CN101724073A - 一种广谱抗ras基因表达蛋白的单克隆抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种广谱抗ras基因表达蛋白的单克隆抗体，该抗体通过杂交瘤技术融合骨髓瘤细胞及免疫后小鼠的脾脏淋巴细胞而获得；免疫小鼠用蛋白为原核表达基因工程细菌生产，经蛋白提取及纯化后产物；原核表达P21ras蛋白的基因工程菌由聚合酶链反应扩增和人工合成的三种ras基因的蛋白表达区全序列与表达载体连接构建重组质粒，转化相应受体菌而获得；该单克隆抗体定量检测正常、恶性转化前及恶性病变中P21ras蛋白表达水平，可用于研究肿瘤的发病机制和进展规律，以该单抗为基础进一步构建能在细胞内稳定表达的细胞内抗体则能用于P21ras蛋白表达增高的各类肿瘤的靶向治疗。

Description

一种广谱抗ras基因表达蛋白的单克隆抗体及其制备方法

技术领域

本发明属于医学生物学领域，尤其涉及一种广谱抗ras基因表达蛋白的单克隆抗体及该抗体的制备方法。

背景技术

Ras基因是一种重要的细胞原癌基因，其命名来自大鼠肉瘤的英文rat sarcoma。Ras基因家族包括三个主要成员，即H-Ras、K-Ras和N-Ras，分别定位于第12、11和1号染色体，编码由188-189个氨基酸组成的分子量约为21KD的蛋白质，即P21Ras蛋白，三种P21Ras蛋白的氨基酸序列约有85％的同源性。P21Ras蛋白作为极其重要的信号转导传递蛋白调节细胞的正常分化和增殖。

P21Ras蛋白合成后，其羧基端必须经过复杂的翻译后修饰，使其准确定位于细胞膜的内侧面才能发挥其生物学功能。P21Ras蛋白有自身GTP水解酶活性，可分别与GTP和GDP结合，P21Ras蛋白中GTP结合与在GTP酶激活蛋白作用下水解为GDP之间的循环形成了一种分子开关机制，即通过鸟嘌呤核苷酸不同形式的结合形成不同的激酶构象，也即Ras蛋白的活性和非活性形式。P21Ras蛋白在细胞外生长信号刺激下与GTP结合成为活性状态的P21Ras-GTP形式，从而激活Ras蛋白下游众多信号通道，促进细胞分裂、增生，抑制细胞凋亡，使细胞间接触抑制减弱。

当ras基因发生突变或P21Ras蛋白过表达或GTP酶激活蛋白缺失或生长因子受体活化及ras下游效应子的突变或扩增，均可导致细胞恶性转化并促进恶性肿瘤细胞的浸润和转移。研究表明，大约30％的人类肿瘤中存在ras基因突变或ras蛋白过表达，部分学者认为ras蛋白主要在肿瘤形成的早期阶段充当重要作用。

肿瘤生物治疗成为继手术、放疗和化疗之后的第四种治疗模式。肿瘤生物治疗方法主要有细胞因子技术、过继免疫疗法、抗体药物、肿瘤疫苗技术及基因治疗等。其中抗体药物主要有鼠源性单抗、人源化鼠单抗、完全人源化抗体等。用于临床的单抗及其改型药物已有20多种，进行临床试验和临床前研究的有几百种。制备针对P21Ras蛋白靶点的单克隆抗体并进一步构建细胞内抗体，可以拮抗过表达的ras蛋白，抑制组织的恶性转化而起到积极的预防肿瘤发生作用，对相应过表达ras蛋白的肿瘤则起到积极的靶向抗癌作用。

经检索尚未见公开出版物登载有与本申请专利技术方案相同的报导。

发明内容

本发明提出一种广谱抗ras基因表达蛋白的单克隆抗体及该抗体的制备方法，尤其涉及ras基因的全蛋白表达序列原核表达重组质粒的构建，本发明要解决的技术问题之一是提供三种重组质粒，重组质粒分别含有H、K、N-ras基因的CDS区(蛋白表达区)全长序列及表达载体PET-28a(+)序列。

本发明要解决的技术问题之二是提供转化有上述重组质粒的原核表达重组蛋白的工程菌株。菌株经双酶切和测序证实正确。

本发明要解决的技术问题之三是提供分泌广谱抗三种ras蛋白的杂交瘤细胞株。

本发明要解决的技术问题之四是提供构建上述杂交瘤细胞株的方法。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

一种广谱抗ras基因表达蛋白的单克隆抗体，其特征在于：抗ras基因全蛋白表达序列(CDS)的单克隆抗体，广谱拮抗H、K、N-ras三种基因的表达蛋白；该单克隆抗体用于ras基因表达蛋白(P21ras)的组织或肿瘤的诊断性实验和发病机制研究，或用于构建单链抗体、细胞内抗体等小分子抗体并用于表达P21ras肿瘤的治疗性研究。

所述的广谱拮抗H、K、N-ras三种基因的表达蛋白的单抗，其中K、N-ras基因的全蛋白表达序列(CDS)通过人工合成方式获得。

所述的H-ras基因的全蛋白表达序列(CDS)通过RT-PCR从肝癌细胞株中获得，RT-PCR反应所用的引物编号为：NM-H-RAS。

所述的单克隆抗体与细胞或组织内的ras基因表达蛋白(P21ras)进行免疫细胞/组织化学染色而显示。

所述的单克隆抗体用于表达ras基因表达蛋白的正常或肿瘤组织的诊断性实验或作为其他小分子抗体研究的基础材料或进一步用于表达P21ras的肿瘤的治疗。

一种广谱抗ras基因表达蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征是：用原核表达的H、N、K三种ras基因的表达蛋白免疫小鼠后，通过免疫后小鼠的脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞而获得单克隆抗体。

所述的H、N、K三种ras基因的表达蛋白由原核表达基因工程大肠杆菌BL21(DE3)生产，经蛋白提取及纯化后获得。

所述的基因工程细菌通过转化三种原核表达重组质粒获得，三种原核表达重组质粒是H、N、K三种ras基因的全蛋白表达序列(CDS)片段分别与表达质粒PET-28a(+)连接获得；各重组质粒上携带有组氨酸(His)标签便于后续融合蛋白的纯化。

所述的H、K、N-ras基因的获得

H-ras基因经RT-PCR技术从肝癌细胞株中获得，K、N-ras基因根据基因文库(gene bank)中分别编号为M54968和BC005219利用全基因合成技术人工合成其cDNA的CDS段，即蛋白编码区。H-ras基因从肝癌细胞株7703中获取，经提取其总RNA后逆转录合成对应的互补DNA。以互补DNA为模板PCR扩增并加入BamHI和HindIII酶切位点。三种ras基因PCR扩增产物经双酶切后与同样双酶切的表达质粒PET-28a(+)连接后构建，质粒PET-28a(+)的物理图谱及限制性内切酶酶切位点见附图1、2。重组质粒转化感受态细菌DH5α后铺筛选平板，单菌落的菌液震荡培养后提取质粒并经双酶切及测序证实正确，测序结果见附图3、4、5。

所述的转化有上述重组质粒的原核表达重组基因工程菌株的获得：

上述三种重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，利用质粒PET-28a(+)的抗卡那霉素特性铺含有该抗生素的LB培养平板后，挑取单菌落摇菌培养，菌液加终浓度为35％的甘油放-80度冰箱保存。

所述的重组H、K、N-ras蛋白的诱导表达、纯化及鉴定：

转化有三种重组质粒的大肠杆菌菌株BL21(DE3)接种含卡那霉素的LB平板，过夜培养。挑单菌落培养4-5小时后，加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养16小时，利用重组蛋白携带的His-tag，用Ni²⁺-NTA亲和柱纯化目的蛋白。纯化后产物进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白表达量及纯度。三种目的蛋白经梯度尿素透析液进行透析复性，复性产物进行Western blot及免疫新西兰大白兔的免疫原性检测证实其具有良好免疫原性且三种多克隆血清抗体之间有良好的交叉反应，结果见附图6。

所述的广谱抗三种ras蛋白的单克隆抗体的制备及初步鉴定：

用原核表达的H-ras蛋白免疫Balb/c小鼠，6周后取其脾脏淋巴细胞与骨髓瘤细胞SP2/0细胞进行融合。经次黄嘌呤氨基蝶呤胸腺嘧啶脱氧核苷培养液(HAT)选择性培养出融合成功的细胞群落。间接酶联免疫吸附试验法(ELISA)筛选抗三种ras蛋白的杂交瘤细胞株群落，有限稀释法单克隆化筛选出的杂交瘤细胞株，四次筛选后建立稳定表达抗三种ras蛋白的细胞株5株，克隆号顺序编为KGH-R1、KGH-R2、KGH-R3、KGH-R4、KGH-R5。建株后的杂交瘤细胞株注射入小鼠腹腔进行诱导成瘤实验制备大量腹水并间接ELISA法测其效价，见附图7，染色体数目检测确认融合成功，见附图8，免疫层析实验进行抗体亚型分析见附图9。

所述的广谱抗三种ras蛋白的单克隆抗体的特异性及敏感性检测：

杂交瘤细胞培养上清进一步进行Western blot鉴定其特异性见附图10。以5株杂交瘤细胞的培养上清作为一抗，对19株肿瘤细胞株进行免疫细胞化学检测，见附图11。对人体各系统常见的癌肿及正常组织进行免疫组织化学检测，见附图12、13、14。结果显示构建的单克隆抗体的敏感性及特异性均较高，可用于临床诊断性实验。

本发明提供的这种广谱抗ras基因表达蛋白的单克隆抗体，通过杂交瘤技术融合骨髓瘤细胞及免疫后小鼠的脾脏淋巴细胞而获得；免疫小鼠用蛋白为原核表达基因工程细菌生产，经蛋白提取及纯化后产物；原核表达P21ras蛋白的基因工程菌由聚合酶链反应扩增和人工合成的三种ras基因的蛋白表达区全序列与表达载体连接构建重组质粒，转化相应受体菌而获得；该单克隆抗体定量检测正常、恶性转化前及恶性病变中P21ras蛋白表达水平，可用于研究肿瘤的发病机制和进展规律，以该单抗为基础进一步构建能在细胞内稳定表达的细胞内抗体则能用于P21ras蛋白表达增高的各类肿瘤的靶向治疗。

附图说明

图1PET-28a(+)物理图谱；

图2PET-28a(+)限制性内切酶酶切位点；

图3H-ras-PET-28a(+)测序部分序列；

图4K-ras-PET-28a(+)测序部分序列；

图5N-ras-PET-28a(+)测序部分序列；

图6P21ras的Western blot分析，其中，

M：低分子量蛋白标准(Marker)，

泳道1-3：分别为纯化后的H，K，N-P21ras蛋白，

泳道4：阴性对照为不含重组质粒的空白细菌诱导后的上清；

图7腹水抗P21ras单克隆抗体效价测定，其中，

图A：检测两株杂交瘤细胞诱导的腹水，稀释倍数依次为1∶300、1∶600、1∶1200、1∶2400、1∶4800、1∶9600、1∶19200、1∶38400、1∶76800、1∶153600，

图B：检测四株杂交瘤细胞诱导的腹水，稀释倍数依次是1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000、1∶64000、1∶128000；

图8杂交瘤细胞染色体检测：瑞士染色400×，染色体数目约为97条；

图9抗P21ras单克隆抗体免疫蛋白类型及亚型检测；

图10抗P21ras单克隆抗体的Western blot检测，其中，

泳道1-3：分别为原核表达的P21ras-H，K，N蛋白，

泳道4-10：分别为肿瘤细胞株QGY7703，T24，Hep2，SKOV3，HCT116，SMMC7721，BGC853提取的蛋白；

图11抗P21ras-H、N、K单克隆抗体对肿瘤细胞株免疫组化染色结果，其中，图A、B、C、D分别为HCT116、QGY7703、BGC853、SKOV3细胞株ICC染色SP法400×(胞质和胞膜阳性，细颗粒状)；

图12抗P21ras-H、N、K单克隆抗体对乳腺癌组织免疫组化结果，SP法200×400×(胞质和胞膜阳性，细颗粒状)；

图13抗P21ras-H、N、K单克隆抗体对膀胱癌组织免疫组化结果，SP法200×400×(胞质和胞膜阳性，细颗粒状及环胞膜深染状)；

图14抗P21ras-H、N、K单克隆抗体对结肠癌组织免疫组化结果，SP法200×400×(胞质和胞膜阳性，细颗粒状及点彩状)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(上、下册)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：目的基因的获取

1.1H-ras基因的获取

1.1.1肝癌细胞株的培养

取出液氮中冻存的肝癌细胞株7703，立即置于37℃水浴槽中复苏，当细胞快速解冻后，将细胞转入50ml的细胞培养瓶中，加入10ml含10％新生牛血清和100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的RPMI1640培养基。于恒温孵箱中37℃，5％CO₂的条件下进行培养。传代培养至细胞数达到10⁸后，加4ml预热的含0.02％胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸)消化细胞约10分钟(37℃)，冲洗脱落下来的细胞转入灭菌15ml离心管中，5000rpm离心5分钟，收集细胞沉淀。

1.1.2总RNA的提取

TRIzol(mrcgene公司Cat.NO.TR118 Lot NO.3691)法提取细胞总RNA，步骤按试剂盒说明书进行。

1.1.3cDNA的合成

1％琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA的纯度及浓度后，立即进行逆转录实验(RT)，步骤按试剂盒(Fermentas，Revert AidTM H Minus First Strand Cdna Synthesis Kit#K1632Lot：00030672)说明书提供的详细操作步骤进行。

1.1.4H-ras基因的PCR(聚合酶链反应)扩增

按照Genebank中编号为NM-005343的序列进行设计，并在正义链引物引入BamH I酶切位点，在反义链引入HindIII酶切位点。引物编号为NM-H-RAS，其序列为：正义链5’GGATCCAGAGGAGCGATGACGGAATATA 3’，下划线部分为BamHI位点；反义链5’AAGCTTGGTGGCATTTGGGATGTTC 3’，下划线部分为HindIII位点。PCR反应的条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，61.5℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，循环30次，最后延伸72℃10分钟。反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，目的条带进行切胶纯化，步骤按试剂盒(BioTeke Corporation，多功能DNA纯化回收试剂盒，Cat#DP1502)说明书进行。

1.2K-ras和N-ras基因的获取

采取全基因合成技术，按照Genebank中编号为M54968和BC005219的序列分别人工合成K，N-ras mRNA对应的CDS区，并在其两端加上限制性内切酶BamH I和HindIII的酶切位点。然后克隆到载体PUC57中，送上海生工测序公司测序验证，确保碱基序列全部正确。

实施例2：原核表达三种ras蛋白的重组质粒构建并转化感受态宿主菌

2.1三种ras基因原核表达质粒的构建

三种ras基因目的片段及表达载体PET-28a(+)质粒，其物理图谱及酶切位点见附图1、2，同时进行BamH I和HindIII双酶切。酶切产物切胶纯化后，利用T4 DNA连接酶将质粒PET-28a(+)的线性片段100ng和具有粘性末端的三种ras基因片段酶切产物150ng，22℃过夜连接。

2.2三种表达质粒的筛选与鉴定

过夜链接产物转化到感受态细菌DH5α中，加入600ul LB培养基，37℃，150rpm，培养1小时。取菌液25ul用无菌细菌涂布棒涂布于含卡那霉素的LB平板，过夜培养。平板上的单菌落接种含有卡那霉素的1ml LB培养液中，37℃，230rpm，震荡培养6小时，提取质粒，步骤按试剂盒说明书(TIANprep Mini Plasmid Kit目录号：DP103-02)进行。质粒进行BamH I和HindIII双酶切鉴定，酶切产物行1％琼脂糖凝胶电泳，若出现约5000bp和750bp两条条带的质粒初步视为重组阳性，该质粒进一步送上海生物工程有限公司测序，测序结果见附图3、4、5，并命名为H-ras-PET-28a(+)、K-ras-PET-28a(+)和N-ras-PET-28a(+)。

2.3重组质粒转化感受态宿主菌制备基因工程重组菌株

分别用测序正确的5ul重组质粒加入到20ul感受态BL21(DE3)中，冰中放置30分钟，42℃热激90秒，再在冰中放置1分钟。加入600ul LB培养液，37℃，130rpm，震荡培养1小时。取25ul菌液涂布于含卡那霉素(50mg/ml)的LB培养平板，过夜培养，挑取单菌落摇菌培养，菌液加终浓度为35％的灭菌甘油放-80度冰箱保存。

实施例3：三种ras蛋白的原核表达、纯化及复性

取成功转化并保种的菌液接种于含有卡那霉素的LB培养板上37℃过夜培养。第二天用无菌牙签挑取单菌落接种于5ml含卡那霉素(50mg/ml)的LB培养液中，37℃，230rpm培养至OD₆₀₀为0.6-0.8之间。取1ml菌液加入到含卡那霉素的LB培养液1000ml中，1小时后加入IPTG至终浓度为1mM，放回摇床37℃，230rpm，继续震荡培养过夜16小时。菌液放低温离心机内，4℃，10000rpm离心10min，弃上清收集细菌沉淀，加入r-溶菌酶和Benzonase核酸酶制备细菌裂解液，用BugBuster蛋白提取液将包涵体内的表达蛋白提取出来，提取液经Ni²⁺-NTA亲和柱进行目的蛋白的纯化。纯化后目的蛋白进行SDS-PAGE电泳，用考马斯亮蓝快速染色液染色测定蛋白浓度及纯度。纯化后蛋白经透析液透析，透析液中尿素浓度梯度递减(6M至0.1M)进行复性，透析复性后蛋白放-80℃冰箱保存备用。

实施例4：广谱抗三种P21ras蛋白的单克隆抗体的制备

4.1Balb/c小鼠的免疫

小鼠第一次分别皮下5点注射100ug的P21ras-H蛋白与等量的完全福氏佐剂，第二次注射P21ras-H蛋白与等量的不完全福氏佐剂，第三、四次仅注射PBS稀释的P21ras-H蛋白并改由腹腔注射，第四次注射3天后取其脾B淋巴细胞准备做细胞融合实验。

4.2骨髓瘤细胞SP2/0的复苏、传代培养

从液氮罐中取出冻存的SP2/0细胞，立即放入37℃恒温水浴箱内，并轻轻来回旋转冻存管，确保冻存的细胞悬液在1分钟内解冻。在无菌操作台内将解冻的SP2/0细胞加入预先准备好的装有适量含10％(V/V)新生小牛血清RPMI1640细胞培养液的培养瓶内，放37℃、5％CO₂恒温细胞培养箱内培养。次日更换完全细胞培养液后继续培养。当半贴壁生长的SP2/0细胞长满细胞培养瓶底70-80％面积时，进行传代培养或细胞冻存。

4.3饲养细胞的制备与培养

拉颈处死未经P21ras-H蛋白免疫的Balb/c小鼠，将其浸泡于75％乙醇中10分钟，在无菌操作台内剪开皮肤，暴露腹膜，用一次性注射器诸如6ml预冷的无血清RPMI1640细胞培养液于腹腔内，反复轻轻揉挤腹腔诱聚腹腔巨噬细胞，抽吸出注入的细胞培养液，800rpm，离心10分钟，弃上清，沉淀用含20％(V/V)新生小牛血清的HAT(次黄嘌呤氨基蝶呤胸腺嘧啶脱氧核苷)选择性培养液重悬，混匀，铺96空细胞培养板，每孔0.1ml，放37℃、5％CO2恒温细胞培养箱内培养备用于细胞融合实验。

4.4骨髓瘤细胞SP2/0细胞与免疫后的Balb/c小鼠脾B淋巴细胞融合

在无菌操作台内，取第四次加强免疫后3天的Balb/c小鼠脾B淋巴细胞与处于对数生长期的SP2/0细胞按二者数量比5∶1放于50ml无菌圆底玻璃刻度离心管内，用20ml预温至37℃的无血清RPMI1640培养液洗涤细胞，1000rpm离心10分钟，弃上清，用手指轻弹离心管底使细胞沉淀呈糊状，然后在37℃水浴中缓慢、逐滴、沿离心管内壁加入预温的1ml浓度为50％的聚乙二醇，边加边轻轻转动离心管，确保在一分钟内加完，加完后静置一分钟。立即滴加预温至37℃的无血清RPMI1640培养液15ml以终止聚乙二醇的作用，第一分钟内逐滴、缓慢滴加完1ml；第二分钟内滴加3ml；第三分钟加完剩余的11ml，最后补加预温至37℃的无血清RPMI1640培养液至40ml，轻柔混匀，1000rpm离心10分钟，弃上清，缓慢加入30ml预温至37℃的含20％(V/V)新生小牛血清的HAT选择性细胞培养液重悬细胞沉淀，混匀，铺预先制备好的加有小鼠腹腔饲养细胞的96孔细胞培养板3块，放37℃、5％CO₂恒温细胞培养箱内培养。

实施例5：杂交瘤细胞的间接ELISA法筛选鉴定及单克隆化建株

5.1融合成功的杂交瘤细胞进行间接ELISA法筛选出抗H、K、N-ras蛋白的细胞株

用PH 9.6的0.05M碳酸盐缓冲液将P21ras-H、N、K蛋白分别稀释至5ug/ml，在每个酶标板孔内加入100ul稀释后蛋白液，4℃冰箱内过夜包被。第二天弃孔内液体，吸水纸上拍干，每孔加入0.15M PBS-Tweenz(磷酸盐-吐温)洗涤缓冲液300ul，置震荡摇床上，200rpm，振摇3分钟，弃孔内液体，吸水纸拍干，重复洗涤3次。每孔加入1％BSA-PBS封闭液100ul，置37℃恒温恒湿细菌培养箱内孵育1小时，洗板三次。每孔加入100ul适当稀释的杂交瘤细胞培养上清为一抗，置湿盒内37℃恒温孵育1小时后洗板三次，同时设置空白、阴性、阳性对照。每孔加入1∶2000稀释的酶标二抗(HRP标记的山羊抗鼠IgG)100ul，置湿盒内37℃孵育40分钟后洗板三次。用重蒸馏水重复洗涤2次后每孔加入100ul新鲜配制的TMB(四甲基联苯胺)底物液，避光作用5-10分钟，当阳性对照明显呈蓝色而空白、阴性对照呈无色时即可每孔加入2M H₂SO₄ 50ul终止反应。放酶标仪内读取OD₄₅₀值，凡待测孔值/阴性对照孔值≥2即为阳性。

5.2间接ELISA筛选阳性的杂交瘤细胞株进行单克隆化后建株冻存

将准备克隆化的杂交瘤细胞群落从细胞培养瓶或培养板孔内轻轻吹下，显微镜下细胞计数，用含20％(V/V)新生小牛血清的HT(次黄嘌呤胸腺嘧啶脱氧核苷)细胞培养液稀释为5-10个细胞/ml。在加有饲养细胞，如小鼠腹腔巨噬细胞的96孔酶标板内每孔加入100ul稀释后的杂交瘤细胞悬液，置37℃、5％CO₂恒温细胞培养箱内培养。大约第三天可见细胞培养孔内杂交瘤细胞克隆形成并记录克隆个数，第5天小心半量换取含20％(V/V)新生小牛血清HT细胞培养液，第7天补加HT细胞培养液100ul，继续培养直至再次间接ELISA检测上清中的特异性抗P21ras单克隆抗体。选择再次ELISA法检测时效价高、呈单个克隆生长、形态良好的杂交瘤细胞据需按照上述方法重复进行3次亚克隆和扩大培养，第2-4次克隆化时换用含20％(V/V)新生小牛血清RPMI1640细胞培养液代替20％(V/V)新生小牛血清的HT选择性细胞培养液。将第四次克隆化后，上清抗三种ras蛋白的杂交瘤细胞建株并大量冻存备用。最后建株的5株杂交瘤细胞株的克隆号为：KGH-R1、KGH-R2、KGH-R3、KGH-R4、KGH-R5。

实施例6：抗P21ras-H、N、K特异性单克隆抗体的大量制备及效价测定

将分泌广谱抗P21ras蛋白的杂交瘤细胞1×10⁶个注射入预先经灭菌液体石蜡处理过的Balb/c小鼠腹腔内，每天密切观察小鼠情况，待腹水足够多而小鼠处于濒死前抽取腹水，离心收集上清，加入终浓度为0.2g/L叠氮钠备用。将制备的腹水倍比稀释后进行间接ELISA法测定其效价，结果示5株单抗的效价均在1∶100000以上，见附图7。

实施例7：分泌广谱抗P21ras蛋白的杂交瘤细胞株染色体检测

将杂交瘤细胞株传代培养48小时后加入0.1％秋水仙素应用液，使其终浓度为0.05-0.1ug/ml，继续培养2.5小时。用10ml移液管轻轻吹下半贴壁生长的杂交瘤细胞，移入15毫升无菌刻度离心管内，1000rpm，离心10分钟，弃上清，加入5毫升预温至37摄氏度的0.075mol/L氯化钾溶液，用滴管轻轻吹打混匀，放37摄氏度水浴内15-20分钟，加入1毫升新鲜配制的固定液并混匀，1000rpm，离心10分钟，弃上清，细胞沉淀加入5毫升固定液，室温下静置30分钟，1000rpm，离心10分钟，弃上清，细胞沉淀加入2-5毫升固定液后轻轻吹散细胞。吸取2-3滴细胞悬液滴于预冷的洁净载玻片上，立即轻轻吹散细胞，在酒精灯火焰上通过几次使细胞平铺于载玻片上，自然干燥后用瑞士染液染色10分钟，用蒸馏水洗去染色液，自然干燥后用中性树胶封片，显微镜下计数100个完整的分裂中期的杂交瘤细胞核，记录染色体数目。杂交瘤细胞株的染色体数目大约为97条，提示融合成功，见附图8。

实施例8：广谱抗P21ras特异性单克隆抗体免疫球蛋白类型及亚型的鉴定

根据试剂盒说明书用0.01M PH7.3的PBS应用液将待测的杂交瘤细胞培养上清稀释到终浓度为1.0ug/ml。从小鼠单克隆抗体分型检测试剂盒内(英国AbD Serotec公司；Datasheet：MMT1；Batch NO：19118；10tests)取出检测试纸条和密封的含有耦联上呈色微颗粒的羊抗鼠免疫球蛋白冻干粉的试管，置室温下片刻，吸取150ul上述新鲜稀释的杂交瘤细胞培养上清加入试管内，室温下静置30秒后轻轻混匀，将试纸条的红色一端插入试管底部，当阳性对照显色明显时，及时将试纸条从试管内取出以终止反应，风干试纸条，判断结果。结果显示5株杂交瘤细胞分泌的抗P21ras抗体类型均为IgG2b、κ轻链，为单克隆性。见附图9。

实施例9：抗P21ras单克隆抗体特异性测定(Western blot法)

将原核表达的三种P21ras蛋白、原核表达空载体BL21细菌裂解液的阴性对照及19种肿瘤细胞株的蛋白提取液进行SDS-PAGE电泳，目的条带在电转仪内转移到PVDF(聚偏氟乙烯)膜上，封闭后加入从5株杂交瘤细胞的培养上清及商品化的抗P21ras单克隆抗体(Abcam公司生产)作为阳性对照，37℃恒温恒湿孵育1小时进行免疫杂交。加入适当稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG(Lengton生物公司Cat No：LTE007)，37℃恒温恒湿孵育1小时进行DAB(3，3’-二氨基联苯胺)显色或化学发光法显色。结果显示5株杂交瘤细胞生产的抗P21ras单克隆抗体能与原核表达的三种P21ras蛋白结合，同时也能与肿瘤细胞所提取的P21ras蛋白结合且表观分子量大小正确。结果见附图10。

实施例10：抗P21ras单克隆抗体的免疫细胞/组织化学鉴定

免疫细胞化学检测：

采用人肝癌细胞株QGY-7703，人胃癌细胞株BGC-853，人白血病细胞株THP-1，人白血病细胞株K562，人白血病细胞株MT4CD4+，人白血病细胞株Daud I，人结肠直肠癌细胞株HCT116，人膀胱移行细胞癌细胞株T-24，人肝癌细胞株SMMC-7721，人喉鳞癌细胞株Hep2，人胃癌细胞株MKN-28，人肝癌细胞株HepG2，人卵巢癌细胞株SKOV3，人白血病细胞株C8166CD4+，人白血病细胞株HL60，人宫颈癌细胞株HeLa，人乳腺癌细胞株MDA-MB-231，人乳腺癌细胞株MDA-MB-435，人乳腺癌细胞株MCF7共19种肿瘤细胞株；将呈对数生长期的19种肿瘤细胞株收集于刻度离心管内，离心弃上清，细胞沉淀用生理盐水洗一遍，离心弃上清，用95％乙醇重悬细胞沉淀，离心后让细胞沉淀在95％乙醇中固定3小时，小心取出肿瘤细胞沉淀块按常规组织脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、水化及高压抗原修复后，加入本申请人制备的广谱抗ras蛋白的杂交瘤细胞上清作为一抗，免疫组化链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法检测肿瘤细胞表达P21ras蛋白的情况，所用免疫组化标记试剂盒为美国Thermo公司产品(UltraVision Plus Detection System，REF：TP-125-HLX，LOT：HLX-90609)。结果显示本室制备的单克隆抗体与其中的15种肿瘤细胞株呈阳性反应，显示了良好的抗肿瘤细胞株谱系。见附图11。

免疫组织化学检测(SP法)

选取人体各系统常见的肿瘤病例及正常组织进行免疫组化检测。SP法试剂盒为美国Thermo公司产品(UltraVision Plus Detection System，REF：TP-125-HLX，LOT：HLX-90609)。首先镜下重新审阅各病例的苏木素伊红(HE)染色切片，选取病变完整且无明显的出血、坏死的肿瘤蜡块进行厚度为4um切片。用防脱片载玻片捞取组织后，按常规脱蜡、水化及高压抗原修复后，加入过氧化氢(H₂O₂)阻断内源性过氧化物酶，用Ultra V Block(TA-125-UB)封闭玻片后加入本室制备的5株广谱抗ras蛋白的杂交瘤细胞上清作为一抗过夜孵育，加入生物素化羊抗鼠IgG(Biotinylated Goat Anti-polyvalent plus，TS-125-BNS)作为二抗，加链霉亲和素过氧化物酶复合物(TS-125-HRS)后用DAB(3，3’-二氨基联苯胺)进行显色，显色时间控制在目的标记细胞或组织着色而背景不着色为准。切片经苏木素复染，常规中性树胶封片后进行镜下观察。每次实验均设立严格的阳性及阴性对照。

实验结果判定按染色强度及染色细胞百分数进行记分及统计分析。结果显示本申请人制备的单克隆抗体与肺鳞状细胞癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、皮肤基底细胞癌、皮脂腺癌、B细胞淋巴瘤等中的绝大多数病例呈明显阳性反应，阳性表达部位为细胞膜及细胞质，可以呈细颗粒、环胞膜深染状及胞质内点彩状染色，见附图12、13、14。正常组织表达阳性细胞数一般均少于5％，染色强度亦为弱阳性。所有病变中的纤维间质、血管等均呈阴性。结果证实本申请构建的单克隆抗体具有良好的特异性及敏感性。

Claims (10)

1.一种广谱抗ras基因表达蛋白的单克隆抗体，其特征在于：抗ras基因全蛋白表达序列(CDS)的单克隆抗体，广谱拮抗H、K、N-ras三种基因的表达蛋白；该单克隆抗体用于ras基因表达蛋白(P21ras)的组织或肿瘤的诊断性实验和发病机制研究，或用于构建单链抗体、细胞内抗体等小分子抗体并用于表达P21ras肿瘤的治疗性研究。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征是：广谱拮抗H、K、N-ras三种基因的表达蛋白的单抗，其中K、N-ras基因的全蛋白表达序列(CDS)通过人工合成方式获得。

3.如权利要求2所述的单克隆抗体，其特征是：H-ras基因的全蛋白表达序列(CDS)通过RT-PCR从肝癌细胞株中获得，RT-PCR反应所用的引物编号为：NM-H-RAS。

4.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征是：单克隆抗体与细胞或组织内的ras基因表达蛋白(P21ras)进行免疫细胞/组织化学染色而显示。

5.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征是：用于表达ras基因表达蛋白的正常或肿瘤组织的诊断性实验。

6.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征是：作为其他小分子抗体研究的基础材料。

7.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征是：进一步用于表达P21ras的肿瘤的治疗。

8.如权利要求1所述的广谱抗ras基因表达蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征是：用原核表达的H、N、K三种ras基因的表达蛋白免疫小鼠后，通过免疫后小鼠的脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞而获得单克隆抗体。

9.如权利要求8所述的单克隆抗体的制备方法，其特征是：H、N、K三种ras基因的表达蛋白由原核表达基因工程大肠杆菌BL21(DE3)生产，经蛋白提取及纯化后获得。

10.如权利要求8所述的单克隆抗体的制备方法，其特征是：基因工程细菌通过转化三种原核表达重组质粒获得，三种原核表达重组质粒是H、N、K三种ras基因的全蛋白表达序列(CDS)片段分别与表达质粒PET-28a(+)连接获得；各重组质粒上携带有组氨酸(His)标签便于后续融合蛋白的纯化。

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