.5%左右，约4000多万，而目前全世界至少有3亿人受抑郁的影响，在过去的10年中，患抑郁症的人数在全球范围增加了18%，到2020年抑郁症将成为全球第二大（仅次于心血管疾病）对家庭和社会造成严重负担的疾病。
目前对抑郁症的治疗通常以药物治疗为主，辅以心理等其他治疗手段。药物治疗在挽救病人，减轻病人痛苦方面取得了较好的效果，但据世卫组织报道，全世界只有不到25%的抑郁患者得到了有效治疗。即便如此，全球每年的抗抑郁药品销售额也达到了100多亿美元。我国抗抑郁药物市场规模从2004年的8.71亿元增长到2008年的超过15亿元，每年都有双位数的增长，市场前景广阔。这提示我们研发抗抑郁药物具有重要的社会和经济效益，也说明抗抑郁的道路依然漫长，药物研发任重道远。除经典应用的西药外，现有文献报道和研究，让我们看到了中草药、植物药以及药用真菌的抗抑郁潜力和优势。从它们中寻找新的更有效的组分和成分成为可能。但目前存在的最大问题是成功开发疗效显著的中药、植物药、菌物药很少，一般药物的抗抑郁效果并不理想。究其原因，除了抑郁症的发病机理复杂、病因尚未完全明确之外，与我们对中草药、植物药及药用真菌研究的深度和广度不足有很大关系，需要进一步的研究及开发。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种抗抑郁的天麻发酵提取物及其制备方法和应用，为抗抑郁的药物治疗提供新的选择。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种抗抑郁的天麻发酵提取物，此提取物是蛹虫草发酵天麻后的 产物经水提制备而成，其发酵菌种为蛹虫草；蛹虫草属于粪壳菌纲、 肉座菌目、虫草菌科、虫草属，菌株为B1528，菌株保藏号为：CCTCC M 2019789，于2019年10月9日在中国典型培养物保藏中心保藏。其分 类命名为：蛹虫草Cordyceps militaris B1528，保藏单位名称：中 国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉，保藏单位代码： CCTCC-中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2019年10月9日，保藏 编号：CCTCC M 2019789。
上述抗抑郁的天麻发酵提取物制备方法，包含以下步骤：
(1)发酵培养基制备：取土豆200g，煮汁去渣后加入可溶性淀 粉20g、蛋白胨1g、天麻40g，水定容至1000mL，依此比例进行配置， 装入500mL三角瓶，每瓶200ml，121℃灭菌30min后冷却备用；
(2)发酵培养条件：在摇床上，温度25℃，200r/min条件下培 养12天，得发酵产物；
(3)发酵产物提取制备：取全部发酵产物，加入等量的水，煮 开后接着煮30min，过滤后，再加入水煮30min，按以上步骤循环操 作总共提取3次，将获得的滤液减压浓缩成固体物质，即得天麻发酵 提取物。
上述天麻发酵提取物在制备治疗抗抑郁药物中的应用。
本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明提供了一种全新的利用蛹虫草发酵天麻的产物，该产物具有明显的抗抑郁作用，可以应用于制备治疗抗抑郁的药物中。为进一步研发疗效显著、抗抑郁效果理想的中药抗抑郁药物提供了基础，具有良好的应用前景。
本发明是利用生物转化技术，特别是药用菌物发酵转化中药技术寻找新的抗抑郁组分与成分。
天麻Gastrodia elata Bl.，是国家卫计委公布的可用于保健食品的中药，味甘质润，阳性平和，在《神农本草经》中被列为上品，具有熄风止痉、平抑肝阳、祛风通络的功效，可用于治疗小儿惊风，癫痫抽搐，头痛眩晕，还可用于肢体麻木，手足不遂，风湿痹痛。现代药理研究也证实其具有抗抑郁、保护神经和抗多种神经类疾病，如益智、护脑、镇痛、镇静催眠、抗癫痫、抗晕眩等多种作用。
蛹虫草（Cordyceps militaris (L.) Fr.）简称蛹草，是虫草属的模式种，也是卫生部批准的新资源食品，有较高的药用价值。多年来的化学和药理实验证明，蛹虫草中含有虫草多糖、虫草酸、虫草素、甾醇类、核苷类及人体所需的少量微量元素和各种氨基酸等活性物质，具有调节免疫、抗肿瘤、抗病毒、抗感染、抗氧化、抗疲劳、抗衰老、降血糖、保护肝肾功能等多种药理活性。值得一提的是，最近发现来自蛹虫草的虫草菌素具有快速抗抑郁作用。
真菌转化中药具有提高中药药效，产生新成分，增加中药有效成分含量，减弱中药毒副作用，降解中药大分子和不易吸收成分的作用。本发明利用蛹虫草发酵天麻的产物进行抗抑郁功效评价，结果显示发酵产物水提物有明显的抗抑郁作用，且其效果优于天麻和蛹虫草单独作用效果。
附图说明
图1是本发明的发酵产物对CUMS模型大鼠体重的影响；
图2是本发明发酵产物对CUMS模型的大鼠糖水偏好度的影响；
图3是本发明发酵产物对CUMS模型的大鼠开场垂直活动的影响；
图4是本发明发酵产物对CUMS模型的大鼠开场水平活动的影响；
图5是本发明发酵产物对CUMS模型的大鼠水迷宫活动的影响；
图6是本发明各组大鼠前额叶皮层GluA1表达水平；
图7是本发明各组大鼠海马体GluA1表达水平；
图8是本发明各组大鼠前额叶皮层P-GluA1 Ser845表达量；
图9是本发明各组大鼠海马体P-GluA1 Ser845表达量。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明。
具体实施方式
实验材料
1.1实验动物
雄性SD大鼠80只，SPF级，初始体重：180-220g，购买于长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号：SCXK（湘）2014-0011。每组大鼠分笼饲养，饲养动物室温度20-25℃，实验人员需要按时打扫清理、消毒、通风，按时饲喂SPF级固体颗粒维持饲料和无菌水。
实验药品与试剂
1.2.1实验药品
天麻水提组分制备：取天麻70.2g，打成粉末，加入10倍量的超纯水，煮开后再熬30min，过滤后，再加入水熬30min，按以上步骤循环操作总共提取3次，把获得的滤液减压浓缩为600g水煎剂，备用于灌胃。
发酵产物水提组分制备：（1）发酵培养基：土豆200g煮汁去渣后加入可溶性淀粉20g，蛋白胨1g，天麻40g，水定容至1000mL，依此比例进行配置，装入500mL三角瓶，每瓶200ml，121℃灭菌30min后冷却备用。（2）培养条件：在摇床上，25℃，200r/min条件下培养12天。（3）发酵产物提取制备：取全部发酵产物，加入等量的水，煮开后接着煮30min，过滤后，再加入水煮30min，按以上步骤循环操作总共提取3次，将获得的滤液减压浓缩成固体物质，动物灌胃给药前，用蒸馏水将浸膏溶解成需要浓度的均匀混悬液。
蛹虫草水提组分制备：（1）发酵培养基：土豆200g煮汁去渣后加入可溶性淀粉20g，蛋白胨1g，水定容至1000mL，依此比例进行配置，装入500mL三角瓶，每瓶200ml，121℃灭菌30min后冷却备用。（2）培养条件：在摇床上，25℃，200r/min条件下培养12天。（3）发酵产物提取制备：取全部发酵产物，加入等量的水，煮开后接着煮30min，过滤后，再加入水煮30min，按以上步骤循环操作总共提取3次，将获得的滤液减压浓缩成固体物质，动物灌胃给药前，用蒸馏水将浸膏溶解成需要浓度的均匀混悬液。
盐酸氟西汀（国药准字J20160029），在给药实验前，用蒸馏水配制成一定浓度后备用。
实验试剂
表2-1实验试剂
| 名称 | 厂家 | 货号 |
| 磷酸酶抑制剂 | 碧云天 | S1873 |
| PMSF | 碧云天 | ST506 |
| RIPA裂解液 | 碧云天 | P0013B |
| BCA蛋白浓度测定试剂盒 | 碧云天 | P0010 |
| TEMED | Amresco | Amresc00761 |
| Trise-Base | Biosharp | T1378 |
| HCl | 信阳市化学试剂厂 | GB622-89 |
| 二硫叔糖醇（DTT） | Biosharp | BL552A |
| SDS | 国药集团化学试剂有限公司 | 30166428 |
| 溴酚蓝 | 国药集团化学试剂有限公司 | 71008060 |
| 甘油 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10010618 |
| 丙烯酰胺 | Amresco | Amresco0341 |
| 甲叉丙烯酰胺 | Amresco | Amresc00172 |
| Trise-Base | Biosharp | T1378 |
| 甘氨酸 | Amresco | Amresco0167 |
| SDS | 国药集团化学试剂有限公司 | 10014118 |
| Tris-base | Biosharp | T1378 |
| 甘氨酸 | Amresco | Amresco0167 |
| 甲醇 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10014118 |
| NaCl | 国药集团化学试剂有限公司 | 10016318 |
| KCl | 国药集团化学试剂有限公司 | 10020318 |
| Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>.12H<sub>2</sub>O | 国药集团化学试剂有限公司 | 10017618 |
| KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> | 国药集团化学试剂有限公司 | 10019718 |
| 蛋白marker(10-250KD) | 海利克思 | P12103 |
| PVDF膜(0.45μm) | Millipore | IPVH00010 |
| 兔多抗GAPDH | 杭州贤至生物有限公司 | AB-P-R 001 |
| 兔单抗GRIA1 | ABclonal | A1826 |
| 兔单抗P- GRIA1（S845） | ABclonal | AP0825 |
| HRP标记羊抗兔二抗 | 武汉博士德生物工程有限公司 | BA1054 |
| ECL底物液 | Thermo | NCI5079 |
| X光胶片 | 柯达 | XBT-1 |
| 显影定影试剂盒 | 天津市汉中摄影材料厂 |
2实验仪器
表2-2实验仪器
| 名称 | 厂家 | 型号 |
| 微量移液器 | Eppendorf | |
| Morris水迷宫系统 | 东乐自然基因生命科学公司 | |
| 电泳仪电源 | 北京六一仪器厂 | DYY-7C |
| 垂直电泳槽 | 北京六一仪器厂 | DYCZ-24DN |
| 电转仪 | 北京六一仪器厂 | DYCZ-40 |
| 水平摇床 | 江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司 | TS-1 |
| pH计 | 德国Metter-Toledo GmbH公司 | LP115 |
| 电子天平 | 北京赛多利斯仪器系统有限公司 | CPA |
| 磁力搅拌器 | 江苏省金坛市中大仪器厂 | T8-1 |
| 酶标仪 | Thermo | mμlISKANMK3 |
| 离心机 | 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司 | HI650 |
3实验方法
3.1大鼠慢性应激及行为学测试法
3.1.1动物模型的选择与建立
慢性温和不可预知应激（CUMS）模型的症状表现与人类抑郁症表现大多数相似，可以作为有效的抑郁动物实验模型，被国内外研究人员广泛应用。CUMS模型可用来作为抗抑郁药物评价。现在多用最经典的抑郁动物模型是慢性温和不可预知应激模型配合孤立独笼饲养来建立模型。
大鼠分组和抑郁模型的建立
经过三天适应性饲养，通过行为学评分后，按行为学评分将大鼠分为：空白组（K）、模型组（M，生理盐水）、蛹虫草中剂量组（Y，0.6g×kg-1×d-1）、天麻中剂量组（T，1.17g×kg-1×d-1）、氟西汀组（F，10mg×kg-1×d-1）、发酵产物高剂量组（G，1.2g×kg-1×d-1）、发酵产物中剂量组（Z，0.6g×kg-1×d-1）、发酵产物低剂量组（D，0.3 g×kg-1×d-1），每个分组各10只实验大鼠，空白组大鼠正常喂养，不做任何处理。其他组大鼠独立隔离喂养，采用慢性应激刺激方式建模，共十一种刺激方式，每天随机一种刺激方式，两天之内刺激方式不重复，造模期间每种刺激方式不超过四次，从而形成不可预知方式刺激，共刺激30d。
刺激的种类方式包括：
1）禁水：不改变实验动物生活环境，撤去实验大鼠的水瓶24小时。
2）禁食：不改变实验动物生活环境，撤去实验大鼠的饲料24小时。 3）热烘：将烘箱温度调至45℃保持温度不变，将造模大鼠放入准备好的烘箱中，5min后取，饮食正常不做处理。
4）冰水游泳：将实验大鼠投放入盛有4℃冷水中，容器要求不能使大鼠的后足尖触及水桶底部，5min后取出，擦去大鼠身上的冷水，待其皮毛烘干后放回笼子中，饮食正常不做处理。
5）悬尾：用医用橡皮膏缠绕在大鼠尾部中外1/3处，将医用橡皮膏的另一端缠绕在横平的栏杆上，头部朝下悬吊3min，饮食正常不做处理。
6）束缚：用通气良好的塑料瓶将大鼠束缚后，封好出口，4h后取出，饮食正常不做处理。
7）潮湿垫料：将垫料换成大约含水200ml左右的干净潮湿垫料中24h过夜，然后将潮湿的垫料换成正常洁净垫料中，饮食正常不做处理。
8）夹尾：将实验大鼠抓好固定，用夹子夹大鼠尾的根部，以实验大鼠叫出声为一次，操作5次，放回笼中，饲料、饮水如常。
9）水平振荡：用转速为90r/min的水平振荡仪将大鼠振荡5min。
10）电刺激：用间断式电刺激箱电刺激需要造模的大鼠，3min后取出，饮食正常不做处理。
11）昼夜颠倒：在早晨八点整用黑色帐子遮蔽实验室的窗户，并关掉实验室内的光源，使造模大鼠处于黑暗之中；到晚上八时整时，打开实验室内的日光灯，让实验大鼠处于明亮的光照环境中，第二天早晨八点整关闭实验室内的日光灯，并除去黑色帐子，饮食正常不做处理。 3.1.3行为学实验
3.1.3.1糖水偏好（SPT）及体重测试实验
大鼠购买后，适应性喂养3天，先对其进行蔗糖饮水训练两天：先禁止喂食喂水，第一天只给大鼠喂1%蔗糖水，第二天同时给无菌水和1%蔗糖水。然后正常进食进水3天进行糖水偏好测试：禁食禁水23小时，让大鼠自由饮用一瓶无菌水和瓶1%蔗糖水，1小时后分别测定大鼠饮用两瓶液体的量（ml），统计出蔗糖偏嗜度。蔗糖偏嗜度（%）为：蔗糖水引用体积/（蔗糖水引用体积+无菌水引用体积）·100%。慢性应激模型建立前、建立后和给药后分别进行糖水偏好实验，统计蔗糖偏嗜度。建模前、建模完成后和给药后都进行糖水偏好测试并测量每只大鼠体重。
开场实验（OFT）
建模前、建模完成后和给药后分别进行开场实验测试，用来分析动物的自发性活动。采用正方形敞箱（自制），100cm×100cm×40cm，箱底和四周涂成均匀黑色，分为25个面积相同的正方形格子。大鼠放置于正中央的格子中，其正上方60cm处放一个60W的电灯泡照明，观察大鼠180s内大鼠的活动情况：大鼠走过的格子数（3爪和3抓以上进入相邻的格子视为走过）和站立次数。实验期间，每只大鼠头部都朝向同一个方向，周围无其他光源，安静，取出大鼠后，清理上一只大鼠的残留的毛屑、垫料以及粪便，以免互相干扰实验结果。
水迷宫实验（MWM）
建模前、建模完成后和给药后分别进行水迷宫实验，行为学实验室打扫干净通风后，将水倒入直径为120cm的圆形水迷宫中，水面高出站台1cm左右，水温25摄氏度左右，水迷宫正上方放置一摄像头，用电脑监视系统记录大鼠的行动轨迹，和大鼠找到站台所消耗的时间。准备完毕后，首先进行水迷宫训练：将大鼠放入水迷宫中，如果60秒内没有找到站台，则用木棍引导大鼠站台，熟悉10s后取走，用毛巾将大鼠擦干。训练4天后，第五天进行正式测试。
在做完以上的所有动物行为学实验检测后，立即进行大鼠的大脑取材实验，解剖大鼠的大脑，分离处大鼠的大脑前额叶皮层以及大脑的海马体，取出后先用液氮冷冻保存，然后把取出来的大鼠前额叶皮层与大鼠的海马体放到零下80摄氏度冰箱中冷冻保存，等待下一步检测所用。
脑组织蛋白样品的制备
3.2.1脑组织蛋白的提取方法
取部分少量的大鼠大脑组织，放在2ml的EP管之中，把事先清洗干净过的钢珠放于其中，然后往每个EP管中加入300 μL的单去污剂裂解液裂（含PMSF），用自动匀浆机组织液匀浆3次，每次匀浆持续4s。匀浆程序完成之后，将匀浆后的EP管放置在盛有冰的盒子里的冰面上，进行30min的冰浴充分裂解，裂解过程时，每过10min要进行振荡1次，3次振荡后，用移液枪将裂解后的液体转移到1.5ml离心管之中，然后用离心机离心5min，温度条件为4摄氏度，转速12000r/min，离心后，用移液枪吸取上清液分装到0.5ml离心管之中，然后保存在-20℃的冰箱中。
蛋白浓度的测定
把待测试的样品每个都各取出1μL，把取出的样品和19μL的PBS混合稀释，得到蛋白样品稀释液，然后把BSA标准品用PBS稀释成浓度为1、0.8、0.6、0.4和0.2的标准蛋白，接着分别将经过PBS所稀释后的蛋白样品和用PBS稀释后的标准蛋白加到96孔板的板孔中，每个标准品都设定2个平行的板孔，需要进行测试的样品蛋白每个设置3个平行的板孔，每个孔中加入的检测液体体积为20μL，然后再设置2个PBS的平行板孔，这两个PBS平行孔为空白对照。然后打开BCA试剂盒，将A液与B液按照50比1的比例混合在一起，加入200μL混合液到96孔板中，在操作过程中不能再96板孔之中产生出气泡，如果产生气泡会影响实验的反应结果。最后在37℃的条件下，避光，孵育30min。孵育完成后，将96孔板放于酶标仪中检测OD568。以最终检测出的标准蛋白浓度和与之相对应的OD值为依据，计算出直线回归方程，以蛋白样品的OD数值为根据，通过回归方程计算出需要测试的样品蛋白浓度。
蛋白变性
把已经提取好的蛋白上清和5×蛋白上样缓冲液按照4：1的比例混合，混合后进行10min的沸水浴，变性完后冷却至室温再放入-20℃保存。
电泳
3.3.1电泳胶的制备
把玻璃板处理干净之后，在制胶器上装置好，然后配好分离胶，把配好的分离胶倒进制胶器和玻璃板的缝隙当中，直到适宜厚度停止。接着倒入浓缩胶，插好梳齿，浓缩胶完全聚合后取出梳齿。
表2-3电泳胶配置体系
3.3.2电泳分离
把制备的电泳胶装置于电泳槽中，加入电泳液，用移液枪吸取40μg待测样品和MARKER加入到梳齿孔，先加电压80V进行电泳，等到溴酚蓝指示剂处于浓缩胶和分离胶的中间并成为一条线的形状时，把电压调至120V，持续1.5h。
电转移
把凝胶取出来，以Marker为根据切下目的条带，然后使用蒸馏水来冲洗条带，剪和PAGE凝胶的大小相同PVDF膜和滤纸，用甲醇浸泡PVDF膜后，和滤纸一起浸泡在电转缓冲液中。按黑色板、纤维垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、纤维垫、白色板的顺序放好，将板夹紧后放进转膜仪里，接好电源。把电转液加足，然后转膜。转膜条件：GAPDH先调为200mA ，时间90min；P-GLUR1电先调节为200mA，120min后转换成300mA，时间15min；GLUR1先调节为200mA，120min后调节为300mA，时间30min。
免疫印迹显色：ECL显色系统
3.5.1封闭
把PVDF膜浸泡在TBST封闭液中，在室温下，摇床中进行2h封闭。磷酸化蛋白则用BSA进行封闭。
一抗
用封闭液稀释相应的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育过夜。抗体稀释浓度如下。
表2-4一抗稀释比例
| 一抗名称 | 稀释比例 |
| GAPDH | 1:1000 |
| P-GLUR1 | 1:1000 |
| GLUR1 | 1:1000 |
3.5.3洗去多余一抗
TBST充分洗涤PVDF膜6次，每次5分钟。每个皿中放3张膜。
二抗
按照1:50000的比例用封闭液稀释相对应的HRP标记二抗，把PVDF膜浸泡在二抗孵育液中，摇床温度调节到37℃，孵育2h。
洗去多余二抗
TBST充分洗涤PVDF膜6次，每次5分钟。
显色曝光
按照1:1的比例把ECL试剂中增强液和稳定的过氧化物酶溶液混匀，把混合好的工作液加到PVDF膜上，等到反应后，荧光带变明显，把多余的液体用滤纸吸收掉，用保鲜膜盖好，将X光胶片进行压片，依次进行影液和定影，最后冲洗胶片。
统计学处理
利用SPSS 16.0软件进行统计学处理，计量资料采用单因素方差分析，结果用平均值±标准差（`X±S）表示，以p<0.05，p<0.01为差异有统计学意义，p>0.05为差异无统计学意义。
实验结果
4.1一般状态
据实验过程中观察，所有的实验大鼠在造模实验之前整体行为状态良好，能够正常进食进水，行为正常，活动自由，毛色呈白色有光泽。在实验研究之后，空白组整体状态没有异常变化；其余大鼠则表现不佳，模型组动物呈现出似惊恐状、毛色光泽消失，进食减少，体重变化增长较为缓慢、形态疲倦不爱自由活动等状态；发酵产物中剂量组和氟西汀组的状态比模型组较好。
发酵产物对大鼠体重的影响
所有大鼠在整体实验进行过程当中，体重在建模前，建模后和给药后都有所增长。但建模程序完成后，模型组动物的体重比空白组动物低（p<0.01），其他几组大鼠的体重比空白组大鼠都呈下降状态；灌胃给药之后，模型组大鼠的体重与空白组的大鼠相比之下体重明显减少（p<0.01），发酵产物高、中、低剂量组、天麻组、蛹虫草组和氟西汀组体重均比模型组动物高，但是发酵产物中剂量组与模型组相对比有统计学上的意义（p<0.01），氟西汀组与模型组相对比也具有统计学上的意义（p<0.05）。见表2-5、图1。
表2-5发酵产物对CUMS模型大鼠体重的影响（单位：g）
| 组别 | 造模前 | 造模后 | 给药后 |
| K组 | 246.92±17.58 | 306.30±8.91<sup>**</sup> | 388.90±22.11<sup>**</sup> |
| M组 | 257.97±37.92 | 204.87±10.57<sup>▲▲</sup> | 273.25±17.52<sup>▲▲</sup> |
| G组 | 240.53±14.87 | 183.37±10.88<sup>▲▲</sup> | 294.52±26.48<sup>▲▲</sup> |
| Z组 | 244.56±11.17 | 197.97±25.97<sup>▲▲</sup> | 329.88±11.60<sup>**▲▲</sup> |
| D组 | 248.47±20.89 | 189.25±13.18<sup>▲▲</sup> | 295.47±14.64<sup>▲▲</sup> |
| F组 | 238.19±16.04<sup>*</sup> | 180.98±11.78<sup>▲▲</sup> | 307.61±19.95<sup>*▲▲</sup> |
| T组 | 225.81±15.45<sup>*▲</sup> | 215.45±36.91<sup>▲▲</sup> | 293.5±22.33<sup>▲▲</sup> |
| Y组 | 234.48±9.50<sup>*</sup> | 236.40±33.86<sup>*▲▲</sup> | 294.97±21.36<sup>▲▲</sup> |
注：与空白组比较▲ p<0.05, ▲▲ p<0.01；与模型组比较* p<0.05，** p<0.01。
发酵产物对大鼠糖水偏好度的影响
从糖水偏好度能够得知实验大鼠有没有快感情绪上的变化，如果饮用蔗糖水的量变少，说明大鼠的快感降低。实验中的实验动物除去空白组外，其他分组的实验大鼠都是单笼单独饲养的，造模给大鼠应激刺激后，模型组动物比较空白组白鼠糖水偏好程度明显有降低了很多（p<0.01），灌胃给药之后，发酵产物中剂量组和氟西汀组的大鼠对糖水的偏好程度明显比模型组动物对糖水的偏好程度提高了很大程度（p<0.01），其他的分组动物对糖水的偏好程度与模型组也高出了不少，但其效果均没有发酵产物中剂量组好。见表2-6、图2。
表2-6发酵产物对CUMS模型的大鼠糖水偏好度的影响
| 组别 | 造模前 | 造模后 | 给药后 |
| K组 | 81.58±7.12 | 88.80±2.58<sup>**</sup> | 91.76±3.04<sup>**</sup> |
| M组 | 85.56±9.37 | 43.25±4.62<sup>▲▲</sup> | 34.42±6.61<sup>▲▲</sup> |
| G组 | 80.77±11.22 | 38.88±7.65<sup>▲▲</sup> | 56.44±3.13<sup>**▲▲</sup> |
| Z组 | 85.64±4.36 | 45.96±7.94<sup>▲▲</sup> | 86.92±3.93<sup>**</sup> |
| D组 | 82.93±10.06 | 42.40±9.06<sup>▲▲</sup> | 68.16±5.18<sup>**▲▲</sup> |
| F组 | 81.40±3.82 | 45.67±4.39<sup>▲▲</sup> | 75.32±3.15<sup>**▲▲</sup> |
| T组 | 80.08±6.24 | 43.13±6.27<sup>▲▲</sup> | 52.92±5.23<sup>**▲▲</sup> |
| Y组 | 81.80±4.04 | 46.67±4.40<sup>▲▲</sup> | 62.24±4.89<sup>**▲▲</sup> |
注：与空白组比较▲▲ p<0.01；与模型组比较** p<0.01。
发酵产物对大鼠开场活动的影响
购买实验动物后，经过一段时间大鼠适应环境后，实验鼠在造模之前会保持着一定量的活动，开场实验用实验鼠的活动情况来研究蛹虫草-天麻发酵产物的抗抑郁作用。经过慢性应激刺激建模后，与空白组大鼠做对比其他经历过刺激的大鼠在水平方向的活动明显降低了很多（p<0.01），在垂直方向活动的次数也明显减少了很多（p<0.01），经过药物服用后，发酵产物中剂量组和氟西汀组与模型组做对比，发酵产物中剂量和氟西汀能够明显增加大鼠的在开场实验中的水平方向的活动和垂直方向活动的次数（p<0.01）；发酵产物高、低剂量组、虫草组和天麻组也能够增加大鼠的在开场实验中的水平方向的活动和垂直方向活动的次数，但这几种的效果没有发酵产物中剂量和氟西汀组优良，提示，中剂量蛹虫草-天麻发酵产物表现为抗抑郁。见表2-7、2-8，图3、图4。
表2-7发酵产物对CUMS模型的大鼠开场水平活动的影响
| 组别 | 造模前 | 造模后 | 给药后 |
| K组 | 81.50±8.18 | 90.17±5.64<sup>**</sup> | 82.83±6.18<sup>**</sup> |
| M组 | 88.30±9.78 | 16.83±13.64<sup>▲▲</sup> | 13.33±7.45<sup>▲▲</sup> |
| G组 | 94.90±9.18<sup>▲</sup> | 15.50±10.75<sup>▲▲</sup> | 35.17±9.87<sup>**▲▲</sup> |
| Z组 | 85.50±12.24 | 21.17±7.41<sup>▲▲</sup> | 69.83±7.76<sup>**▲</sup> |
| D组 | 89.90±7.78 | 13.00±6.87<sup>▲▲</sup> | 60.33±5.75<sup>**▲▲</sup> |
| F组 | 90.80±9.69 | 20.17±18.09<sup>▲▲</sup> | 61.83±5.56<sup>**▲▲</sup> |
| T组 | 90.00±8.56 | 8.67±5.16<sup>▲▲</sup> | 21.50±7.79<sup>▲▲</sup> |
| Y组 | 87.40±10.48 | 15.17±15.47<sup>▲▲</sup> | 45.17±10.26<sup>**▲▲</sup> |
| 组别 | 造模前 | 造模后 | 给药后 |
| K组 | 22.10±6.12 | 24.67±4.80<sup>**</sup> | 22.33±2.94<sup>**</sup> |
| M组 | 22.20±9.14 | 4.83±3.25<sup>▲▲</sup> | 3.67±3.83<sup>▲▲</sup> |
| G组 | 21.30±5.50 | 5.67±4.37<sup>▲▲</sup> | 5.83±5.08<sup>▲▲</sup> |
| Z组 | 22.40±7.14 | 4.67±3.50<sup>▲▲</sup> | 18.83±2.40<sup>**</sup> |
| D组 | 22.70±8.58 | 3.17±3.13<sup>▲▲</sup> | 16.00±2.00<sup>**</sup> |
| F组 | 22.80±6.99 | 7.00±4.05<sup>▲▲</sup> | 17.50±3.08<sup>**</sup> |
| T组 | 21.80±6.14 | 4.33±3.67<sup>▲▲</sup> | 5.33±3.67<sup>▲▲</sup> |
| Y组 | 22.90±6.59 | 4.67±3.67<sup>▲▲</sup> | 8.83±5.49<sup>▲▲</sup> |
注：与空白组比较▲ P<0.05, ▲▲ P<0.01；与模型组比较** P<0.01。
表2-8发酵产物对CUMS模型的大鼠开场垂直活动的影响
4.5发酵产物对大鼠Morris水迷宫活动的影响
对实验大鼠进行为期4d的训练，实验动物对水迷宫中的站台形成了一定的记忆，当实验大鼠处于水迷宫中时，会自觉寻找站台并攀爬上去，凭借此依据，通过记录实验大鼠找到平台并攀爬上去的时间来评估实验动物对空间形式的记忆力，如表2-9，图5所示。经历过慢性应激刺激建模之后，实验动物在行为方面也发生了许多变化，与空白组作比较，模型组、发酵产物高剂量组、发酵产物中剂量组、发酵产物低剂量组、氟西汀组、天麻中剂量组和蛹虫草中剂量组的大鼠寻找到站台的时间明显加长，具备统计学上的意义（p<0.01）；与模型组作比较，处空白组，其他组大鼠找到站台的时间与模型组无统计学上的差异，说明造模较为成功。在给药之后，与模型组作比较，发酵产物中剂量组和氟西汀组实验大鼠找到站台的时间明显少于模型组（p<0.01），说明了在发酵产物为中剂量时，具有抗抑郁作用；与模型组作比较时，发酵产物高剂量、发酵产物低剂量、天麻、蛹虫草也具有抗抑郁作用，但其抗抑郁效果没有发酵产物中剂量的效果好。
表2-9发酵产物对CUMS模型的大鼠水迷宫活动的影响
| 组别 | 造模前 | 造模后 | 给药后 |
| K组 | 31.11±12.38 | 17.86±4.68<sup>**</sup> | 8.82±4.54<sup>**</sup> |
| M组 | 35.82±12.94 | 86.49±9.27<sup>▲▲</sup> | 101.47±5.81<sup>▲▲</sup> |
| G组 | 39.05±14.32 | 86.35±7.69<sup>▲▲</sup> | 67.21±4.85<sup>**▲▲</sup> |
| Z组 | 30.20±12.73 | 93.03±11.27<sup>▲▲</sup> | 25.73±3.33<sup>**▲</sup> |
| D组 | 27.23±12.43 | 84.32±8.46<sup>▲▲</sup> | 51.90±5.76<sup>**▲▲</sup> |
| F组 | 23.16±12.20 | 80.08±5.99<sup>▲▲</sup> | 28.27±6.40<sup>**▲</sup> |
| T组 | 26.74±10.75 | 83.42±8.51<sup>▲▲</sup> | 73.02±5.44<sup>**▲▲</sup> |
| Y组 | 21.52±12.79<sup>*</sup> | 86.08±5.58<sup>▲▲</sup> | 59.38±4.88<sup>**▲▲</sup> |
注：与空白组比较▲▲ p<0.01；与模型组比较** p<0.01。
经过动物行为学实验，结果发现中剂量的发酵产物具有抗抑郁效果。其抗抑郁效果是否与AMPA受体GluA1的表达水平和P-GluA1 Ser845表达量有关，所以用免疫印迹法来检测其表达水平。
发酵产物对模型大鼠前额叶皮层GluA1表达量的影响
如表2-10，图6显示，与模型组做对比，中剂量发酵产物和盐酸氟西汀处理过的大鼠前额叶皮层GluA1的表达量变化无明显差异（p>0.05），发酵产物低剂量和高剂量、天麻以及蛹虫草处理过的CUMS大鼠前额叶皮层GluA1的表达量无明显差异（p>0.05）。
表2-10各组大鼠前额叶皮层GluA1表达水平
| 组别 | K组 | M组 | G组 | Z组 | D组 | F组 | T组 | Y组 |
| GluA1表达水平 | 0.62±0.14 | 0.59±0.15 | 0.55±0.16 | 0.56±0.16 | 0.55±0.14 | 0.54±0.16 | 0.62±0.17 | 0.57±0.20 |
注：与模型组比较** p<0.01。
由表2-11，图7所示，与模型组做对比，中剂量发酵产物和盐酸氟西汀处理过的大鼠海马体GluA1的表达量变化无明显差异（p>0.05），发酵产物低剂量和高剂量、天麻以及蛹虫草处理过的CUMS大鼠海马体GluA1的表达量无明显差异（p>0.05）。
表2-11各组大鼠海马体GluA1表达水平
| 组别 | K组 | M组 | G组 | Z组 | D组 | F组 | T组 | Y组 |
| GluA1表达水平 | 0.54±0.03<sup>*</sup> | 0.47±0.05 | 0.48±0.04 | 0.50±0.03 | 0.50±0.04 | 0.45±0.05 | 0.50±0.05 | 0.50±0.04 |
注：与模型组比较* p<0.05。
发酵产物对大鼠前额叶皮层P-GluA1 Ser845表达量的影响
由表2-12，图8可知，与模型组做对比，中剂量发酵产物和盐酸氟西汀都可以明显提高前额叶皮层P-GluA1 Ser845表达量(p<0.01)，发酵产物低剂量和高剂量、天麻以及蛹虫草也可以提高前额叶皮层P-GluA1 Ser845表达量，但其效果没有中剂量发酵产物好。
表2-12各组大鼠前额叶皮层P-GluA1 Ser845表达量
| 组别 | K组 | M组 | G组 | Z组 | D组 | F组 | T组 | Y组 |
| P-GluA1 Ser845表达量 | 0.47±0.05<sup>**</sup> | 0.12±0.02 | 0.24±0.13 | 0.39±0.05<sup>**</sup> | 0.30±0.07<sup>**</sup> | 0.40±0.04<sup>**</sup> | 0.18±0.09 | 0.28±0.13<sup>*</sup> |
注：与模型组比较** p<0.01，* p<0.05。
发酵产物对大鼠海马体P-GluA1 Ser845表达量的影响
通过表2-13，图9可知，与模型组做对比，中剂量发酵产物和盐酸氟西汀都可以明显提高海马体P-GluA1 Ser845表达水平(p<0.01)，发酵产物低剂量和高剂量、天麻以及蛹虫草也可以提高海马体P-GluA1 Ser845表达量，但其效果没有中剂量发酵产物好。
表2-13各组大鼠海马体P-GluA1 Ser845表达量
| 组别 | K组 | M组 | G组 | Z组 | D组 | F组 | T组 | Y组 |
| P-GluA1 Ser845表达量 | 0.35±0.03<sup>**</sup> | 0.07±0.02 | 0.21±0.10<sup>**</sup> | 0.32±0.02<sup>**</sup> | 0.26±0.01<sup>**</sup> | 0.30±0.02<sup>**</sup> | 0.17±0.09<sup>*</sup> | 0.26±0.10<sup>**</sup> |
注：与模型组比较** p<0.01，* p<0.05。
实验结论
（1）蛹虫草发酵天麻获得的发酵产物水提物具有显著抗抑郁作用，且提取物的中剂量抗抑郁效果最好。
（2）发酵产物可以通过提高CUMS模型大鼠前额叶皮层与海马体P-GluA1 Ser845表达量，来实现其抗抑郁作用。
本发明的实施方式不限于上述实施例，在不脱离本发明宗旨的前提下做出的各种变化均属于本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种抗抑郁的天麻发酵提取物，此提取物是蛹虫草发酵天麻后的产物经水提制备而成，其发酵菌种为蛹虫草；蛹虫草属于粪壳菌纲、肉座菌目、虫草菌科、虫草属，菌株为B1528，菌株保藏号为：CCTCC M 2019789，于2019年10月9日在中国典型培养物保藏中心保藏。
2.一种如权利要求1所述的抗抑郁的天麻发酵提取物制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
（1）发酵培养基制备：取土豆200g，煮汁去渣后加入可溶性淀粉20g、蛋白胨1g、天麻40g，水定容至1000mL，依此比例进行配置，装入500mL三角瓶，每瓶200ml，121℃灭菌30min后冷却备用；
（2）发酵培养条件：在摇床上，温度25℃，200r/min条件下培养12天，得发酵产物；
（3）发酵产物提取制备：取全部发酵产物，加入等量的水，煮开后接着煮30min，过滤后，再加入水煮30min，按以上步骤循环操作总共提取3次，将获得的滤液减压浓缩成固体物质，即得天麻发酵提取物。
3.天麻发酵提取物在制备治疗抗抑郁药物中的应用。
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2019
- 2019-11-29 CN CN201911207587.2A patent/CN110974908A/zh active Pending
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