CN110716037A - 一种具有增强免疫力功能的青红酒 - Google Patents

一种具有增强免疫力功能的青红酒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种具有增强免疫力功能的青红酒。本发明选用上好的糯米，配以白曲精酿制成青红酒。本发明通过测定小鼠饮酒后体液免疫功能（抗体生成细胞检测，血清溶血素测定），NK细胞活性两个方面结果均呈阳性，明确受试样品具有增强免疫力的功效，为青红酒的饮用奠定理论基础。

Description

一种具有增强免疫力功能的青红酒
技术领域
本发明属于酒酿造领域，具体涉及一种青红酒在增强免疫力中的应用。
背景技术
青红酒，是以福建独有的古田红曲做为糖化发酵剂；选用上好的糯米；配以白曲精酿而成，色呈琥珀，口感柔顺绵长。青红酒含有丰富的葡萄糖、糊精、氨基酸、维生素和多种酯类物组成；酒精度13%左右，刺激性小，适量常饮，有促进食欲、舒筋活络、生津补血、调养生体、解除疲乏的功效，是一种老少皆宜的饮用酒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种青红酒在增强免疫力中的应用，并且所述青红酒具有提高体液免疫功能和NK细胞活性的功效。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
1.1 样品：青红酒，样品形态为棕黄色液体，澄清透明、无肉眼可见的杂质、久置后允许有少量沉淀物，置常温保存。样品人体推荐剂量为100mL/人/日。
1.2 实验动物： SPF级CI/F1代健康雌性小鼠80只，体重为18.0～21.8g。
小鼠按体重随机分为两组，每组4个剂量，每个剂量10只。其中Ⅰ组小鼠进行抗体生成细胞检测和半数溶血值HC50的测定；Ⅱ组小鼠进行NK细胞活性试验。
1.3 剂量选择与受试物给予方式：样品人体推荐剂量为100mL/人/日，成品酒精浓度为13±1%(v/v) 。本实验室使用60℃减压浓缩方法，将样品进行15倍浓缩后作为本次实验受试样品，该受试样品的人体推荐量为6.67mL/人/日（体重60kg计）。设0.56mL/kg·bw/d、1.11mL/kg·bw/d、3.33mL/kg·bw/d三个剂量组（分别相当于受试样品人体推荐摄入量的5倍、10倍、30倍），另设0mL/kg·bw/d组以13%的酒基代替受试物。以50%(v/v)的酒基进行受试样品的配制，并调整各剂量组的乙醇浓度为13%，低、中、高剂量配制浓度分别为13%、4.33%、2.2%。经口每日一次给予小鼠相应剂量的受试物，小鼠灌胃量为0.1mL/10g·bw。连续灌胃一个月后测定各项增强免疫力功能指标。
1.4 主要仪器与试剂
1.4.1主要仪器：打孔器、T1000型电子天平、JA2003型电子天平、SG-603生物安全柜、多功能酶标仪、二氧化碳培养箱、JJ-100电子天平。
1.4.2 主要试剂：SRBC，RPMI1640，YAC-1细胞。
1.5 试验方法
1.5.1.1抗体生成细胞检测——Jerne改良玻片法
各剂量组动物连续灌胃一个月后，每只鼠腹腔注射2%（v/v）的SRBC悬液0.2mL进行免疫，4d后小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，研磨脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心（1000r/min）10min，用Hank’s液洗2遍，最后将细胞悬浮于5mLRPMI1640培养液中，计数细胞数，用RPMI1640培养液调整细胞浓度为5×106个/mL。将表层培养基加热溶解后，放45℃水浴保温，与等量pH7.2～7.4两倍浓度的Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加10% SRBC（v/v，用SA缓冲液配制）50µL，20µL脾细胞悬液（5×106个/mL），迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做二个平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入37℃、5%CO2培养箱中孵育1.5h，然后将制备好的补体1:8稀释后加入到玻片架凹槽内，继续孵育1.5h后，计数溶血空斑数。
溶血空斑数 = 溶血空斑计数×10
用空斑数/106脾细胞来表示，受试样品组的空斑数显著高于对照组的空斑数，可判定该项试验结果阳性。
1.5.1.2血清溶血素测定——半数溶血值(HC50)
各剂量组动物连续灌胃一个月后，制备2%（v/v）的SRBC悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫，4d后小鼠眼底静脉丛取血于离心管内，放置1h，2000r/min 离心10min，分离并收集血清。血清200倍稀释后，按检验方法测定样品管及SRBC半数溶血时的光密度值。溶血素的量以半数溶血值(HC50)表示。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
溶血素的量以半数溶血值（HC50）表示，受试样品组的HC50显著高于对照组的HC50，可判定该项试验结果阳性。
1.5.2 NK细胞活性测定——乳酸脱氢酶测定法
各剂量组动物连续灌胃一个月后，颈椎脱臼处死小鼠，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，研磨脾脏，制成单细胞悬液，经200目筛网过滤，用Hank’s液洗2次，每次离心10min（1000r/min），弃上清将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0.5mL 2倍Hank’s液及8mL Hank’s液，离心10min（1000r/min），用含10%小牛血清RPMI1640完全培养液重悬，1%冰乙酸稀释后计数，台酚兰染色计数活细胞数（均在95%以上），用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×107个/mL。
试验前24h将靶细胞（YAC-1细胞）传代培养，应用前以Hank’s液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL。取YAC-1细胞和脾细胞各100µL（效靶比50:1）加入U型96孔培养板中，YAC-1细胞自然释放孔加YAC-1细胞和培养液各100µL，YAC-1细胞最大释放孔加YAC-1细胞和2.5%Triton各100µL，上述各项均设三个平行孔，于37℃、5%CO2培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清液100µL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100µL，反应10min，每孔加入1mol/L的HCl 30µL，在酶标仪490nm处测定光密度值。
受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，方可判定该项试验结果阳性。
1.6 试验数据统计：用SPSS10.0软件对各试验原始数据进行方差齐性检验，满足方差齐要求的数据资料，用单因素方差分析方法中多个试验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理；对非正态分布或方差不齐的数据资料进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换所得的数据进行统计处理。
本发明的优点在于：本发明选用上好的糯米，配以白曲精酿制成青红酒。本发明通过测定小鼠饮酒后体液免疫功能（抗体生成细胞检测，血清溶血素测定），NK细胞活性两个方面结果均呈阳性，明确受试样品具有增强免疫力的功效，为青红酒的饮用奠定理论基础。
具体实施方式
1 材料和方法
1.1 样品：青红酒，样品形态为棕黄色液体，澄清透明、无肉眼可见的杂质、久置后允许有少量沉淀物，置常温保存。样品人体推荐剂量为100mL/人/日。
1.2 实验动物： SPF级CI/F1代健康雌性小鼠80只，体重为18.0～21.8g。
小鼠按体重随机分为两组，每组4个剂量，每个剂量10只。其中Ⅰ组小鼠进行抗体生成细胞检测和半数溶血值HC50的测定；Ⅱ组小鼠进行NK细胞活性试验。
1.3 剂量选择与受试物给予方式：样品人体推荐剂量为100mL/人/日，成品酒精浓度为13±1%(v/v) 。本实验室使用60℃减压浓缩方法，将样品进行15倍浓缩后作为本次实验受试样品，该受试样品的人体推荐量为6.67mL/人/日（体重60kg计）。设0.56mL/kg·bw/d、1.11mL/kg·bw/d、3.33mL/kg·bw/d三个剂量组（分别相当于受试样品人体推荐摄入量的5倍、10倍、30倍），另设0mL/kg·bw/d组以13%的酒基代替受试物。以50%(v/v)的酒基进行受试样品的配制，并调整各剂量组的乙醇浓度为13%，低、中、高剂量配制浓度分别为13%、4.33%、2.2%。经口每日一次给予小鼠相应剂量的受试物，小鼠灌胃量为0.1mL/10g·bw。连续灌胃一个月后测定各项增强免疫力功能指标。
1.4 主要仪器与试剂
1.4.1主要仪器：打孔器、T1000型电子天平、JA2003型电子天平、SG-603生物安全柜、多功能酶标仪、二氧化碳培养箱、JJ-100电子天平。
1.4.2 主要试剂：SRBC，RPMI1640，YAC-1细胞。
1.5 试验方法
1.5.1.1抗体生成细胞检测——Jerne改良玻片法
各剂量组动物连续灌胃一个月后，每只鼠腹腔注射2%（v/v）的SRBC悬液0.2mL进行免疫，4d后小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，研磨脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心（1000r/min）10min，用Hank’s液洗2遍，最后将细胞悬浮于5mLRPMI1640培养液中，计数细胞数，用RPMI1640培养液调整细胞浓度为5×106个/mL。将表层培养基加热溶解后，放45℃水浴保温，与等量pH7.2～7.4两倍浓度的Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加10% SRBC（v/v，用SA缓冲液配制）50µL，20µL脾细胞悬液（5×106个/mL），迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做二个平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入37℃、5%CO2培养箱中孵育1.5h，然后将制备好的补体1:8稀释后50µL加入到玻片架凹槽内，继续孵育1.5h后，计数溶血空斑数。
溶血空斑数 = 溶血空斑计数×10；
用空斑数/106脾细胞来表示，受试样品组的空斑数显著高于对照组的空斑数，可判定该项试验结果阳性。
1.5.1.2血清溶血素测定——半数溶血值(HC50)
各剂量组动物连续灌胃一个月后，制备2%（v/v）的SRBC悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫，4d后小鼠眼底静脉丛取血于离心管内，放置1h，2000r/min 离心10min，分离并收集血清。血清200倍稀释后，按检验方法测定样品管及SRBC半数溶血时的光密度值。溶血素的量以半数溶血值(HC50)表示。
Figure DEST_PATH_IMAGE005
溶血素的量以半数溶血值（HC50）表示，受试样品组的HC50显著高于对照组的HC50，可判定该项试验结果阳性。
1.5.2 NK细胞活性测定——乳酸脱氢酶测定法
各剂量组动物连续灌胃一个月后，颈椎脱臼处死小鼠，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，研磨脾脏，制成单细胞悬液，经200目筛网过滤，用Hank’s液洗2次，每次离心10min（1000r/min），弃上清将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0.5mL 2倍Hank’s液及8mL Hank’s液，离心10min（1000r/min），用含10%小牛血清RPMI1640完全培养液重悬，1%冰乙酸稀释后计数，台酚兰染色计数活细胞数（均在95%以上），用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×107个/mL。
试验前24h将靶细胞（YAC-1细胞）传代培养，应用前以Hank’s液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL。取YAC-1细胞和脾细胞各100µL（效靶比50:1）加入U型96孔培养板中，YAC-1细胞自然释放孔加YAC-1细胞和培养液各100µL，YAC-1细胞最大释放孔加YAC-1细胞和2.5%Triton各100µL，上述各项均设三个平行孔，于37℃、5%CO2培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清液100µL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100µL，反应10min，每孔加入1mol/L的HCl 30µL，在酶标仪490nm处测定光密度值。
Figure 361218DEST_PATH_IMAGE004
受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，方可判定该项试验结果阳性。
1.6 试验数据统计：用SPSS10.0软件对各试验原始数据进行方差齐性检验，满足方差齐要求的数据资料，用单因素方差分析方法中多个试验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理；对非正态分布或方差不齐的数据资料进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换所得的数据进行统计处理。
2 结果
试验过程中动物饮水摄食正常，外观无异常。
2.1 青红酒对小鼠体重的影响
由表1可见，小鼠的初始体重0.56mL/kg·bw/d、1.11mL/kg·bw/d、3.33mL/kg·bw/d组与0mL/kg·bw/d组比较，差异无统计学意义(P﹥0.05)。表明小鼠的初始体重在各组间较为均衡。
灌胃不同剂量的青红酒一个月后，将各剂量组终末体重及增长值进行方差齐性检验，满足方差齐要求，用单因素方差分析方法中多个试验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。0.56mL/kg·bw/d、1.11mL/kg·bw/d、3.33mL/kg·bw/d组与0mL/kg·bw/d组比较，差异无统计学意义(P﹥0.05)。
表1青红酒对小鼠体重的影响(
Figure DEST_PATH_IMAGE007
±SD)
Figure DEST_PATH_IMAGE009
2.2 青红酒对小鼠胸腺、脾脏器官的影响
灌胃给予小鼠不同剂量的青红酒一个月后，取小鼠的胸腺和脾称重，计算脏体比，并对脏体比进行方差齐性检验，满足方差齐性要求，用单因素方差分析方法中多个试验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由表2结果可见，0.56mL/kg·bw/d、1.11mL/kg·bw/d、3.33mL/kg·bw/d组与0mL/kg·bw/d组比较，差异无统计学意义(P﹥0.05)。
表2 青红酒对小鼠胸腺、脾脏器官的影响(±SD)
Figure DEST_PATH_IMAGE011
2.3 青红酒对小鼠抗体生成细胞（溶血空斑数）的影响
灌胃给予小鼠不同剂量的青红酒一个月后，用Jerne改良玻片法进行小鼠抗体生成细胞实验，计算溶血空斑数，并对其进行方差齐性检验，满足方差齐性要求，用单因素方差分析方法中多个试验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由表3结果可见，3.33mL/kg·bw/d组溶血空斑数高于0mL/kg·bw/d组，差异有统计学意义(P﹤0.05)。
表3 青红酒对小鼠溶血空斑数的影响 (
Figure 497243DEST_PATH_IMAGE007
±SD)
Figure DEST_PATH_IMAGE013
2.4 青红酒对小鼠血清半数溶血值(HC50)的影响
灌胃给予小鼠不同剂量的青红酒一个月后，用半数溶血值法测定小鼠的血清半数溶血值（HC50），并对其进行方差齐性检验，满足方差齐性要求，用单因素方差分析方法中多个试验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由表4结果可见，3.33mL/kg·bw/d组小鼠血清半数溶血值(HC50)高于0mL/kg·bw/d组，差异有统计学意义(P﹤0.05)。
表4 青红酒对小鼠HC50的影响(
Figure 112026DEST_PATH_IMAGE007
±SD)
2.5 青红酒对小鼠NK细胞活性的影响
灌胃给予小鼠不同剂量的青红酒一个月后，用乳酸脱氢酶测定法进行小鼠NK细胞活性测定，将NK细胞活性经sin-1P1/2(P为NK细胞活性，用小数表示)转化后进行方差齐性检验，满足方差齐性要求，用单因素方差分析方法中多个试验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由表5结果可见，3.33mL/kg·bw/d组NK细胞活性高于0mL/kg·bw/d组，差异有统计学意义(P﹤0.05)。
表5 青红酒对小鼠NK细胞活性的影响 (
Figure 598503DEST_PATH_IMAGE007
±SD)
Figure DEST_PATH_IMAGE017
3. 结果判定
根据《保健食品检验与评价技术规范》，在细胞免疫功能（ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化，DNFB诱导小鼠DTH）、体液免疫功能（抗体生成细胞检测，血清溶血素测定）、单核-巨噬细胞功能（小鼠碳廓清，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞）、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有增强免疫力功能作用。
其中细胞免疫功能测定项目中的两个试验结果均为阳性，或任一个试验的两个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能测定结果阳性；体液免疫功能测定结果中两个试验结果均为阳性，或任一个试验的两个剂量组结果阳性，可判定体液免疫功能测定结果阳性；单核-巨噬细胞功能测定项目中的两个试验结果均为阳性，或任一个试验的两个剂量组结果阳性，可判定单核-巨噬细胞功能结果阳性；NK细胞活性测定试验的一个以上剂量组结果阳性，可判定NK细胞活性结果阳性。
4. 结论
本青红酒0.56mL/kg·bw/d、1.11mL/kg·bw/d、3.33mL/kg·bw/d三个剂量灌胃给予小鼠一个月，进行小鼠体液免疫功能及NK细胞活性测定。结果显示，青红酒对小鼠体重无影响，胸腺、脾脏器官无影响； 3.33mL/kg·bw/d组半数溶血值及溶血空斑数高于0mL/kg·bw/d组； 3.33mL/kg·bw/d组NK细胞活性高于0mL/kg·bw/d组，且差异均有统计学意义（P﹤0.05）。根据《保健食品检验与评价技术规范》之增强免疫力功能试验的结果判定，本测试样品青红酒具有增强免疫力功能。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (2)

1.一种青红酒的应用，其特征在于，所述青红酒具有增强免疫力的功效。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述青红酒具有提高体液免疫功能和NK细胞活性的功效。
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