CN102124100B - 特异结合vegf的单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞系与用途 - Google Patents

特异结合vegf的单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞系与用途 Download PDF

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Abstract

一种可特异结合人血管内皮细胞生长因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)的单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞系，该杂交瘤细胞系保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2743。该单克隆抗体的制备方法和体外化学标记处理的该单克隆抗体。以及该单克隆抗体(标记及未标记的)在检测及分离VEGF蛋白中的应用。

Description

特异结合VEGF的单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞系与用途
技术领域：
本发明属于生物技术-单克隆抗体领域。本发明涉及一种可特异结合人VEGF的单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞系与用途。
背景技术：
血管新生或增生(angiogenesis)在生物学上是指体内的已存在的血管(如毛细血管和小静脉)通过出芽或分裂的方式而产生新的血管的过程。血管新生在维持机体的许多正常的生理过程如组织胚胎发育、外伤伤口的癒合与修复等是有益的和必需的。但过度的血管新生或增生也与许多病理变化(如肿瘤的增生扩散，炎症)息息相关。
体内血管能够新生或增生的关键是在于其内衬的血管内皮细胞具有分裂增生及定向迁移置入已有的血管管壁的能力。在各类刺激血管内皮细胞增生的因子中，以血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)尤为重要。事实上，VEGF是目前已知的最强烈的刺激血管内皮细胞分裂增生的因子。VEGF在刺激血管增生中的重要性也已在VEGF基因剔除小鼠的研究中被证实：如只要当VEGF基因中的一份被敲除后，胚胎中的血管即无法正常形成进而导致胚胎在发育至11至12天时即死亡(Carmeliet P等Nature 1996，380：435；Ferrara N等Nature 1996，380：439)。
VEGF一般常由血管内皮细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞所合成，并通过自分泌/旁分泌方式特异地作用于血管内皮细胞上的VEGF受体，而发挥促进血管内皮细胞生长、增殖、迁移、形成等作用。近期研究表明，在多数恶性肿瘤患者的癌组织中也能够检测到VEGF，且VEGF的表达水平增高与肿瘤恶性程度和疾病进展有关(Dvorak HF等：J Exp Med 1991；174：1275-8；Brown LF等Cancer Res1993；53：4727-35；Weidner N，Semple JP，Welch WR及Folkman J：N Engl JMed 1991；324：1-8.4-5)；此外，VEGF在炎症病理的血管中起着重要的作用，如在关节炎病人的关节滑液及组织中(rheumatoid synovial fluids and tissue)以及牛皮藓(psoriasis)病人组织中VEGF水平增高。阻断体内VEGF，从而阻止由VEGF及其受体介导的促血管增生，可达到抑制肿瘤生长与转移，或抗炎症的效果。
在抑制VEGF及其受体介导的血管增生药物研发领域，主要存在两大手段：即：
1)寻找可直接抑制VEGF受体中内在的酪氨酸蛋白激酶活性的物质，该类研发的药物主要是各种小分子物抑制剂如PTK787/ZK 222584(Wood JM等CancerRes 2000，60：2178)；
2)通过抑制VEGF与其受体的结合，从而达到阻止VEGF及其受体介导的促血管增生的作用，该类研发的药物包括各种抗VEGF或抗VEGF受体的抗体，反义寡核苷酸及小分子抑制剂等(Kim KJ等Nature 1993，362：841；Presta LG等Cancer Res，1997，57：4593；Posey JA等Clinical Cancer Research，2003，9：1323)。其中由美国Genentech公司研发、生产并于2004获美国FDA批准上市销售的Bevacizumab(商品名Avastin)就是一种可识别与结合VEGF的人源化的单克隆抗体。Avastin通过中和或清除体内VEGF而达到抑制肿瘤血管生长，进而遏制肿瘤的生长和转移的作用(Presta LG等Cancer Res，1997，57：4593；Hurwitz H等N Engl J Med，2004；350：2335)。
人源化抗体Avastin的前身可追溯到代号为A4.6.1的小鼠单克隆抗体。该A4.6.1小鼠单克隆抗体的来源及分泌它的杂交瘤细胞系与用途在专利号为6,582,959的美国专利(发明人：Kim，Kyung Jin，专利公开日期：June 24，2003，专利名称：Antibodies to vascular endothelial cell growth factor)；及专利号为7,227,004的美国专利(发明人：Kim，Kyung Jin专利公开日期：June5,2007，专利名称：Antibodies to vascular endothelial cell growth factor)中都有所描述。但该抗体还存在如下不足：(1)与大多数的单克隆抗体一样，A4.6.1小鼠单克隆抗体及其人源化抗体Avastin也只是能结合VEGF抗原的部分位点，无法认识或涵盖VEGF上众多的其他抗原位点。(2)进一步的动物实验及临床研究发现仅单独注射A4.6.1小鼠单克隆抗体或其人源化抗体Avastin，无法达到完全中和抑制体内VEGF及其介导的促血管新生。
因此，研发更多新的抗人VEGF的单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞系就显得很有意义与必要。
发明内容：
本发明的一个目的是提供能与天然的VEGF或变性的VEGF特异结合的单克隆抗体。
本发明的另一个目的是提供分泌产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
本发明的再一个目的是提供本发明的单克隆抗体的制备方法。
本发明的另一个目的是提供一种体外化学标记过的单克隆抗体。
本发明的另一个目的是提供本发明的单克隆抗体在检测VEGF蛋白中的应用。
本发明的另一个目的是提供体外化学标记过的单克隆抗体在检测VEGF蛋白中的应用。
本发明的另一个目的是提供本发明的单克隆抗体在分离VEGF蛋白中的应用。
本发明选取重组人VEGF蛋白为免疫原，通过反复多次小剂量的小鼠皮下免疫，获得分泌高效价的抗VEGF多克隆抗体；再从中挑取小鼠，取其脾脏细胞，通过体外与小鼠骨髓瘤细胞融合、再经药物筛选及亚克隆等步骤而建立了多株稳定分泌抗人VEGF抗体的杂交瘤单克隆细胞。其中一代号为M23杂交瘤细胞株，经ELISA、免疫印迹、免疫组化等多种方法鉴定，证实其所分泌的单克隆抗体能够特异识别并结合人VEGF(包括VEGF121、VEGF165及VEGF189等)。体外研究还证明该单克隆抗体可竞争抑制VEGF受体与其配体(即VEGF)的结合。
在本发明的一方面，提供一种可分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系，该杂交瘤细胞系代号为M23，已于2008年11月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.2743，保藏地点：中国，北京。
在本发明的另一方面，提供一种可特异结合VEGF蛋白的单克隆抗体，由上述保藏编号为CGMCC No.2743的杂交瘤细胞系分泌产生。
在本发明的另一方面，提供一种上述单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：步骤1、制备重组人VEGF蛋白为免疫原；步骤2、动物免疫：通过反复多次小剂量的小鼠皮下免疫，获得分泌高效价的抗人VEGF多克隆抗体；步骤3、从中挑取小鼠，取其脾脏细胞，通过体外与小鼠骨髓瘤细胞融合；步骤4、酶联免疫吸附试验筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞；步骤5、阳性杂交瘤细胞经亚克隆鉴定得到多株稳定分泌抗人VEGF抗体的杂交瘤单克隆细胞；步骤6、将杂交瘤细胞扩增培养，收集培养液，采用亲合层析法分离纯化抗人VEGF单克隆抗体。
其中，步骤1具体为：PCR扩增得到编码人VEGF的基因片断，将其克隆到酵母表达载体pPi9K载体中，获得表达质粒pPi9K-VEGF，转化酵母菌，筛选出高效表达工程菌株，工程菌株经发酵、诱导表达、分离纯化后，获得纯度95％以上的VEGF蛋白。
其中，步骤2所述小鼠皮下免疫的方法为：将所述纯化的重组人VEGF蛋白与弗氏完全佐剂混合，于皮下多点注射小鼠。
其中，步骤6所述的亲合层析法具体为：将含单克隆抗体的杂交瘤细胞滤液上清上样于预先填充有共价交联了重组人VEGF蛋白的微粒珠亲合层析柱中；上样完毕，亲合层析柱以PBS洗脱去除杂蛋白，再以甘氨酸液洗脱被微粒珠吸附的抗体蛋白，再透析；透析后的样品再经过滤后即获得纯化的抗VEGF单克隆抗体。
在本发明的另一方面，提供一种体外化学标记过的上述单克隆抗体，其标记步骤如下：
1)、溶解上述单克隆抗体于PBS中；
2)、加入适量的标记试剂与单克隆抗体样品混合，并混匀，在室温下反应；
3)、通过透析或脱盐等方法去除未反应的过量标记试剂，即得到体外化学标记过的单克隆抗体。
在本发明的另一方面，提供一种上述单克隆抗体在检测VEGF蛋白中的应用。本发明进一步确认了上述单克隆抗体用于检测体液或病变组织中的VEGF蛋白的表达。例如用该单克隆抗体作为试剂用以体外定量检测各种体液如血液、血浆、血清、尿、淋巴液或脑脊液中的VEGF的水平，或检测各种生物材料如细胞培养上清液、组织细胞裂解物中的VEGF的水平；或该单克隆抗体作为试剂用于免疫组化等方法来定性或定量检测各种病变器官组织的VEGF蛋白的表达，或各种疾病下如肿瘤(肿瘤增生早期及扩散期等)、炎症(如关节炎、系统性红瘢狼苍等)患者外周血液中VEGF的水平表达，以作为临床诊断或辅助诊断的一个标志。
在本发明的另一方面，提供一种上述体外化学标记过的单克隆抗体在检测VEGF蛋白中的应用。标记的(如生物素、放射素或荧光素如FITC等标记)抗VEGF的单克隆抗体为探针显影剂，用于免疫荧光实验、放射自显影或其他显影方法来定位或定量检测各种疾病如肿瘤或炎症患者的组织器官中的VEGF表达水平，以辅助临床诊断。
在本发明的另一方面，提供一种上述单克隆抗体在分离VEGF蛋白中的应用。利用该单克隆抗体制备免疫亲和层析柱，来分离纯化VEGF蛋白。
本发明的单克隆抗体还可作为VEGF的拮抗剂，用于药理学等基础医学研究。此外，分泌该抗体的M23杂交瘤细胞系，可用来分离纯化mRNA，再以RT-PCR等方法从中克隆和扩增出编码M23抗体的轻链和重链可变区的基因。扩增获得的抗体轻链和重链可变区基因可用于制备单链抗体、Fab片断、人-鼠嵌合抗体或者人源化抗体等各种基因工程抗体。M23抗体或其衍生体(如抗体片段、嵌合抗体、人源化抗体、放射药物标记抗体等)作为单独成分，或与其他药物合并使用，可用于制备与VEGF高表达有关的病变(如肿瘤的增生扩散、炎症等)的治疗药物或制剂。
附图说明：
图1为实施例1中以ELISA法鉴定证明M23杂交瘤细胞的培养上清液中(m23)含有与重组VEGF165蛋白高亲合结合的单克隆抗体的实验结果示意图，其中，X653代表未融合的P3X63.Ag8.653骨髓瘤细胞培养上清液，为阴性对照。
图2为实施例2中SDS-PAGE分析经VEGF亲合层析柱纯化的M23抗体蛋白在DTT还原条件下的电泳实验结果示意图。其中泳道1、2、3、4分别表示同一批次产品的四个平行上样(每泳道上样的蛋白量相同，为5μg)。M23抗体蛋白来源于M23杂交瘤细胞的培养上清液中。
图3为实施例3中以免疫印迹(Western-blot)分析检测M23杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体与重组VEGF165蛋白(还原的及未还原的)结合反应的实验结果示意图。其中泳道1(未还原的VEGF165蛋白)及泳道2(还原的VEGF165蛋白)为以M23单克隆抗体检测的结果；泳道3(未还原的VEGF165蛋白)及泳道4(还原的VEGF165蛋白)为以兔多克隆抗体检测的结果。
图4为实施例4中以ELISA法鉴定M23单克隆抗体反应特异性的实验结果示意图，结果证明M23单克隆抗体能与VEGF165蛋白结合，但不与胎盘生长因子(PLGF)蛋白结合。
图5为实施例5中以纯化的M23单克隆抗体为试剂成分，用于免疫组化检测转染CHO(中国仓鼠卵巢细胞)细胞中VEGF蛋白(VEGF121、VEGF165及VEGF189)的表达示意图；其中图5A为转染有含VEGF121基因质粒的细胞，图5B为转染有含VEGF165基因质粒的细胞；图5C为转染有含VEGF189基因质粒的细胞；图5D为转染有空白对照质粒的细胞。
图6为实施例6中用生物素标记的M23单克隆抗体(Biotin-m23，起始稀释溶度为1∶8000)ELISA法来检测包被在96-孔酶标板上的VEGF的抗体稀释度-反应曲线。
图7为实施例7中竞争性ELISA法检测生物素标记的M23单克隆抗体与VEGF受体蛋白(F2K3Fc)竞争结合VEGF的实验结果示意图。PLGF蛋白为阴性对照。
图8为实施例8中以M23单克隆抗体为试剂，用于免疫组化检测分析人类病理组织切片中的VEGF蛋白的实验结果示意图。其中图8A为人胃腺癌组织切片；图8B为人淋巴结组织切片。
实现本发明的最佳方式：
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：稳定分泌抗VEGF单克隆抗体的杂交瘤细胞系的建立与筛选鉴定
步骤1.重组人VEGF165蛋白(免疫抗原)的制备(采用申请号为2007100473522，发明名称为“重组人血管内皮细胞生长因子的分离纯化、体外化学标记及其应用”的中国发明专利申请所记载的方法制备)：
利用PCR技术从人肺组织细胞cDNA文库中扩增得到编码人VEGF165完整开放读码框架序列(open-reading frame，ORF)的基因片断，经序列测定鉴定正确，用限制性内切酶处理后，将其克隆到酵母表达载体pPi9K(Invitrogen公司)载体中。获得表达质粒pPi9K-VEGF165，转化毕赤酵母菌，筛选出高效表达工程菌株。工程菌经发酵、诱导表达，分离纯化后，获得纯度90％以上的VEGF165蛋白。
步骤2、动物免疫：
将上述纯化的重组人VEGF165蛋白与弗氏完全佐剂混合，于皮下多点注射C57BL/6小鼠(100ul/只，共10ug VEGF165蛋白)。首次免疫2-3周后，小鼠再给予皮下多点注射VEGF165蛋白与不完全佐剂混合液加强免疫。加强免疫2-3次后，取少量小鼠血清，用包被VEGF165蛋白的96-孔酶标板以ELISA法检测小鼠血清中抗VEGF蛋白抗体的效价，效价高者小鼠脾细胞用于下一步的细胞融合。
步骤3、细胞融合：
在VEGF165蛋白末次免疫后3天，无菌制备小鼠脾细胞悬液，与P3X63.Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞(购自中国科学院上海生命科学院细胞保藏中心)以10∶1的比例在50％PEG-1500(美国Sigma公司产品)作用下融合。融合按常规法(Kohler G.and Milstein C：Nature 1975；256：495-497)，PEG用量1ml，1分钟内缓慢加完。反应90秒后，以无血清的RPMI-1640培养基终止反应，1000rpm离心10 min，去除上清液，再将离心沉淀下的细胞以含10％HAT(H为次黄嘌呤、A氨基碟呤、T胸腺嘧啶核苷，为Sigma公司产品)的RPMI 1640-10％FCS培养基将细胞浓度调节至1X106/ml，加入96孔平底细胞培养板(每孔200ul)，于37℃，5％CO2培养箱中培养2-3周。
步骤4、酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞：
以重组人VEGF165蛋白(5μg/ml，pH 9.6，0.1 M NaHCO3液)包被酶标板，37℃包被2小时或4℃过夜；2％牛血清白蛋白(BSA)封闭，4℃过夜。经PBS-0.1％Tween20液洗涤后加入待检杂交瘤细胞培养上清(以未融合的P3X63.Ag8.653骨髓瘤细培养上清为阴性对照)37℃孵育2小时；经PBS-0.1％Tween20液洗涤后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠Ig(Sigma公司产品)，37℃孵育1小时；再经PBS-0.1％Tween20液充分洗涤后，加入邻苯二胺(OPD)-0.1％H2O2底物液显色10-15min，以0.1M HCl终止反应。在MK3Multiskan酶标仪(Thermo Scientific公司产品)中读取492nm处OD值。测得的OD 492值比阴性对照高5-10倍的杂交瘤细胞再克隆化，并进行扩增冻存。
步骤5、阳性杂交瘤细胞的克隆化-有限稀释法
将上述初筛得到的阳性细胞以RPMI-1640-10％FCS培养基稀释至每孔1-10个细胞，铺于96-孔细胞培养板，于37℃，5％CO2培养箱中培养2-3周。待克隆长成，取上清液以ELISA再次检测鉴定抗VEGF抗体的分泌。经检测鉴定，获得多个抗体分泌阳性细胞株。其中，经再次亚克隆鉴定，获得了一株代号为M23的稳定分泌抗VEGF单克隆抗体的杂交瘤细胞株。图1为以ELISA法鉴定检测M23杂交瘤细胞上清液与重组VEGF165蛋白结合，结果证明该杂交瘤细胞上清液含高效价抗VEGF165蛋白的单克隆抗体。该单克隆抗体经鉴定为IgG1类。该杂交瘤细胞株再经大量扩增、长期传代培养并冻存，于2008年11月14日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.2743。
实施例2.抗VEGF单克隆抗体的体外制备及纯化
将建立的M23杂交瘤细胞于无血清培养基中扩增培养，待细胞浓度达105/ml以上时停止加液，再持续培养直至细胞培养液变黄。收集培养液，1500rpm离心10分钟，上清液再经0.45μm滤膜过滤后于4℃或-20℃保存备用或直接用于下一步的单克隆抗体的分离纯化。
在本实施例中，抗VEGF单克隆抗体(M23)的分离纯化采用亲合层析法。其纯化步骤为：将含M23单克隆抗体的杂交瘤细胞滤液上清上样于预先填充有共价交联了重组人VEGF165蛋白(由实施例1制备)的4％琼脂糖微粒珠(agarose beads，美国Sigma公司产品)的亲合层析柱中(1L/10ml层析柱)；上样完毕，亲合层析柱以PBS洗脱去除杂蛋白，再以低pH(2.7)甘氨酸(0.1M)液洗脱被吸附的抗体蛋白。洗脱液以1mol/L Tris(pH 9.0)调节pH至7.0，再对10倍的体积的1xPBS透析12～16小时后(期间换液2-3次)，透析后的样品再经0.45μm滤膜过滤后即获得纯化的抗VEGF单克隆抗体。
将纯化的抗体按常规方法进行SDS-PAGE电泳(分离胶为10％，浓缩胶5％)鉴定。图2为在DTT还原条件下的SDS-PAGE电泳结果，其中处于上面的条带代表M23抗体重链，处于下面的条带代表M23抗体轻链。
实施例3.免疫印迹(Western blot)鉴定分析M23单克隆抗体与重组人VEGF165蛋白的结合
图3为免疫印迹(Western blot)实验检测纯化的M23单克隆抗体与人VEGF165蛋白的特异结合反应的实验结果。本实施例中用于鉴定分析M23单克隆抗体特异性的VEGF蛋白来源于大肠杆菌表达的重组人VEGF165蛋白(购自于美国R and D Systems公司)。该VEGF165蛋白先溶于PBS-1％BSA液中(50μg/ml)，每道上样10μl进行15％SDS-PAGA电泳，按常规方法将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上(Millipore公司产品)，用5％脱脂奶粉在4℃封闭过夜，加入由实施例2制备的M23单抗，阳性对照加入兔抗人VEGF多克隆抗体(美国Santa CruzBiotechnology公司产品)，室温反应2小时，用TBS-T(pH 7.5，0.05mol/lTris-Hcl，0.15mol/l NaCl，0.05％Tween-20)洗涤3次，随后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG或羊抗兔IgG(Sigma公司产品)，室温反应1h，用TBS-T洗涤三次。最后加DAB-0.1％H2O2底物液显色10-15min。结果如图3所示，M23单抗与还原的(泳道1)及未还原的重组VEGF165蛋白(泳道2)都有很强的特异性反应；而与泳道中的BSA等其他蛋白无交叉反应。此免疫印迹结果与使用兔抗人VEGF多克隆抗体为阳性对照的检测结果(泳道3及泳道4)一致。
因此，与ELISA结果相符合，免疫印迹(Western blot)实验结果再次证明M23细胞株产生的单克隆抗体能与人VEGF165蛋白结合。
实施例4、M23单克隆抗体的反应特异性测定
鉴于人胎盘生长因子(placental growth factor，PLGF)蛋白与人VEGF165蛋白同族，且两者具有50％以上相同的序列；在本实施例中，用分别包被了重组人VEGF165蛋白(实施例1制备)或重组PLGF蛋白(购自美国R and D Systems公司)的96-孔板，采用ELISA方法来鉴定M23单克隆抗体的反应特异性。ELISA试验步骤同实施例2。ELISA检测结果如图4：在包被VEGF165蛋白(5μg/ml，50μl/孔)的样品孔中，加入M23单克隆抗体及HRP标记的羊抗小鼠Ig与底物后，显色反应呈明显阳性，且显色强度(OD 492值)与加入孔中的M23单克隆抗体的溶度呈明显正相关；而在包被相同量(5μg/ml，50μl/孔)的PLGF蛋白样品组，无明显显色。此结果证明M23单克隆抗体能与VEGF蛋白结合，但不能与PLGF蛋白结合。
实施例5.免疫组化检测M23单克隆抗体与VEGF121、VEGF165及VEGF189蛋白的结合
在本实施例中，M23单克隆抗体作为第一抗体试剂用于免疫组化来检测表达在转染细胞中的各种VEGF蛋白  (如VEGF121、165及189等)。为此，取对数生长期的CHO细胞，胰酶/5mM EDTA常规消化后，以1×105细胞/孔接种24-孔培养板，37℃，5％CO2培养过夜；  第2天，在100μL无血清、无抗生素的DMEM加入2μL fugen6(购自Roche-上海公司)与含重组人VEGF基因(VEGF121、VEGF165及VEGF189)的质粒DNA或对照空载体质粒DNA(1-2μg)混匀，制备成fugen6-DNA混合液，室温放置15 min后，滴加至CHO细胞中；在转染48h后，CHO细胞经1xPBS液漂洗及90％methanol 4℃20 min固定后，加入M23单克隆抗体(1∶100稀释，200 ul/孔)，37℃1 h，以PBS液洗脱，再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠Ig(1∶200稀释，200 ul/孔)，37℃1 h，再以PBS液洗脱，然后加入显色液(DAB-3％H2O2)室温5-10min。PBS液漂洗终止反应，置于显微镜下观察显色反应。结果如图5所示：在分别转染有VEGF121(图5A)、VEGF165(图5B)及VEGF189(图5C)表达质粒的样品孔，有近5-10％的细胞显色阳性，而转染有空载体对照(图5D)的样品无显色阳性细胞。此实验结果证明M23单克隆抗体不但能识别用于免疫的VEGF165蛋白，而且也能识别VEGF121及VEGF189蛋白。
实施例6 M23单克隆抗体的体外生物素标记处理
在本实施例中，用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯酰活化的生物素(Biotin)(购自美国Pierce公司)作为化学标记试剂来标记M23单克隆抗体蛋白。在pH7-9的缓冲液中，NHS活化的生物素能够非常有效的与蛋白质的伯氨基(-NH2)反应，形成稳定的酰胺键。在本实施例中，采用的生物素标记试剂与M23单克隆抗体蛋白的反应摩尔比为50∶1；其标记步骤如下：
1)、溶解M23单克隆抗体于PBS中；
2)、按上述计算结果，加入适量的标记试剂(NHS-生物素)与M23单克隆抗体样品混合，并混匀；室温反应30-60分钟；
3)、通过透析或脱盐去除未反应的过量生物素，即得到生物素标记的M23单克隆抗体(Biotin-M23)。
生物素标记的M23单克隆抗体(Biotin-M23)如与辣根过氧化物酶或荧光等标记的Avidin合并使用，可组成试剂盒，用于定性或定量检测VEGF蛋白。图6为用包被人VEGF165蛋白(5μg/ml，50ul/孔)的酶标版，以生物素标记的M23单克隆抗体(Biotin-M23，起始稀释度为1∶8000，)为第一抗体，以辣根过氧化物酶标记的Avidin(购自美国Vector Laboratories公司，稀释度为1∶5000)为检测试剂，测得的稀释度-反应曲线。结果表明生物素标记的M23抗体在很高的稀释度(1∶8000至1∶80000之间)下还保持与VEGF蛋白的高亲合力结合。
实施例7竞争性ELISA实验检测M23单克隆抗体与VEGF受体竞争结合VEGF
M23单克隆抗体与VEGF受体蛋白竞争结合VEGF的实验采用竞争性ELISA法来测试。
该竞争性ELISA法检测步骤如下：
1)用重组人VEGF165蛋白包被96-well板(2μg/ml，50μl/孔)，4℃过夜；
2)经PBS液漂洗及2％BSA(in PBS-0.1％tween20液)室温封闭后，分别加入固定溶度(1∶8000)的生物素标记的M23单克隆抗体(Bio-M23)与不同溶度的VEGF受体蛋白(该受体蛋白代号为F2K3Fc，是由VEGF受体胞膜外区与人免疫球蛋白Fc段相连的融合蛋白，采用申请号为20081001915922，发明名称为“可结合血管内皮细胞生长因子及胎盘生长因子的重组蛋白及其制备方法与应用”的中国发明专利申请记载的方法制备)；或固定溶度(1∶8000)的生物素标记的M23单克隆抗体(Bio-M23)与不同溶度的对照蛋白(为PLGF)，37℃孵育2 h；
3)经PBS-T洗脱后，加入辣根过氧化物酶标记的(1∶5000)，37℃孵育1h；
4)经PBS-T洗脱后，加入显色液(邻苯二胺)-3％双氧水，室温10min，至显色；
5)加入HCL终止反应，以酶联免疫仪测定测定492nm波长处各孔的吸光值。
竞争性ELISA结果如图7所示：在加入生物素标记的M23单克隆抗体与不同溶度的未标记的VEGF受体蛋白(即F2K3Fc&Bio-M23)样品组中，其OD值与加入的未标记VEGF受体蛋白的量成反比关系：即加入的未标记VEGF受体蛋白的量越高，其OD值越低。而在加入生物素标记的M23单克隆抗体与不同溶度的未标记的PLGF蛋白(即PLGF&Bio-M23)样品组中，其OD值与加入的未标记的PLGF蛋白量关系不大。此结果表明M23单克隆抗体与VEGF受体蛋白竞争结合VEGF。
实施例8 M23单克隆抗体用于免疫组化检测病理组织切片中的VEGF
本发明的M23单克隆抗体还用于免疫组化检测各种病理组织切片样品中的VEGF蛋白。
免疫组化检测病理组织切片中的VEGF蛋白的步骤如下：
1)病理组织切片(购自陕西西安超英生物技术有限公司)在60℃中烤片30分钟，常规脱蜡水化；
2)抗原修复：高压修复抗原2分钟，冷却至室温，PBS洗5分钟×2次；
3)滴加过氧化物酶阻滞剂(Peroxidase Blocking Solution)室温30分钟；
4)滴加1抗：检测抗体M23单克隆抗体和阴性对照抗体(均为1∶10稀释)4℃冰箱过夜；
5)0.1％Tween-PBS洗5分钟×3次；
6)滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠Ig多克隆抗体，室温30分钟；
7)0.1％Tween-PBS洗5分钟×3次；
8)DAB显色，蒸馏水洗终止显色；
9)苏木素复染、水洗、分化后充分水洗返蓝；
10)常规脱水透明，中性树胶封片，于显微镜下观察与摄相纪录结果。
图8为部分病理组织切片检测结果照片。其中图8A为人胃腺癌组织切片；图8B为人淋巴结组织切片；结果表明两组织切片中都检测到VEGF蛋白的表达。
Figure WB000000018416100002000141
关于微生物保藏的说明
(细则13之二)
Figure WB000000018416100002000142

Claims (6)

1.一种分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其保藏编号为CGMCCNo.2743。
2.一种特异结合VEGF的单克隆抗体，由权利要求1所述的杂交瘤细胞系分泌产生。
3.一种体外化学标记过的权利要求2所述的单克隆抗体，其标记步骤如下：1)、溶解权利要求2所述的单克隆抗体于PBS溶液中；2)、加入有效量的标记试剂与单克隆抗体样品混合，并混匀，在室温下反应；3)、去除未反应的过量标记试剂，即得到体外化学标记过的单克隆抗体。
4.权利要求2所述的单克隆抗体在检测VEGF蛋白中的应用，所述应用不包括在疾病诊断和治疗上的应用。
5.权利要求3所述的体外化学标记过的单克隆抗体在检测VEGF蛋白中的应用，所述应用不包括在疾病诊断和治疗上的应用。
6.权利要求2所述的单克隆抗体在分离VEGF蛋白中的应用。
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