CN102028932A - 乳清蛋白肽在制备增强免疫力药物、保健食品中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种乳清蛋白肽产品及其在制备增强免疫力药物、保健食品或食品中的用途。本乳清蛋白肽是乳清蛋白为原料经酶法降解生产的，分子量集中在180-1000范围内的小分子生物活性肽的混合物。经实验证实，本乳清蛋白肽产品对ConA诱导的小鼠淋巴细胞增殖能力、迟发型变态反应(DTH)程度、抗体生成细胞功能(IgM-PFC)以及小鼠NK细胞活性均有显著提高，具有增强免疫力作用。

Description

乳清蛋白肽在制备增强免疫力药物、保健食品中的用途

技术领域

本发明涉及一种乳清蛋白肽产品及其新用途，具体来说是以乳清蛋白为原料经酶法降解生产的分子量集中在180-1000范围内的小分子生物活性肽的混合物在制备增强免疫力药物、保健食品中的用途。属医药、食品保健领域。

背景技术

近年来，免疫功能低下，包括原发性及继发性免疫功能缺陷、缺乏或受损，受到国内外医学家们的广泛关注，因为它们本身及所诱发的各种并发症，特别是感染，常使病人的病情严重，难以治疗，并可引起严重的后果，甚至危及生命。如果通过开发保健食品，来改善机体免疫功能，经济实用，将对我国的卫生保健行业带来很大的前景。

乳清蛋白是一种混合蛋白的总称，是由乳蛋白分离除去酪蛋白后得到的乳清中所含的蛋白质成分。乳清蛋白的功能性成分为β-乳球蛋白(β-lactoglobulin)占48％，α-乳白蛋白(α-lactalbumin)占19％左右，牛乳血清白蛋白(bovine serum albumin)占5％，免疫球蛋白占8％，还含有乳铁蛋白(lactoferrin)、乳过氧物酶及生长因子等多种生物活性因子及酶等。

乳清蛋白的功能成分均可以提取出许多具有各种生理功能的活性肽段。乳清蛋白肽是酶解乳清蛋白得到的分子量集中在180-1000范围内的小分子生物活性肽的混合物。国内关于乳清蛋白肽的文献很少，仅查到6篇，其中，4篇为工艺方面的研究，即《乳清蛋白肽脱苦工艺的研究》、《复合酶解法制备乳清蛋白肽工艺条件的研究》、《乳清蛋白肽苦味修饰及其发酵饮料的研究》；2篇为降血压和抗氧化功能方面的研究，即《乳清蛋白肽对高血压大鼠血压及血管紧张素转化酶(ACE)活性的影响》和《乳清蛋白肽的制备及羟自由基的清除作用》。有关乳清蛋白肽免疫调节功能方面的研究，国内未见文献报道。国外虽有关于这方面的研究较多，但主要集中于来源于α-乳白蛋白和乳铁蛋白的免疫调节肽的研究。关于以乳清蛋白整体酶解的乳清蛋白肽在增强方面的作用国内外均未见文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种乳清蛋白肽产品及其在制备增强免疫力药物、保健食品中的用途。

本发明提供的乳清蛋白肽是乳清蛋白为原料经酶法降解生产的，分子量集中在180-1000范围内的小分子生物活性肽的混合物。

其中所述的药物、保健食品为粉剂、颗粒剂、胶囊、片剂、丸剂、口服液。

具体实施方案

下面结合具体实施方案对本发明作进一步的说明，这些实例应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例：乳清蛋白肽增强免疫力作用的实验研究

一、材料与方法

1.样品：乳清蛋白肽是酶解乳清蛋白得到的分子量集中在180-1000范围内的小分子生物活性肽的混合物。常温保存，供实验用。

2.实验动物：由北京大学医学部实验动物中心提供的ICR健康雌性小鼠(清洁级，合格证号：SCXK(京)2006-0008)，6～8周龄，18～22g，共200只，分为四批进行实验，每批随机分为5组，每组10只。实验一批进行脏器/体重比值测定、迟发型变态反应实验、抗体生成细胞数的测定和半数溶血值(HC₅₀)的测定；实验二批进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验和NK细胞活性测定；实验三批进行碳粒廓清实验；实验四批进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验。实验动物饲养于北京大学医学部实验动物中心二级动物室。

3.剂量：实验设5个组，一个阴性对照组和4个乳清蛋白肽剂量组，剂量分别为每日125mg/kgBW、250mg/kgBW、500mg/kgBW和1000mg/kgBW。受试物用水(已消毒)配制，每日一次经口给予，每周称量体重调整灌胃量，连续灌胃30天后检测各项免疫指标。小鼠灌胃体积为0.1mL/10g鼠重。对照组灌以与干预组等体积的蒸馏水。实验期间动物自由进食、饮水。

4.主要仪器与试剂：Bio-Rad酶标仪(美国)，SANYO二氧化碳培养箱(日本)，游标卡尺；刀豆蛋白A(Con A)、MTT、SDS为Sigma产品；胎牛血清、RPMI1640细胞培养液为Hyclone产品；SRBC由北京大学医学部实验动物中心提供；YAC-1细胞购自中国医学科学院细胞中心；其余试剂均为分析纯。

5.实验方法：

5.1脏器体重比值的测定：灌胃30天后，小鼠称重后颈椎脱臼处死，取脾脏和胸腺，去尽筋膜，用滤纸吸干脏器表面血污，称重，计算脾脏体重比值和胸腺体重比值。

5.2Con A诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验：灌胃30天后，颈椎脱臼处死动物，无菌取脾，磨碎，过滤(200目)，洗涤，悬浮，制备成细胞浓度为5×10⁶脾细胞悬液。将上述脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，实验孔加75μl Con A，另一孔不加Con A，作为对照孔。置5％CO₂、37℃CO₂培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸弃上清0.7ml，加入0.7ml不含胎牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT 50μl，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1ml 3％SDS，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解，于570nm波长处测定OD值，以实验孔与对照孔OD值的差值代表淋巴细胞增殖能力。受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。

5.3迟发型变态反应实验(DTH)：灌胃30天后，以2％(v/v)SRBC免疫小鼠，4天后，以游标卡尺测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射20％(v/v)SRBC 20μl，于注射后24h测量左后足跖部厚度，以攻击前后足跖厚度的差值来表示DTH的程度。受试样品组的差值显著高于对照组的差值，可判定该项实验结果阳性。

5.4抗体生成细胞检测：采用Jerne改良玻片法。灌胃30天后，以2％(v/v)SRBC免疫小鼠，4天后，颈椎脱臼处死动物，取脾，磨碎，过滤(200目)，洗涤，悬浮，制备成细胞浓度为5×10⁶脾细胞悬液。将表层培养基(1％琼脂糖)加热溶解后，置45～50℃水浴保温，与等量pH7.2～7.4、2倍浓度的Hank`s液混合，分装小管，每管0.5ml，向管内加入50μl 10％SRBC(v/v)：25μl脾细胞悬液，迅速混匀，倾倒于已刷有0.5％琼脂糖薄层的玻片上，凝固后将玻片扣置于片架上，置CO₂培养箱中孵育1.5h，然后将SA缓冲液稀释的补体(1∶8)加入玻片架凹槽内，继续孵育1.5h，计数溶血空斑数。以空斑数/全脾细胞表示，受试样品组的空斑数显著高于对照组的空斑数，可判定该项实验结果阳性。

5.5血清溶血素测定：采用半数溶血值(HC₅₀)法。灌胃4周后，以2％(v/v)SRBC免疫小鼠，4天后，摘眼球取血，分离血清，用SA缓冲液稀释200倍，取稀释后血清1ml置试管内，依次加入10％SRBC 0.5ml、1∶8稀释豚鼠补体1ml。另设不加血清的对照管。置37℃恒温水浴中保温30min后，冰浴终止反应，离心，取上清1ml，加入都氏试剂3ml，同时取10％SRBC 0.25ml加都氏试剂至4ml，充分混匀，作为SRBC半数溶血管。上述各管放置10min后，于540nm波长处测定OD值，溶血素的量以HC₅₀表示，受试样品组的HC₅₀显著高于对照组的HC₅₀，可判定该项实验结果阳性。HC₅₀计算公式如下：

5.6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)：灌胃30天后，小鼠腹腔注射20％(v/v，用生理盐水配制)鸡红细胞(2000r/min，10min)悬液1mL，间隔30min，颈椎脱臼处死，经腹腔注入生理盐水2ml，轻揉腹部20次后，切开腹壁，吸出腹腔洗液1mL分别滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，移置孵箱内37℃孵育30min，孵育结束后迅速用生理盐水冲掉未贴壁细胞，晾干，以1∶1丙酮甲醇溶液固定，4％(v/v)Giemsa-磷酸缓冲液染色，再用蒸馏水冲洗，晾干。油镜下计数，每片计数100个巨噬细胞，按下式计算吞噬率和吞噬指数，受试样品组的吞噬百分率和吞噬指数均显著高于对照组的吞噬百分率和吞噬指数，可判定该项实验结果阳性。

5.7小鼠碳粒廓清实验：灌胃30天后，尾静脉注射生理盐水稀释4倍的印度墨汁(0.1ml/10g体重)，并立即计时。注入墨汁后2、10min，分别从小鼠内眦静脉丛取血20μl，并立即加到2ml 0.1％Na₂CO₃溶液中，于600nm波长处以Na₂CO₃溶液尾空白测定OD值。第二次取血后处死动物，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污后分别称重。以吞噬指数α表示小鼠碳粒廓清能力，受试样品组的碳廓清指数α显著高于对照组的吞噬指数α，可判定该项实验结果阳性。计算公式如下：

$k=\frac{{\mathrm{lgOD}}_1-{\mathrm{lgOD}}_2}{t_2-t_1}$

5.8NK细胞活性测定：实验前24h将靶细胞YAC-1进行传代培养，应用前以Hank’s液洗3次，用含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×10⁵个/mL。灌胃4周后，颈椎脱臼处死动物，无菌取脾，磨碎，过滤(200目)，洗涤，裂解红细胞，悬浮，制备成细胞浓度为2×10⁷个/mL脾细胞悬液，即效应细胞。取经传代培养的细胞浓度为4×10⁵个/mL的靶细胞(YAC-1细胞)和上述效应细胞各100μl(效靶比50∶1)，加入96孔培养板中，靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5％Triton各100μl。置37℃、5％CO₂培养箱中培养4h，离心，每孔吸取上清100μl置另一96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μl，反应5min，每孔加入1mol/L的HCL 30μl，于酶标仪490nm波长处测定OD值，受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，可判定该项实验结果阳性。按下列公式计算NK细胞活性：

6.统计方法：所有结果以均数±标准差表示，采用SPSS10.0软件进行单因素方差分析，比较各实验组与对照组的差异。但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜F_0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F_0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

7.结果判定依据：《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)规定：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核一巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有增强免疫力功能作用。其中细胞免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能测定结果阳性。体液免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定体液免疫功能测定结果阳性。单核-巨噬细胞功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定单核-巨噬细胞功能结果阳性。NK细胞活性测定实验的一个以上剂量组结果阳性可判定NK细胞活性结果阳性。

二、结果

1.乳清蛋白肽对小鼠体重及免疫器官相对重量的影响

由表1可见，与对照组相比，小鼠的初始体重各剂量组差异无显著性(P＞0.05)，经口给予小鼠不同剂量的乳清蛋白肽30天后，各剂量组小鼠的体重与对照组比较差异均无显著性(P＞0.05)，即乳清蛋白肽对小鼠体重无影响。

此外，灌胃30天后，与对照组相比，各剂量组脾脏/体重及胸腺/体重的比值差异均无显著性(P＞0.05)，即乳清蛋白肽对小鼠免疫器官相对重量无影响。

表1乳清蛋白肽对小鼠体重及免疫器官相对重量的影响

2.乳清蛋白肽对小鼠细胞免疫功能的影响

由表2可见，经口给予小鼠不同剂量的乳清蛋白肽30天后，与对照组相比，250mg/kgBW组、500mg/kgBW组和1000mg/kgBW组的淋巴细胞增殖能力有显著性提高(P＜0.05)。即乳清蛋白肽在250mg/kgBW组、500mg/kgBW组和1000mg/kgBW组能增强ConA诱导小鼠淋巴细胞转化能力。

此外，经口给予小鼠不同剂量的乳清蛋白肽30天后，与对照组相比，250mg/kgBW组足跖肿胀度显著增强(P＜0.05)。即乳清蛋白肽在250mg/kgBW组能增强小鼠迟发型变态反应能力。

表2乳清蛋白肽对小鼠细胞免疫功能的影响

*：与阴性对照组比较有显著性差异，P＜0.05

2.3乳清蛋白肽对小鼠体液免疫的影响

由表3可见，经口给予小鼠不同剂量的乳清蛋白肽30天后，与对照组相比，250mg/kgBW组和500mg/kgBW组的抗体生成细胞数有所增加且差异有显著性(P＜0.05)，即乳清蛋白肽在250mg/kgBW组和500mg/kgBW剂量组均能提高小鼠抗体生成细胞数。而与对照组相比，各剂量组小鼠的半数溶血值(HC₅₀)差异无显著性(P＞0.05)。

表3乳清蛋白肽对小鼠体液免疫的影响

*：与阴性对照组比较有显著性差异，P＜0.05

2.4乳清蛋白肽对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响

由表4可见，经口给予小鼠不同剂量的乳清蛋白肽30天后，与对照组相比，各剂量组的吞噬率和吞噬指数差异无显著性(P＞0.05)，即乳清蛋白肽对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力无影响。

此外，经口给予小鼠不同剂量的乳清蛋白肽30天后，与对照组相比，各剂量组的小鼠碳粒廓清指数(α)无显著性差异(P＞0.05)，即乳清蛋白肽对小鼠碳粒廓清能力无影响。

表4乳清蛋白肽对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响

2.5乳清蛋白肽对小鼠NK细胞活性的影响

由表5可见，经口给予小鼠不同剂量的乳清蛋白肽30天后，与对照组相比，250mg/kgBW组和500mg/kgBW组的小鼠NK细胞活性显著增强(P＜0.05)；即乳清蛋白肽在250mg/kgBW组和500mg/kgBW组能提高小鼠NK细胞活性。

表5乳清蛋白肽对小鼠NK细胞活性的影响

*：与阴性对照组比较有显著性差异，P＜0.05

三、小结

经口给予小鼠不同剂量的乳清蛋白肽30天后，与对照组比较，该受试物250mg/kgBW组对ConA诱导的小鼠淋巴细胞增殖能力、迟发型变态反应(DTH)程度、抗体生成细胞功能(IgM-PFC)以及小鼠NK细胞活性均有显著提高；500mg/kgBW组对ConA诱导的小鼠淋巴细胞增殖能力和小鼠NK细胞活性均有有显著提高；1000mg/kgBW组对ConA诱导的小鼠淋巴细胞增殖能力有显著提高。各剂量组对小鼠体重增长、免疫器官脏器比以及单核-巨噬细胞吞噬功能均无影响。根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)对增强免疫力保健食品的判定标准可知，乳清蛋白肽具有增强免疫力的功能。

Claims (3)

1.乳清蛋白肽在制备增强免疫力药物、保健食品中的用途。

2.如权利要求1，乳清蛋白肽是酶解乳清蛋白得到的分子量集中在180-1000范围内的小分子生物活性肽的混合物。

3.如权利要求1，其中所述的药物、保健食品为粉剂、颗粒剂、胶囊、片剂、丸剂、口服液。