CN103665139A - 一种脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白及其单克隆抗体的制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域。本发明涉及一种重组人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白及其单克隆抗体的制备与应用，以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株2E4，于2013年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO：8412。杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有能够与重组人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白特异性结合的特点。所述的单克隆抗体可在纯化或检测人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白中应用，可用于动脉粥样硬化、糖尿病等代谢类疾病的早期检测，具有重大应用前景。

Description

一种脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白及其单克隆抗体的制备和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域。具体的说，本发明涉及一种重组蛋白、编码该重组蛋白的核苷酸序列、含有上述核苷酸序列的质粒载体，以及转化有上述质粒载体的菌株，还涉及使用上述重组蛋白制备脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白制备杂交瘤细胞株，及其生产的单克隆抗体和应用。
背景技术
脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein，FABP)是一类同源低分子质量的胞浆蛋白，自1972年脂肪酸结合蛋白被发现以来，发现至少存在9种不同类型的FABPs。不同的FABPs具有一定的组织表达特异性，根据其来源的不同可分为：肝型(live，L-)，肠型(intestinal，I-)，心脏型(heart，H-)，脂肪细胞型(adipocyte，A-)，表皮型(epidermal，E-)，回肠型(ileum，IL-)，脑型(brain，B-)，髓磷脂型(myelin，M-)，睾丸型(testis，T-)FABP。不同类型的FABP分子量大约在14-15kDa之间，含有126-137个氨基酸，不同类型的FABP的氨基酸序列15％-70％的同源序列。FABP作为一种脂质伴侣，其最基本的功能是与脂肪酸特异性结合，并将脂肪酸从细胞膜转运到脂肪酸在细胞内被利用的位置，参与脂肪酸的摄取、转运、酯化和β-氧化等一系列过程，调节脂肪酸的氧化以及磷脂、甘油三酯的代谢。此外，FABP家族成员还与细胞生长和增殖的调节有关。脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白是细胞内脂肪酸结合蛋白超家族成员之一，编码132个氨基酸，相对分子质量为14588Da。其最早是在脂肪组织中被发现，广泛存在于体内多种组织和细胞内，但主要表达于脂肪细胞和巨噬细胞中，参与脂肪酸的摄取、转运、酯化和β-氧化等过程，调节脂肪酸的氧化以及磷脂、甘油三酯的代谢。研究表明其与代谢综合征及动脉粥样硬化等疾病的发生密切相关，因此，特异性检测识别人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白显得尤为重要。目前，以免疫学为基础的血清学检测，由于其操作简便，结果易于判定，已成为主流方向，该方法主要是通过制备得到的人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体实现对人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白的特异性检测。
发明内容
设计目的：通过设计一种重组蛋白并制备其单克隆抗体，从而实现人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白的特异性检测识别。
设计方案：为了实现上述设计目的。本申请：(1)以人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白为靶抗原，采用大肠杆菌偏爱密码子，将其氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，以利于重组蛋白在大肠杆菌中的表达。(2)化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入表达载体pET-28a(+)中，构建重组蛋白表达载体。(3)将重组蛋白表达载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选得到重组蛋白表达菌株。(4)重组蛋白表达菌株大规模培养后，收集菌体，超声破菌并低温离心后，取溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱进行亲和层析，洗脱得到纯化的重组蛋白。(5)用纯化后的重组蛋白多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，经过多轮筛选得到杂交瘤细胞株。(6)将杂交瘤细胞株制备小鼠腹水，使用辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体。(7)纯化得到的单克隆抗体在检测或纯化人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白中的应用。(8)纯化得到的单克隆抗体在制备人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白检测试剂中的应用。(9)所述的人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白检测试剂优选检测人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白的Western Blot试剂、ELISA检测试剂。
本发明的有益效果：
本发明构建了人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白表达载体，将其转化大肠杆菌感受态细胞，制备人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白表达菌株，并发酵表达、纯化得到人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白。以其作为免疫原，经过皮下免疫、常规细胞融合、筛选及亚克隆，获得了能够稳定分泌抗人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经ELISA、Western Blot等方法鉴定，该杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体能够特异性识别人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白，效价高、特异性强。
本发明人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的应用如下：
(1)应用该抗体可通过Western Blot检测脂肪组织中的人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白表达。
(2)应用该抗体可建立ELISA检测试剂盒定量检测各种体液如血液、血清、尿的人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白水平。
(3)应用该抗体制备免疫亲和层析柱，来分离纯化人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白。
(4)应用该抗体进行免疫组化检测脂肪组织中人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白表达量。
综上所述，本发明成功构建了人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白表达载体，并纯化得到了人脂肪细胞型脂肪酸结合重组蛋白。此外，成功制备了抗人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体，该抗体具有效价高、特异性强的特性，为快速检测人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白提供了关键技术。
附图说明
图1是不同浓度咪唑从镍琼脂糖亲和层析柱洗脱目的蛋白的SDS-PAGE电泳图。
图2是杂交瘤细胞染色体图。
图3是纯化后的单克隆抗体电泳图。
图4是Western Blot检测单克隆抗体与重组脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白的特异性反应图。
生物材料保藏信息
杂交瘤细胞株2E4，于2013年10月28日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，简称：CGMCC；保藏地址为中国科学院北京微生物研究所；保藏号为CGMCC NO：8412。
具体实施方式
实施例1：优化编码重组蛋白的核苷酸序列
为了提高重组蛋白在大肠杆菌中的表达量，在重组蛋白氨基酸序列不变的前提下，根据大肠杆菌偏爱密码子将编码重组蛋白的氨基酸序列转化为对应的核苷酸序列，具体序列如序列表SEQ ID No：2所示，并在其上下游分别添加酶切位点BamHI和XhoI对应的核苷酸序列，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。合成后的目的基因克隆于pGH载体(上海捷瑞生物工程有限公司)中。
实施例2：构建重组蛋白表达载体
用限制性内切酶BamHI和XhoI(Thermo scientific Fermentas)于37℃分别对含目的基因的pGH载体和pET-28a(+)载体(德国Novagen公司)进行双酶切2小时，酶切产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳，并分别切胶回收目的基因和pET-28a(+)载体(本发明所使用的胶回收试剂盒均来自于南京天为生物科技有限公司)。使用T4连接酶(Thermo scientific Fermentas)将回收的目的基因和pET-28a(+)载体按一定的比例于4℃连接12小时，然后转化DH5α感受态细胞，并涂布于含卡那霉素抗性(50μg/mL)的LB平板，于37℃恒温培养12小时之后，于平板上提取单克隆菌落至含卡那霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃恒温摇床培养12小时之后，采用质粒纯化试剂盒(本发明所使用的质粒纯化试剂盒均来自南京天为生物科技有限公司)提取质粒，经BamHI和XhoI双酶切鉴定后得到正确的重组表达载体。
实施例3：构建重组蛋白表达菌株
将构建好的重组表达载体转化BL21感受态细胞，并涂布于含卡那霉素抗性50μg/mL)的LB平板，于37℃恒温培养12小时。挑取单克隆菌落至含卡那霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃恒温摇床培养3小时之后，加诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(终浓度1.0mmol/L)诱导表达8小时后制备蛋白电泳样品。15％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明重组蛋白成功表达，得到重组蛋白表达菌株。
实施例4：纯化重组蛋白
接种重组蛋白表达菌株至LB液体培养基进行活化，加卡那霉素至终浓度为50μg/mL，37℃恒温摇床培养过夜，按1：100比例将该菌转接至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，置37℃恒温摇床培养至OD600＝0.6，加诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为1.0mmol/L，继续诱导培养4小时。离心收集菌体，超声破菌，低温离心后去上清通过镍琼脂糖亲和层析柱，经洗涤、洗脱最终得到纯化的重组蛋白(如图1)。
实施例5：杂交瘤细胞株的获得
取6-8周龄雌性Balb/c小鼠，基础免疫每只小鼠皮下多点注射弗氏完全佐剂乳化的100μg重组蛋白。14天后进行第一次加强免疫，方法为取50μg重组蛋白用弗氏不完全佐剂乳化后，皮下多点注射。14天后进行第二次加强免疫，方法为取50μg重组蛋白用弗氏不完全佐剂乳化后，皮下多点注射。14天后，取25μg重组蛋白尾静脉冲击免疫，并于尾静脉冲击免疫72小时后，眼眶取血作为对照，并处死小鼠，取其脾脏制备细胞悬液，细胞计数，按1：5于脾细胞的数量取生长状态良好的sp2/0小鼠骨髓瘤细胞，混和离心后，置37℃水浴中，1分钟内缓慢加入聚乙二醇(PEG-1450，sigma)1mL。静置1分钟后，缓慢加入30mL无血清培养基终止反应，离心，弃上清，加含HAT(H次黄嘌呤、A氨基蝶呤、T胸腺嘧啶核苷)的20％胎牛血清培养基重悬细胞，再加入等体积的饲养细胞，混匀后分置于96孔细胞板(200μL/孔)，于5％二氧化碳培养箱培养。5天后，半保留换液，10天后采用间接酶联免疫吸附法检测96孔细胞培养板中的杂交瘤细胞培养上清。具体方法如下：
重组蛋白经包被液稀释后(终浓度为1μg/mL)，以100μL/孔加入酶标板(南京天为生物科技有限公司)，4℃包被12小时后用洗涤液洗涤四次并拍干；加入封闭液，300μL/孔，37℃封闭2小时，弃孔内液体，用洗涤液洗涤四次并拍干；加待检细胞培养上清及对照血清，100μL/孔，37℃孵育1.5小时后，洗涤液洗涤四次并拍干；加HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠IgG(武汉博士德生物工程有限公司)，100μL/孔，37℃孵育1小时后，洗涤液洗涤四次并拍干；每孔加TMB100μL，37℃避光显色10分钟后，加终止液终止反应，50μL/孔，酶标仪450nm波长空白孔校零后读取OD值。以免疫小鼠的血清作为阳性对照，相关溶液配方如下：
包被液：Na2CO31.5g，NaHCO32.9g，加双蒸水定容至1000mL(pH9.6)。
封闭液：Na2HPO4·12H2O2.68g，NaH2PO4·2H2O0.39g，NaCl8.5g，20g牛血清白蛋白，加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。
洗涤液：Na2HPO4·12H2O2.68g，NaH2PO4·2H2O0.39g，NaCl8.5g，Tween-200.5mL，加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。
终止液：2mol/L H2SO4，21.7mL浓H2SO4加双蒸水定容至1000mL。
对于检测阳性的杂交瘤细胞进行克隆，再使用有限稀释法进行三次亚克隆，从而获得了稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株2E4(CGMCC NO：8412)。
实施例6：单克隆抗体的大量制备及纯化
取8周龄的健康BALB/c雌性小鼠，腹腔注射液体石蜡，每只500μL，7天后腹腔注射杂交瘤细胞2E4(CGMCC NO：8412)(约1×106/只)，10天后，小鼠腹部鼓起，收集腹水，3000rpm离心10分钟，收集上清，按1：4的比例加入60mmol/L pH4.0醋酸缓冲液，用100mmol/L NaOH调pH至4.5。以每毫升腹水上清加入25μL正辛酸的比例，在磁力搅拌条件下缓慢加入正辛酸，在室温条件下继续搅拌30min后，4℃、4000rpm离心30分钟，弃沉淀。将上清液在4℃条件下预冷，以1mL上清液加入0.227g硫酸铵的比例，缓慢加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，室温条件下继续搅拌30min之后，4000rpm离心15分钟，沉淀溶于1/10体积的10mmol/L PBS(pH7.4)缓冲液中，用10mmol/L PBS透析至无硫酸铵，即得到纯化后的单抗。
实施例7：细胞株及抗体的鉴定
a、细胞株稳定性的测定
复苏杂交瘤细胞，并进行连续传代，传至10代，对传代细胞上清进行ELISA法(同实施例5中步骤)检测其效价，结果显示：第10代细胞的培养上清中的抗体滴度约为1：104，与第二代细胞相比无明显差异，表明杂交瘤细胞株2E4(CGMCC NO：8412)稳定性良好，不同传代次数的细胞均能稳定分泌单克隆抗体。
b、杂交瘤细胞染色体的鉴定
采用秋水仙素阻断法，经氯化钾低渗处理、甲醇醋酸固定、吉姆萨染色。在油镜下随机选取50个完整的分裂中期细胞，计数其染色体条数。结果显示(如图2)：杂交瘤细胞的染色体数目为85-105，均大于其亲本细胞(脾细胞染色体为40，SP2/0细胞染色体为72)，表明细胞融合成功。
c、抗体类型和亚类的鉴定
采用小鼠单克隆抗体Ig类和亚类检测抗体，通过间接ELISA法(同实施例5中步骤)进行Ig类和亚类鉴定，结果显示：单克隆抗体重链为IgG2b型，轻链为κ型。
d、抗体效价测定
以纯化后的重组人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白为检测抗原，采用间接ELISA法(同实施例5中步骤)测定实施例6获得的腹水中单克隆抗体的滴度。结果显示：所得腹水中单克隆抗体的滴度在1：108以上。
e、抗体纯度及分子量测定
通过SDS-PAGE电泳(5％的浓缩胶，15％的分离胶)，对实施例6纯化后获得的单抗进行分析，电泳时样品在浓缩胶中80V电泳约20min，当样品进入分离胶后，电压调整为120V，继续电泳约120min至溴酚蓝前沿至凝胶底部。电泳结束后，采用40rpm0.25％考马斯亮蓝R-250染色3h。回收染色液，40rpm脱色至胶背景透明，期间2h换一次脱色液。结果显示(如图3)：纯化后的抗体纯度大于90％，其重链分子量约为50kDa，轻链分子量约为28kDa。
e、抗体特异性的鉴定
Western Blot免疫印迹实验检测本发明单抗与所制备的重组蛋白结合的特异性。按常规方法将SDS-PAGE电泳分离后的蛋白带转移至PVDF膜上，用5％脱脂奶粉4℃封闭过夜，加入实施例6制备的单抗，室温反应2h，TBST洗涤三次。用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG室温反应1h，TBST洗涤三次，采用DBA显色。结果显示(如图4)：本发明中由杂交瘤细胞株2E4(CGMCCNO：8412)分泌的单克隆抗体能够特异性的与重组人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白发生特异性结合，可用于人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白的检测。
Figure ISA0000098236280000011
Figure ISA0000098236280000021

Claims (9)

1.一种重组蛋白，其特征在于该重组蛋白具有如序列表SEQ ID No：1所示的氨基酸序列。
2.一种核苷酸序列，其特征在于该核苷酸序列如序列表SEQ ID No：2所示，可编码权利要求1所述的重组蛋白。
3.一种质粒载体，其特征在于该质粒载体含有权利要求2所述的核苷酸序列。
4.一种菌株，其特征在于该菌株包含权利要求3所述的质粒载体。
5.一种抗人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体，其制备方法包括：合成权利要求2所述的核苷酸序列，并连接到质粒载体上，构建重组蛋白表达载体，转化大肠杆菌，筛选得到重组蛋白表达菌株，大规模培养后，纯化获得重组蛋白，多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到稳定分泌针对人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体细胞株，将杂交瘤细胞注射至小鼠腹腔，取腹水进行纯化，获得抗人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体。
6.权利5所述的单克隆抗体，其特征在于由保藏编号为CGMCC NO：8412的杂交瘤细胞分泌。
7.权利5所述的单克隆抗体，其特征在于其为免疫球蛋白IgG2bκ型。
8.权利5所述单克隆抗体在纯化及检测人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的检测试剂盒为检测人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白的Western Blot试剂、ELISA检测试剂盒。
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