发明内容
发明目的:本发明的目的在于针对现有技术不足,提供一种增强人体免疫力的保健食品。
本发明的另一目的在于提供上述保健食品的制备方法。
技术方案:本发明所述的一种增强人体免疫力的保健食品,包括以下重量百分比的组分:0~35%的姬松茸提取物,15~30%的灰树花提取物,5~20%的红景天提取物,35~50%的淀粉,0~1%的硬脂酸镁。
其中,所述姬松茸提取物是由姬松茸经水提取,将提取液浓缩,取浓缩液醇沉,将醇沉物干燥,粉碎,过筛而得到。
其中,所述灰树花提取物是由灰树花经水提取,将提取液浓缩,取浓缩液醇沉,将醇沉物干燥,粉碎,过筛而得到。
其中,所述红景天提取物是由红景天经粉碎,70%乙醇回流提取,将提取液浓缩,干燥,粉碎,过筛而得到。
制备上述保健食品的方法,包括以下步骤:
(1)取姬松茸提取物、灰树花提取物、红景天提取物、淀粉和硬脂酸镁分别过筛;
(2)将过筛后的姬松茸提取物、灰树花提取物、红景天提取物、淀粉和硬脂酸镁混合;
(3)将混合后的混合物料装入胶囊,每粒0.35g。
其中,步骤(1)优先选用60目筛。
其中,步骤(2)的混合时间以30min为最佳。
姬松茸为蘑菇科姬松茸的干燥子实体,为可用于保健食品的普通食品。其功效成分为姬松茸多糖,姬松茸多糖可以减弱四氯化碳的毒性,并保护枯否细胞Fc受体,提高枯否细胞免疫活性。同时,能对抗肿瘤细胞扩散,具有提高机体的免疫功能。
灰树花为多孔菌科灰树花的干燥子实体,为可用于保健食品的普通食品。其有效成分为灰树花多糖,灰树花多糖可以提高小鼠的足跖胀度、抗体细胞生成数,具有很好的免疫调节作用。
红景天为景天科植物大花红景天Rhodiola crenulata(Hook.f.etThoms.)H.Ohba的干燥根及根茎,为可用于保健食品的物品。红景天是我国传统的药用植物,从《神农本草》、《本草纲目》到现在的《现代实用草本》,都有记载。红景天有调节免疫等特殊功效,同时对小鼠细胞及体液免疫功能都有增强作用。
有益效果:本发明选用红景天提取物、姬松茸提取物、松花粉提取物为原料,制成胶囊剂,方便服用。几味原料联用,共同起到调节人体免疫力的功能。同时,由于采用非化学类原料,无任何毒副作用,适合各年龄段人群。
具体实施方式
实施例1:
将20%的姬松茸提取物(单位为重量百分比,下同)、27.5%的灰树花提取物、11.5%的红景天提取物、40.5%的淀粉和0.5%的硬脂酸镁分别过60目筛,取过筛后的姬松茸提取物、灰树花提取物、红景天提取物、淀粉和硬脂酸镁混合30min,将混合后的混合物料装入胶囊,每粒0.35g。
实施例2:
将22.5%的姬松茸提取物、25%的灰树花提取物、7.5%的红景天提取物、44.5%的淀粉和0.5%的硬脂酸镁分别过60目筛,取过筛后的姬松茸提取物、灰树花提取物、红景天提取物、淀粉和硬脂酸镁混合30min,将混合后的混合物料装入胶囊,每粒0.35g。
实施例3:
将25.5%的姬松茸提取物、22%的灰树花提取物、10.5%的红景天提取物、41.5%的淀粉和0.5%的硬脂酸镁分别过60目筛,取过筛后的姬松茸提取物、灰树花提取物、红景天提取物、淀粉和硬脂酸镁混合30min,将混合后的混合物料装入胶囊,每粒0.35g。
实施例4:
将29.5%的姬松茸提取物、18%的灰树花提取物、18.5%的红景天提取物、35.5%的淀粉和0.5%的硬脂酸镁分别过60目筛,取过筛后的姬松茸提取物、灰树花提取物、红景天提取物、淀粉和硬脂酸镁混合30min,将混合后的混合物料装入胶囊,每粒0.35g。
实施例5:
将35%的姬松茸提取物、15.5%的灰树花提取物、9.5%的红景天提取物、39.5%的淀粉和0.5%的硬脂酸镁分别过60目筛,取过筛后的姬松茸提取物、灰树花提取物、红景天提取物、淀粉和硬脂酸镁混合30min,将混合后的混合物料装入胶囊,每粒0.35g。
实施例6:
本发明对增强人体免疫力功能的研究
1.材料
1.1样品
由无锡市天赐康生物科技有限公司提供。人体推荐量为每日2次,每次4粒,成人体重按60kg计算,折合剂量0.0467g/kg.bw。
1.2实验动物
SPF级昆明种雌性小鼠200只,体重为18~22g,由河南省实验动物中心提供,实验动物生产许可证号SCXK(豫)2005-0001。饲料由长沙市开福区东创实验动物科技服务部提供,生产许可证号为SCXK(湘)2006-0001。实验条件为屏障环境,温度22~24℃,湿度52~54%。每40只分为1组,共5组。免疫I组,进行碳廓清实验;免疫II组,进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验;免疫III组,进行迟发型变态反应实验;免疫IV组,进行半数溶血值(HC50)和抗体生成细胞数的测定;免疫V组,进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验、NK细胞的活性测定。每大组随机分为对照组、低、中、高剂量组,每组10只小鼠。
1.3主要仪器与试剂
动物台秤、分析天平、洁净工作台、二氧化碳培养箱、离心机、722分光光度计、恒温水浴箱、酶标仪、显微镜、无菌手术器械、游标卡尺、微量注射器、细胞计数器、24孔和96孔平底细胞培养板、96孔U型细胞培养板、玻璃平皿、纱布、试管、玻片架、200目筛网、计时器、血色素吸管、载玻片。以上实验仪器由湖南省疾病预防控制中心提供。
绵羊红细胞(SRBC)、生理盐水、Hank’s液(pH7.2~7.4)、RPMI1640培养液、小牛血清、清链霉素、ConA(伴刀豆球蛋白)、1mol/L的HCL溶液,酸性异丙醇(96mL异丙醇加1mol/L的HCL溶液4mL)、MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)、PBS缓冲液(pH7.2-7.4),SA缓冲液、琼脂糖、都氏试剂、YAC-1细胞、乳酸钠、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸盐、氧化型辅酶I、0.2mol/L的Tris-HCL缓冲液、2.5%Triton(聚乙二醇辛基苯基醚)、印度墨汁、0.1%的碳酸钠、鸡红细胞、甲醇、Giemsa染液。以上试剂由湖南省疾病预防控制中心提供。
2.实验方法
2.1剂量选择与受试物给予方式
据人体口服推荐量,设本发明低、中、高剂量组分别为0.233g/kb.Bw、0.467g/kb.Bw、1.400g/kb.Bw(分别相当于人体推荐剂量的5、10、30倍)。分别取样品2.33g、4.67g、14.00g加蒸馏水定容至200ml,分别给予受试小鼠灌胃,每天灌胃一次,灌胃体积为0.2ml/10g.bw,对照组予以等体积的溶剂,连续30天。
2.2实验步骤
2.2.1小鼠碳廓清实验
小鼠尾静脉注射以生理盐水稀释4倍的印度墨汁,每10g体重注射0.1ml,墨汁注入后立即计时,于注入墨汁后第2、10min,分别从内眦静脉丛取血20μl,加入到2mlNa2CO3溶液中,摇匀。以Na2CO3溶液作空白对照,用722型分光光度计在600nm波长处比色测光密度值(OD)。将小鼠处死,取肝、脾称重,计算吞噬指数a。
2.2.2小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)
小鼠腹腔注射20%(v/v,用生理盐水配制)的鸡红细胞(2000rpm,10min)悬液1mL,间隔30min,颈椎脱臼处死,仰位固定于鼠板上,正中剪开腹壁皮肤,经腹腔注入生理盐水2ml,转动鼠板1分钟。取腹腔巨噬细胞洗液1mL,滴于载玻片上,放入垫有湿纱布的搪瓷盒内,置37℃孵箱温育30min。孵毕,于生理盐水中漂洗以除去未贴片细胞。晾干,以甲醇∶丙酮(1∶1)固定,4%(v/v)Giemsa-磷酸缓冲液染色,用蒸馏水漂洗晾干。油镜下每片计数100个巨噬细胞,按下式计算吞噬率和吞噬指数:吞噬率%=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100,吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数。
2.2.3迟发型变态反应(DTH)(足跖增厚法)
小鼠腹腔注射2%(v/v)SRBC(0.2ml/每鼠)致敏4天后,测量左后足跖厚度,然后再测量部位皮下注射20%(v/v)SRBC(20μl/每鼠),于注射后24h测量左后足跖厚度,同一位测量三次,取平均值,以攻击前后足跖厚度差值(足跖肿胀度)来表示DTH的程度。
2.2.4ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化试验(MTT法)
无菌取脾,置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中,制成细胞悬液,经200目筛网过滤。用Hanks液洗2次,每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于1mL完全培养液中,计数活细胞数,用RPMI1640培养液调整细胞浓度为3×106个/ml。再将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中,每孔1ml,一孔加75μlConA液,另一孔作对照,置5%CO2孵箱37℃培养72h。培养结束前4h,每孔轻轻吸去上清液0.7ml加入0.7ml不含小牛血清的RPMI1640培养液,同时加入MTT(5mg/ml)50μL/孔继续培养4h,培养结束后,每孔加入1ml酸性异丙醇,吹打混匀,使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中,每个孔作3个平行孔,用酶标仪,以570nm波长测定光密度值。淋巴细胞的增殖能力用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值表示。
2.2.5抗体生成细胞检测(Jernr改良玻片法)
取羊血用生理盐水洗涤3次,每次离心2000rpm10min,将压积SRBC用生理盐水配成2%(v/v)细胞悬液,每鼠腹腔注射0.2ml。将免疫后5天的小鼠处死,取脾,磨碎,用Hanks液制成细胞悬液,200目筛网过滤,洗涤、离心2次,最后将细胞悬浮在8mlHanks液中。计数细胞,并将细胞浓度调整为5×106个/mL。将表层培养基加热溶解后与等量的PH7.4、2倍浓度的Hanks液混合,分装小试管,每管0.5ml,再向管内加入用SA液配制的10%SRBC50μl(v/v)、20μl脾细胞悬液(5×106个/mL),迅速混匀后倾倒于已刷薄层琼脂糖的玻片上,待琼脂糖凝固后将玻片平扣放在玻片架上,放入二氧化碳培养箱中温育1.5h,将用SA液稀释的补体(1∶8)加入到玻片凹槽内继续温育1.5h后计数溶血空斑数。
2.2.6半数溶血值(HC50)的测定
取羊血,用生理盐水洗涤3次,每只鼠经腹腔注射2%(v/v,用生理盐水配制)SRBC0.2mL进行免疫。5天后,摘除眼球取血于离心管内,放置1h,剥离,2000r/min离心10min,收集血清。用SA缓冲液将血清稀释为200倍,去1mL置管内,依次加入10%(v/v,用SA缓冲液配制)SRBC0.5mL,补体1mL(用SA缓冲液按1∶8稀释)。另设不加血清的对照管(以SA缓冲液代替)。置37℃恒温水浴中保温30min后,冰浴终止反应。2000r/min离心10min,取上清液1mL加都氏试剂3mL。同时取10%(v/v,用SA缓冲液配制)SRBC0.25mL,加都氏试剂至4mL于另一管中,充分混匀,放置10min后,于540nm处以对照管作空白,分别测定各管光密度值。溶血素的量以半数溶血值(HC50)表示,按下式计算:半数溶血值(HC50)=样品光密度值/SRBC半数溶血时的光密度值×稀释倍数。
2.2.7NK细胞活性测定(乳酸脱氢酶LDH测定法)
颈椎脱臼处死动物,取出脾脏,制成脾细胞悬浮液,用Hank’s液洗2次,每次离心10min(1000r/min),弃上清将细胞浆弹起,加入0.5ml灭菌水20秒,裂解红细胞后再加入0.5ml2倍Hanks液及8mlHanks液,1000rpm离心10min,用1mL含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬,用台酚兰染色计数(活细胞应在95%以上),调整细胞浓度为2×107个/ml此为效应细胞,取传代后24h生长良好的YAC-1细胞用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/ml此为靶细胞;取靶细胞和效应细胞各100μl(效靶比50∶1),加入U型96孔培养板中;靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl,靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5%Triton各100μl;上述各项均设3个平行孔,于37℃,5%CO2培养箱培养4小时,取出1500r/min离心5min。将各孔上清液100μl置平底96孔培养板中,同时加入LDH基质液100μl,根据室温反应3-10min,每孔加入1mol/L的HCL30μl,在酶标仪490nm处测定光密度(OD)。NK细胞活性=[(反应孔OD-自然释放孔OD)/(最大释放孔OD-自然释放孔OD)]×100%
3.实验数据统计
用Spss11.0软件进行统计分析。
4.结果
4.1本发明对小鼠体重的影响
由表1-5可见,各剂量组实验初、实验中期、实验末小鼠体重及实验期间小鼠体重增长对照组比较,差异无显著性(P>0.05),说明本发明对小鼠体重无影响。
4.2本发明对小鼠单核-巨噬细胞吞噬碳廓清功能的影响
由表6可见,经口给予本发明受试物30天后,各剂量组小鼠单核-巨噬细胞碳廓清能力与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。
4.3本发明对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响
表8本发明对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬指数的影响
由表7、8可见,经口给予本发明受试物30天后,各剂量组小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力未见明显影响,与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。
4.3本发明对小鼠细胞免疫的影响
由表9可见,经口给予本发明受试物30天后,中、高剂量组小鼠的足跖肿胀度大于照组,差异有显著性(P<0.05或P<0.01)。
表10本发明对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化试验的影响
由表10可见,经口给予本发明受试物30天后,各剂量组小鼠的淋巴细胞转化能力与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。
4.4本发明对小鼠体液免疫的影响
由表11可见,经口给予本发明受试物30天后,高剂量能增加小鼠抗体生成数,与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。
由表12可见,经口给予本发明受试物30天后,高剂量能增加小鼠半数溶血值,与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。
4.5本发明对小鼠NK细胞活性的影响
由表13可见,经口给予本发明受试物30天后,中、高剂量组能增加小鼠NK细胞活性,与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。
5.总结
本实验室条件下,经口给予小鼠0.233g/kg.Bw、0.467g/kg.Bw、1.400g/kg.Bw剂量的本发明受试物30天,1.400g/kg.Bw剂量能增加抗体生成细胞数、小鼠血清半数溶血值,与对照组比较差异有显著性(P<0.05);0.467g/kg.Bw、1.400g/kg.Bw剂量能增加小鼠迟发型变态反应能力、NK细胞活性,与对照组比较差异有显著性(P<0.05或P<0.01);对小鼠体重增长、小鼠淋巴细胞转化能力、小鼠单核-巨噬细胞碳廓清能力、巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力无明显影响(P>0.05)。依据《保健食品检验与评价技术规范》2003年版可以判定,本发明具有提高免疫力的功能。