CN104489692A - 一种含天然来源白藜芦醇的保健食品及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含天然来源白藜芦醇的保健食品及其制备方法。所述的含天然来源白藜芦醇的保健食品，包括以下重量份的各组分：含白藜芦醇的葡萄皮提取物100～300份、微晶纤维素100～400份、二氧化硅4～6份。经验证，本发明的含天然来源白藜芦醇的保健食品具有增强免疫力的功能。

Description

一种含天然来源白藜芦醇的保健食品及其制备方法

技术领域

本发明涉及保健食品，尤其涉及一种含天然来源白藜芦醇的保健食品及其制备方法。

背景技术

早在2000多年前，中国的古籍里就有记载“正气内存，邪不可干，邪之所凑，其气必虚”，表明，当人体内存在较强的免疫力，免疫系统能正常运作时，疾病就不可能侵入身体，机体就不会生病，而疾病能入侵身体，其免疫力肯定虚弱。现代医学专家指出：世界上最好的医生，不是别人，而是我们自身的免疫系统。免疫学专家认为，医学实践也充分证明：人类99％以上的疾病均与免疫系统的失调有关。因此，提高我们免疫系统功能，是抵抗和预防各种疾病的最有效的方法和措施。

处于亚健康状态者，免疫力低下，容易生病。世界卫生组织(WHO)的一项全球性调查研究表明，目前约有75％的人处于亚健康状态，20％的人患有疾病，而真正健康的人仅占5％，尤其是那些工作繁重压力大的在职人群和面临中考、高考的学生，亚健康状态则更加严重。根据中国保健科技学会国际传统保健医药研究会对全国百万人口以上的16个省、直辖市的调查发现，平均亚健康率高达64％，以上的调查表明，市场上急需增强免疫力功能的保健食品。

白藜芦醇广泛存在于葡萄的不同部位，尤其在葡萄皮中的含量最高。白藜芦醇(Res)，化学名称为3，4’，5—三羟基芪，是一类主要存在于葡萄、虎杖、藜芦等植物中的多酚类化合物。在葡萄中发现白藜芦醇作为植物抗毒素存在，它是植物体在受到生物或非生物胁迫(如真菌感染、紫外照射等)时分泌的一种植物抗毒素，被称为“植物杀菌素”。

发明内容

本发明针对现有技术当中的不足，提供一种能够增强免疫力的天然来源的含白藜芦醇的保健食品及其制备方法。

本发明的含天然来源白藜芦醇的保健食品，包括以下重量份的各组分：

含白藜芦醇的葡萄皮提取物100～300份、

微晶纤维素100～400份、

二氧化硅4～6份。

优选的，所述的含天然来源白藜芦醇的保健食品，包括以下重量份的各组分：

含白藜芦醇的葡萄皮提取物150份、

微晶纤维素345份、

二氧化硅5份。

优选的，所述含白藜芦醇的葡萄皮提取物为按质量计含白藜芦醇5％的葡萄皮提取物。

本发明还提供了一种含天然来源白藜芦醇的保健食品的制备方法，包括以下步骤：

S10、过筛：将含白藜芦醇的葡萄皮提取物、微晶纤维素、二氧化硅分别过筛，得各原辅料细粉，备用；

S20、混合：按配比将含白藜芦醇的葡萄皮提取物细粉、微晶纤维素细粉混合均匀，得混合粉A、将混合粉A按配比与二氧化硅细粉混合均匀，得总混合粉；

S30、填充：将总混合粉用胶囊灌装机填充胶囊；

S40、抛光、筛选：用胶囊抛光机清除粘附在胶囊表面的细粉，筛选弃去不合格品。

本发明的含天然来源白藜芦醇的保健食品服用方法为：每日1次，每次2粒或每日2次，每次1粒，每粒0.5g。

经试验验证，本发明的含天然来源白藜芦醇的保健食品具有增强免疫力的功能。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步阐述。

实施例1

本实施例的含天然来源白藜芦醇的保健食品配方为：

含白藜芦醇的葡萄皮提取物150份、

微晶纤维素345份、

二氧化硅5份。

本实施例的含天然来源白藜芦醇的保健食品按照以下步骤制备：

S10、过筛：将含白藜芦醇的葡萄皮提取物、微晶纤维素、二氧化硅分别过筛，得各原辅料细粉，备用；

S20、混合：按配比将含白藜芦醇的葡萄皮提取物细粉、微晶纤维素细粉混合均匀，得混合粉A、将混合粉A按配比与二氧化硅细粉混合均匀，得总混合粉；

S30、填充：将总混合粉用胶囊灌装机填充胶囊；

S40、抛光、筛选：用胶囊抛光机清除粘附在胶囊表面的细粉，筛选弃去不合格品。

实施例2

本实施例的含天然来源白藜芦醇的保健食品配方为：

含白藜芦醇的葡萄皮提取物100份、

微晶纤维素400份、

二氧化硅4份。

本实施例的含天然来源白藜芦醇的保健食品制备方法同实施例1。

实施例3

本实施例的含天然来源白藜芦醇的保健食品配方为：

含白藜芦醇的葡萄皮提取物300份、

微晶纤维素100份、

二氧化硅6份。

本实施例的含天然来源白藜芦醇的保健食品制备方法同实施例1。

实施例1～3中所用含白藜芦醇的葡萄皮提取物，购于天津市尖峰天然产物研究开发有限公司，按质量计含有5％的白藜芦醇，由葡萄皮经乙醇提取制得，本发明中所述的天然来源指白藜芦醇由葡萄皮提取而得，不是人工合成的。

含天然来源白藜芦醇的保健食品增强免疫力功能实验报告

1材料和方法

1.1样品：本发明实施例1的含天然来源白藜芦醇的保健食品，规格：0.5g/粒，置阴凉干燥处保存。人口服推荐用量为每人(成人)每日2次，每次1粒，成人体重按60kg计算，折合剂量为16.7mg/kg BW。

1.2实验动物与分组：SPF级健康昆明种雄性小鼠240只，体重为18～22克，由广东省医学实验动物中心繁殖，实验动物生产许可证号；SCXK(粤)2008-0002，实验动物质量合格证号：0081570。每40只小鼠为一组，共6组。免疫I组，进行ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验；免疫II组，进行迟发型变态反应实验；免疫Ⅲ组，迸行脏/体比值测定，血清溶血素测定和抗体生成细胞数测定；免疫IV～VI组，分别进行碳廓清实验、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验和NK细胞活性测定。

1.3实验动物房环境条件：实验动物使用许可证号：SYXK(桂)2007-0003。实验动物室温度：22～25℃，相对湿度：55～70％。

1.4剂量选择与受试物给予方式：根据人口服推荐用量，设样品低、中、高剂量组分别为83.5、167.0、334.0mg/kg BW(分别相当于人体推荐用量的5、10、20倍)，设一个阴性对照组，每组10只动物。分别称取样品417.5、835.0、1670.0mg，各加纯水至100ml，混匀、配成4.175、8.350、16.700mg/mL浓度溶液，按0.2mL/10g BW的体积给予相应剂量组动物灌胃，阴性对照组予以等体积的纯水，每天灌胃一次，连续灌胃30天。

1.5主要仪器与试剂：动物台秤、电子分析天平、离心机、洁净工作台、二氧化碳培养箱、恒温水浴箱、显微镜、半自动生化分析仪、酶标仪等。

无菌手术器械、微量注射器、细胞计数器、24孔和96孔平底细胞培养板、96孔U型细胞培养板、玻璃平皿、纱布、载玻片、试管、200目筛网、计时器、血色素吸管等。

RPMI1640培养液、小牛血清、2-ME、青霉素、链霉素、ConA、1mol/L的HCL溶液、异丙醇、MTT、Hank’s液(pH 7.2～7.4)、PBS缓冲液(Ph7.2～7.4)、台酚蓝、DNFB、丙酮、硫化钡、补体(豚鼠血清)、SA缓冲液、琼脂糖、绵羊红细胞(SRBC)、生理盐水、印度墨汁、0.1％的碳酸钠、鸡红细胞、甲醇、Gimsa染液、YAC-1细胞、乳酸锂、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸盐、氧化型辅酶Ⅰ、0.2mol/L的Tris-HCL缓冲液、1％冰醋酸、1％的NP40等。

1.6实验方法

1.6.1脏器/体重比值测定：称重后处死小鼠，取出胸腺和脾脏，在电子分析天平上称重，计算脏/体比值。

1.6.2 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验(MTT法)

无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的平皿中，制成细胞悬液，经200目筛网过滤。用Hank’s液洗2次，每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于1mL完全培养液中，计数活细胞数，用RPMI1640培养液调整细胞浓度为3×10⁶个/mL。再将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，在其中一孔加75μL ConA液(相当于7.5μg/mL)，另一孔作为对照，置5％CO₂，37℃二氧化碳孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI 1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙酮，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔作3个平行孔，用酶标仪，以570nm波长测定光密度值。淋巴细胞的增殖能力用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值表示。

1.6.3二硝基氟苯诱导的小鼠DTH实验(耳肿胀法)

实验结束前5天用硫化钡将小鼠腹部皮肤脱毛约3cm×3cm范围，用50μLDNFB溶液均匀涂抹致敏，5天后将10μL DNFB均匀涂抹于小鼠右耳两面进行攻击，24小时后颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳，用打孔器取下8mm直径的耳片、称重，以左右耳重量之差值表示DTH的程度。

1.6.4抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)

取脱纤维的羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心10min(2000r/min)，用生理盐水将压积SRBC配成2％(v/v)的细胞悬液，每鼠腹腔注射0.2mL。将免疫后5天的小鼠处死，取脾脏置盛有Hank’s液的平皿内，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心10min(2000r/min)，用Hank’s液洗绦2遍，最后将细胞悬浮在8mL Hank’s液中。将表层培养基(1g琼脂糖加双蒸水至100mL)加热溶解后，放45-50℃水浴保温，与等量Ph7.2-7.4、2倍浓度的Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加入50μL10％SRBC(v/v，用SA缓冲液配制)、25μL脾细胞悬液，迅速混勻后倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片平扣放在玻片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1.5h，用SA缓冲液稀释的补体(1：8)加入玻片架凹槽内，继续孵育1.5h，计数溶血空斑数。用空斑数/10⁶脾细胞表示抗体生成细胞数。

1.6.5血清溶血素的测定(血凝法)

取脱纤维的羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心10min(2000r/min)，用生理盐水将压积SRBC配成2％(v/v)的细胞悬液，每鼠腹腔注射0.2mL。免疫5天后，摘除小鼠的眼球，取血于离心管内，放置约1h，2000r/min离心10min，分离、收集血清。用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝板内，每孔100μL，再加入100μL 0.5％(v/v)的SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度。按下式计算抗体积数_：

抗体积数＝(S₁+2S₂+3S₃……nS_n)

式中1、2、3……为对倍稀释的指数，S为凝集程度的级别。

1.6.6小鼠碳廓清实验

经尾静脉给小鼠注射用生理盐水稀释4倍的印度墨汁，每10g体重注射0.1mL，墨汁注入后立即计时，于注入墨汁后第2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μL，加入到2mL 0.1％Na₂C0₃溶液中，摇匀。以Na₂C0₃溶液作空白对照，以600nm皿波长测光密度值(OD)。将小鼠处死，取肝、脾脏，称重。按下式计算吞噬指数a。

a＝K^1/3×体重/(肝重+脾重)   式中K＝(lgOD₁-lgOD₂)/(t₂-t₁)

1.6.7小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验(半体内法)

给小鼠腹腔注射20％(v/v，用生理盐水配置)的压积鸡红细胞悬液，每鼠1mL，间隔30min，颈椎脱臼处死小鼠，正中切开腹壁皮肤，腹腔注入2mL生理盐水，转动鼠板1min，吸出腹腔洗液1mL，平均滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，置37℃孵箱温育30min。孵毕，取岀玻片于生理盐水中漂洗后晾干，用甲醇:丙酮(1:1)溶液固定，4％(v/v)Giemsa-磷酸缓冲液染色，再用纯水漂洗、晾干。油镜下每片计数100个巨噬细胞，按下式计算吞噬率和吞噬指数。

吞噬率(％)＝吞噬鸡红綑胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100

吞噬指数＝被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数

1.6.8 NK细胞活性测定(LDH测定法)

将小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，制成脾细胞悬液，用Hank’s液洗2次，每次离心10min(1000r/min)。弃上清，将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌纯水20秒，裂解红细胞后再加入0.5mL2倍Hank’s液及8mL Hank’s液，1000r/min离心10min用1mL含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，用1％冰醋酸稀释后计数(活细胞数应在95％以上)，用台酚兰染色计数活细胞数，最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×10⁷个/mL，此为效应细胞。取传代后24h生长良好的YAC-1细胞，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×10⁵个/mL，此为靶细胞。取靶细胞和效应细胞各100μL(效靶比50:1)，加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40各100μL。上述各项各设3个平行孔，置5％C0₂、37℃二氧化碳孵箱中培养4h。然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，反应8分钟，每孔加入1mol/L的HCL30μL，在酶标仪490nm处测定光密度(OD)值。按下式计算NK细胞活性。

NK细胞活性(％)＝(反应孔OD－自然释放孔OD)/(最大释放孔OD－自然释放孔OD)×100％

1.7实验数据统计：应用SPSS统计软件进行方差分析统计处理。

1.8结果判定：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细跑活性四方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有增强免疫力功能作用。

2结果

2.1样品对小鼠体重的影响

表1本发明的保健食品增强免疫力功能试验小鼠体重

注：各剂量组小鼠的初始、中期和末期体重及增重与阴性对照组比较，差异均无显著性(P>0.05)。

表2本发明的保健食品增强免疫力功能实验小鼠体重

注：免疫II～VI组各剂量组小鼠的初始、中期和末期体重及增重与阴性对照组比较，差异均无显著'性(P>0.05)。

由表1、表2可见，实验初、实验中期、实验末期样品各剂量组的小鼠的体重及实验期间小鼠体重的增长与阴性对照组间比较，差异均无显著性(P>0.05)，表明该样品对小鼠的体重增长无显著影响。

2.2样品对小鼠免疫器官脏器/体重比值的影响

表3本发明的保健食品增强免疫力功能试验小鼠的免疫器官脏器/体重比值

由表3可见，经口给予小鼠不同剂量的本发明富含白藜芦醇的保健食品30天，小鼠的胸腺/体重及脾脏/体重比值与阴性对照组比较，均无显著性差异(P>0.05),表明该样品对小鼠的免疫器官重量无明显影响。

2.3样品对小鼠的细胞免疫的影响

2.3.1样品对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力的影响

表4本发明的保健食品小鼠脾淋巴细胞转化实验结果

从表4可见，样品各剂量组的淋巴细胞转化能力均高于阴性对照组，且高剂量组与阴性对照组的差异具有显著性(P<0.05)，表明该样品具有促进小鼠的淋巴细胞增殖、转化能力的作用。

2.3.2样品对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响

表5本发明的保健食品的小鼠迟发型变态反应(DTH)实验结果

从表5可见，样品各剂量组的左右耳片重量差值均高于阴性对照组，且高、中剂量组与阴性对照组的差异具有非常显著性(P<0.01)，表明该样品具有促进小鼠的迟发型变态反应的作用。

2.4样品对小鼠的体液免疫的影响

2.4.1样品对小鼠的抗体生成细胞数的影晌

从表6可见，样品各剂量组的抗体生成细胞数均高于阴性对照组，且高剂量组与对照组的差异具有显著性(P<0.05)，表明该样品具有促进小鼠的抗体生成细胞增殖的作用。

表6本发明的保健食品的抗体生成细胞检测实验结果

2.4.2样品对小鼠血清溶血素的影响

从表7可见，样品各剂量组的抗体积数均高于阴性对照组，其中的高剂量组与阴性对照组的差异具有显著性(P<0.05)，表明该样品具有提高小鼠的血清溶血素水平的作用。

表7本发明的保健食品的小鼠溶血素测定结果

2.5样品对小鼠的单核-巨噬细胞吞噬功能的影响

2.5.1样品对小鼠的单核-巨噬细胞碳廓清的影响

表8本发明的保健食品的小鼠单核-巨噬细胞碳廓清实验结果

从表8可见，样品各剂量组的小鼠的吞噬指数均高于阴性对照组，且高、中剂量组与阴性对照组的差异具有显著性(分别P<0.05和P<0.01)，表明该样品具有促进小鼠的单核-巨噬细胞碳廓清功能的作用。

2.5.2样品对小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响

表9本发明的保健食品的小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验结果

从表9可见，样品各剂量组小鼠的腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬率及吞噬指数均高于阴性对照组，但各剂量组与阴性对照组比较，差异均无显著性(P>0.05)，表明该样品对小鼠的腹腔巨噬细胞的吞噬功能无明显的促进作用。

2.6样品对小鼠的NK细胞活性的影响

表10本发明的保健食品的小鼠NK细胞活性测定结果

从表10可见，样品各剂量组小鼠的NK细胞活性与阴性对照组接近，各剂量组与阴性对照组的差异均无显著性(P>0.05)，表明该样品对小鼠的NK细胞活性无明显的影响作用。

3小结

经口给予小鼠334.0、167.0、83.5mg/kg BW(相当于人体推荐用量20、10、5倍)剂量的含天然来源白藜芦醇的保健食品30天，能促进小鼠的脾淋巴细胞增殖、转化作用，促进小鼠的迟发型变态反应的作用，促进小鼠的抗体生成细胞增殖，提高小鼠的血清溶血素水平，促迸小鼠的单核-巨噬细胞碳廓清功能，对小鼠的体重增长、胸腺/体重比值、脾脏/体重比值、腹腔巨噬细胞吞噬功能及NK细胞活性无明显影响，表明本发明的含天然来源白藜芦醇的保健食品具有增强免疫力的功能。

以上实施例的先后顺序仅为便于描述，不代表实施例的优劣。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (4)

1.一种含天然来源白藜芦醇的保健食品，其特征在于，包括以下重量份的各组分：

含白藜芦醇的葡萄皮提取物 100～300份、

微晶纤维素 100～400份、

二氧化硅 4～6份。

2.根据权利要求1所述的含天然来源白藜芦醇的保健食品，其特征在于，包括以下重量份的各组分：

含白藜芦醇的葡萄皮提取物 150份、

微晶纤维素 345份、

二氧化硅 5份。

3.根据权利要求1或2所述的含天然来源白藜芦醇的保健食品，其特征在于，所述含白藜芦醇的葡萄皮提取物为按质量计含白藜芦醇5％的葡萄皮提取物。

4.一种权利要求1－3任一项所述的含天然来源白藜芦醇的保健食品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S10、过筛：将含白藜芦醇的葡萄皮提取物、微晶纤维素、二氧化硅分别过筛，得各原辅料细粉，备用；

S20、混合：按配比将含白藜芦醇的葡萄皮提取物细粉、微晶纤维素细粉混合均匀，得混合粉A、将混合粉A按配比与二氧化硅细粉混合均匀，得总混合粉；

S30、填充：将总混合粉用胶囊灌装机填充胶囊；

S40、抛光、筛选：用胶囊抛光机清除粘附在胶囊表面的细粉，筛选弃去不合格品。