CN102633879A - 兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的制备与应用 - Google Patents
兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的制备与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102633879A CN102633879A CN2011104497700A CN201110449770A CN102633879A CN 102633879 A CN102633879 A CN 102633879A CN 2011104497700 A CN2011104497700 A CN 2011104497700A CN 201110449770 A CN201110449770 A CN 201110449770A CN 102633879 A CN102633879 A CN 102633879A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lactalbumin
- alpha
- polyclonal antibody
- rabbit
- polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的制备与应用。目前没有兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的制备,本发明方法通过如下步骤制备:1)α-乳清蛋白分子N端多肽抗原的合成;2)兔抗人α-乳清蛋白分子多克隆抗体的制备;3)ELISA检测抗血清效价;4)抗血清的纯化;5)α-乳清蛋白多抗的western-blot分析;6)多克隆抗体的免疫组化染色。本发明具有特异性好、纯度高的特点,可与人乳腺细胞的α-乳清蛋白发生特异性结合反应,可用于western-blot、免疫组化等试验的要求。
Description
技术领域
本发明属于生命科学技术领域,具体涉及为一种兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的制备及应用。
背景技术
α-乳清蛋白作为乳品中重要的营养成分, 约占人乳中总蛋白含量的28%,占乳清白蛋白含量的49%,其蛋白质效率、净蛋白质利用率都高于酪蛋白, 是一种极易消化吸收的蛋白质。同时,天然状态下的α-乳清白蛋白,在有C18:1脂肪酸存在下,可以转变成具有杀菌活性的形式。而且α-乳清蛋白富含半胱氨酸和蛋氨酸,它们能维持人体内抗氧化剂的水平,并可促进蛋白质合成,它还富含色氨酸,可促进神经系统发育,并有调节睡眠和食欲的作用,对该基因内源表达的研究表明,该基因的表达具有很高的组织特异性和发育时期的特异性。
α-乳清蛋白是一种小分子质量的酸性钙结合蛋白,等电点在4~5之间,几乎存在于所有的哺乳动物乳汁中,多数α-乳清蛋白含有123个氨基酸,其中包括人、牛、羊、兔等物种,一般该基因的转录单元长度都在2Kb左右,包括4个外显子。α-乳清蛋白在氨基酸序列上与溶菌酶家族同源,X-射线衍射晶体结构分析显示它的三级结构也与溶菌酶相似。α-乳清蛋白在葡萄糖存在条件下,与半乳糖甘转移酶结合在一起,调节该酶的专一性,它限制着乳糖合成复合体的速率,是乳糖合成必需的关键基因,因此α-乳清蛋白被认为具有通过控制乳糖的合成而间接影响乳产量及乳品质的功能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性好、纯度高、可与人乳腺细胞的α-乳清蛋白发生特异性结合反应的兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的制备方法及其应用。
本发明的具体实施步骤如下:
TyrTrpLeuAlaHisLysAlaLeuCysSerGluLysLeuAspGlnTrpLeuCysGluLys;
步骤(2).用多肽自动合成仪合成人的α-乳清蛋白多肽并纯化,纯化后与载体蛋白KLH偶联,形成人的α-乳清蛋白多肽-KLH复合蛋白;
所述的兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体,其效价在1:60000以上;
步骤(5).将步骤(2)合成并纯化后的人的α-乳清蛋白多肽与溴化氰活化的Sepharose 4B偶联,形成多肽亲和层析柱;
步骤(6).将含有兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的血清加入到步骤(5)制备的多肽亲和层析柱中,并在4℃孵育过夜后,洗脱抗体,得到兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体;
所述的步骤(2)人的α-乳清蛋白多肽的纯化,采用HPLC,可使人的α-乳清蛋白多肽的纯度达到95%以上;
所述的步骤(6)中兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的纯化,采用免疫亲和纯化的方式。
兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体初步应用较为广泛,可与人乳腺细胞的α-乳清蛋白发生特异性结合反应,可用于western-blot、免疫组化等试验的要求。本发明有益效果如下:
本发明制备的抗α-乳清蛋白多克隆抗体具有特异性好、纯度高的特点、可与人乳腺细胞α-乳清蛋白发生特异性结合反应,可用于western-blot、免疫组化等实验的要求。本发明兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的制备,为深入研究人α-乳清蛋白的生物学功能和在乳腺细胞水平调控人的乳汁分泌及品质提供了一个重要工具,具有重要的理论意义和生产价值。
附图说明
图1 为本发明α-乳清蛋白的western-blot分析结果图;
图2为本发明在人乳腺癌细胞中的免疫组化染色图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1:
TyrTrpLeuAlaHisLysAlaLeuCysSerGluLysLeuAspGlnTrpLeuCysGluLys;
步骤(2).用多肽自动合成仪合成人的α-乳清蛋白多肽并纯化,纯化后与载体蛋白KLH偶联,形成人的α-乳清蛋白多肽-KLH复合蛋白;
所述的兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体,其效价在1:60000以上;
步骤(5).将步骤(2)合成并纯化后的人的α-乳清蛋白多肽与溴化氰活化的Sepharose 4B偶联,形成多肽亲和层析柱;
步骤(6).将含有兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的血清加入到步骤(5)制备的多肽亲和层析柱中,并在4℃孵育过夜后,洗脱抗体,得到兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体;
所述的步骤(2)人的α-乳清蛋白多肽的纯化,采用HPLC,可使人的α-乳清蛋白多肽的纯度达到95%以上;
所述的步骤(6)中兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的纯化,采用免疫亲和纯化的方式。
兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体应用1步骤如下:
步骤(1).蛋白裂解液裂解人乳腺癌组织样品,冰上孵育30 min后,13500g离心45 min,获得乳腺癌组织总蛋白;
步骤(2).取5μg总蛋白裂解液并加入等体积2×SDS加样缓冲液,于100℃加热5 min后,进行常规SDS-PAGE电泳,分离胶浓度为100 g/L;
步骤(3).电泳结束后,电转至PVDF膜上,用50 g/L脱脂奶粉室温下封闭1 h;
步骤(4).加入1∶1 000稀释的兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体,室温下孵育2 h;
步骤(5).图1所示,TBST缓冲液洗膜后,加入羊抗兔IgG-HRP抗体,室温下孵育1 h, TBST缓冲液洗膜后的图。
兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体应用2步骤如下:
步骤(2).加入α-乳清蛋白多克隆抗体,37℃1小时或4℃孵育过夜;
步骤(3).PBS洗片3次,每次5分钟,加入羊抗兔IgG-HRP,37℃孵育1小时;
步骤(4).如图2 所示,PBS洗片后进行DAB显色,苏木素复染,返蓝后封片镜检,放大400倍拍照记录结果。
Claims (2)
1.兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的制备,其特征在于如下步骤:
TyrTrpLeuAlaHisLysAlaLeuCysSerGluLysLeuAspGlnTrpLeuCysGluLys;
步骤(2).用多肽自动合成仪合成人的α-乳清蛋白多肽并纯化,纯化后与载体蛋白KLH偶联,形成人的α-乳清蛋白多肽-KLH复合蛋白;
所述的兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体,其效价在1:60000以上;
步骤(5).将步骤(2)合成并纯化后的人的α-乳清蛋白多肽与溴化氰活化的Sepharose 4B偶联,形成多肽亲和层析柱;
步骤(6).将含有兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的血清加入到步骤(5)制备的多肽亲和层析柱中,并在4℃孵育过夜后,洗脱抗体,得到兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体;
所述的步骤(2)人的α-乳清蛋白多肽的纯化,采用HPLC,可使人的α-乳清蛋白多肽的纯度达到95%以上;
所述的步骤(6)中兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的纯化,采用免疫亲和纯化的方式。
2.根据权利要求1所述的兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的制备后的应用,其特征在于:该抗体可与人乳腺细胞的α-乳清蛋白发生特异性结合反应,可用于western-blot、免疫组化试验的要求。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2011104497700A CN102633879A (zh) | 2011-12-29 | 2011-12-29 | 兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的制备与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2011104497700A CN102633879A (zh) | 2011-12-29 | 2011-12-29 | 兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的制备与应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102633879A true CN102633879A (zh) | 2012-08-15 |
Family
ID=46618469
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2011104497700A Pending CN102633879A (zh) | 2011-12-29 | 2011-12-29 | 兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的制备与应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102633879A (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104267189A (zh) * | 2014-09-01 | 2015-01-07 | 华中农业大学 | 牛奶中人α-乳清蛋白筛查试纸条及制备方法与应用 |
CN104422776A (zh) * | 2013-09-03 | 2015-03-18 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种人α-乳清白蛋白夹心ELISA检测试剂盒及其应用 |
CN104725506A (zh) * | 2013-12-23 | 2015-06-24 | 上海复星医药(集团)股份有限公司 | 一种应用免疫亲和柱纯化人血清前白蛋白多克隆抗体的方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1850974A (zh) * | 2005-04-21 | 2006-10-25 | 李宁 | 转人α-乳清蛋白基因的转基因克隆大型家畜的生产方法 |
CN101588820A (zh) * | 2006-11-17 | 2009-11-25 | 尼亚哈姆雷特药品公司 | α-乳清蛋白组合物 |
CN102028932A (zh) * | 2009-09-29 | 2011-04-27 | 黑龙江省索康营养科技有限公司 | 乳清蛋白肽在制备增强免疫力药物、保健食品中的用途 |
-
2011
- 2011-12-29 CN CN2011104497700A patent/CN102633879A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1850974A (zh) * | 2005-04-21 | 2006-10-25 | 李宁 | 转人α-乳清蛋白基因的转基因克隆大型家畜的生产方法 |
CN101588820A (zh) * | 2006-11-17 | 2009-11-25 | 尼亚哈姆雷特药品公司 | α-乳清蛋白组合物 |
CN102028932A (zh) * | 2009-09-29 | 2011-04-27 | 黑龙江省索康营养科技有限公司 | 乳清蛋白肽在制备增强免疫力药物、保健食品中的用途 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
IWADATE K等: "Immunohistochemical examination of the lungs in infant death cases using antibodies against milk components", 《FORENSIC SCIENCE INTERNATIONAL》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104422776A (zh) * | 2013-09-03 | 2015-03-18 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种人α-乳清白蛋白夹心ELISA检测试剂盒及其应用 |
CN104422776B (zh) * | 2013-09-03 | 2016-01-13 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种人α-乳清白蛋白夹心ELISA检测试剂盒及其应用 |
CN104725506A (zh) * | 2013-12-23 | 2015-06-24 | 上海复星医药(集团)股份有限公司 | 一种应用免疫亲和柱纯化人血清前白蛋白多克隆抗体的方法 |
CN104267189A (zh) * | 2014-09-01 | 2015-01-07 | 华中农业大学 | 牛奶中人α-乳清蛋白筛查试纸条及制备方法与应用 |
CN104267189B (zh) * | 2014-09-01 | 2016-01-20 | 华中农业大学 | 牛奶中人α-乳清蛋白筛查试纸条及制备方法与应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103360468B (zh) | 一种scd1多肽及抗鹅scd1多肽多克隆抗体的制备方法 | |
Tay et al. | Proteomics of human and the domestic bovine and caprine milk | |
CN102633879A (zh) | 兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的制备与应用 | |
CN113265003B (zh) | 抗TdT蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用 | |
CN113045652A (zh) | 抗dog1蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用 | |
CN101104635B (zh) | 一种从转基因牛乳中纯化重组人α-乳清白蛋白的方法 | |
Ghosal et al. | Endoplasmic reticulum lumenal proteins of rat mammary gland. Potential involvement in lipid droplet assembly during lactation | |
CN103665139A (zh) | 一种脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白及其单克隆抗体的制备和应用 | |
CN101880316A (zh) | 一种人rbpms多肽及其抗体制备方法 | |
CN108148127A (zh) | 一种人map3k7ip2多肽及其抗体制备方法 | |
CN103880960A (zh) | 一种分泌抗cd10分子的单克隆抗体及其应用 | |
Mælan et al. | Localization of thymosin β10 in breast cancer cells: relationship to actin cytoskeletal remodeling and cell motility | |
CN105175543A (zh) | 抗E-Cadherin蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗E-Cadherin单克隆抗体和应用 | |
CN114262376A (zh) | 长牡蛎四种胰岛素样肽多克隆抗体及其制备方法和应用 | |
CN104558145B (zh) | 一种胎球蛋白a重组蛋白及多克隆抗体的制备方法 | |
CN101928332A (zh) | 一种人hnrpa0多肽及其抗体制备方法 | |
CN103102392B (zh) | 一种维甲酸诱导蛋白16n端多肽及其抗体的制备方法和应用 | |
EP0994187B1 (en) | Renin-active substance comprising human prorenin and antibodies to the prorenin profragment | |
CN109651497A (zh) | 一种草鱼FoxO1多肽抗原、抗体及其制备方法、应用 | |
CN102532322A (zh) | 兔抗猪tpo多克隆抗体的制备与应用 | |
Boesch et al. | Localization of the vacuolar-type ATPase in swimbladder gas gland cells of the European eel (Anguilla anguilla) | |
CN100569800C (zh) | 抗人髓系分化标志基因的单克隆抗体及其应用 | |
CN103848888A (zh) | 一种人补体C1q/TNFα相关蛋白-2(hCTRP2)的抗原肽及其抗体 | |
Bottke | Electrophoretic and immunologic studies on the structure of a mollusc ferritin | |
Mohammadnejad et al. | A New Competitive Enzyme Linked Immunosorbent Assay (MRP83‐CA15‐3) for MUC1 Measurement in Breast Cancer |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20120815 |