CN101492506A - 胃癌多药耐药性鉴别诊断用ciapin1单克隆抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明是多药耐药性胃癌进行确认的鼠抗人CIAPIN1单克隆抗体及其制备方法，其特征在于：所述单克隆抗体为用杂交瘤技术获得；重链为IgG1；轻链为κ；分子量为39KD；亲和力为3.6×10^－12。其制备方法：(1)合成引物；(2)用人胃癌多药耐药细胞SGC－7901/VCR总RNA逆转录合成单链DNA；(3)用引物F和R采用PCR的方法扩增人CIAPIN1基因cDNA；(4)构建CIAPIN1基因诱导表达质粒pET28－CIAPIN1和pGEX－CIAPIN1；(5)构建工程菌BL21－CIAPIN1和DE3－CIAPIN1；(6)用工程菌BL21－CIAPIN1和DE3－CIAPIN1；原核表达并纯化CIAPIN1蛋白；(7)用CIAPIN1蛋白免疫4周龄Balb/C小鼠，使产生鼠抗人CIAPIN1抗体；(8)有免疫鼠血清制备鼠抗人CIAPIN1单克隆抗体。本发明能较好的识别临床胃癌患者中多药耐药性胃癌或非多药耐药性胃癌，并预测胃癌患者临床预后。

Description

胃癌多药耐药性鉴别诊断用CIAPIN1单克隆抗体及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域和医疗检测试剂技术领域，是临床上胃癌病理鉴别诊断中对多药耐药性胃癌进行确认的一种新的标志物——鼠抗人CIAPIN1单克隆抗体及其制备方法。

背景技术

胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。尽管其发病率一直处于下降趋势，但在亚洲国家如中国、朝鲜和日本以及一些欧洲和南美洲国家，胃癌的发病率依然很高。化疗是胃癌的主要治疗手段之一，虽然人们使用了多种化疗药物，但胃癌的治疗仍未得到根本改观，其原因主要是胃癌可产生对化疗药物的耐受性。耐药性尤其是多药耐药性(multidrug resistance，MDR)是恶性肿瘤化学治疗成功的主要障碍之一。具有多药耐药性的肿瘤细胞同时耐受多种在结构和作用机理上完全不同的化疗药物。耐药性可以分为自发性或内在性(intrinsic)耐药和获得性(acquired)耐药两类，前者是指肿瘤细胞在未接触化疗药物时即具有耐药性，而后者是指肿瘤细胞在接触化疗药物后产生的耐药性。通常认为，MDR的产生是由细胞膜系结构上能量依赖性的转运分子介导的，这些分子能将药物泵出细胞或某种亚细胞器外，使药物不能到达其作用靶点。这些转运分子包括P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance associated protein，MRP-1)、肺耐药相关蛋白(lung resistanceprotein，LRP)和乳腺癌耐药相关蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP/MXR/ABCG2)。另外，包括谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase，GST)介导的细胞解毒系统功能增强和细胞对化疗药物诱导的凋亡的敏感性下降也参与了某些恶性肿瘤MDR的发生。

胃癌发生MDR的机制远未阐明。本研究所对100例未经治疗的胃癌组织标本内MDR相关分子的检测显示，GST-pi mRNA、MRP mRNA、LRP mRNA、P-gp mRNA和MGr1-Ag蛋白的阳性率仅分别为36.0％、12.0％、10.0％、10.0％和18.0％，总阳性率为58.0％。这一结果表明虽然胃癌发生MDR是一个普遍的现象，但经典的MDR介导分子的表达并不如预想的那样高，提示胃癌MDR的产生有着复杂的机制，其中可能涉及一些非经典的MDR相关分子，需要我们进一步寻找和验证。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种CIAPIN1单克隆抗体及制备方法。

本发明的第二个目的是提供一种CIAPIN1的纯化蛋白。

本发明的第三个目的是提供制备CIAPIN1单克隆抗体的两种载体。

本发明的第四个目的是提供制备CIAPIN1单克隆抗体的两种宿主菌。

本发明的第五个目的是提供CIAPIN1单克隆抗体在临床胃癌患者胃癌多药耐药性鉴别诊断中的应用。

本发明鼠抗人CIAPIN1单克隆抗体的制备方法如下：

1.RT-PCR方法克隆CIAPIN1基因

1.1引物设计：

正向引物：5′-CGGAATTCATGGCAGATTTTGGGATCTC-3′

反向引物：5′-GGTCGACCTAGGCATCAAGATTGCTATC-3′

正向引物引入EcoR I酶切位点，反向引物引入Sal I酶切位点(下划线部分)便于亚克隆操作。引物由上海生工合成。

1.2逆转录合成单链DNA(Invitrogen公司的Superscript逆转录试剂盒)：

反应按如下条件进行：人胃癌多药耐药细胞SGC-7901/VCR总RNA(按Invitrogen公司TrizolRNA纯化试剂盒操作，制备)(1μg/μl)2μl，随即六核苷酸引物(10μmol/L)7μl，脱氧核糖核酸dNTPs(10mmol/L)1μl，焦碳酸乙二酯(DEPC)处理水2μl，5×第一链合成缓冲液4μl，二流苏糖醇(DTT，0.1mol/L)2μl，RNA酶抑制剂RNasinlμl，RNA依赖DNA合成酶Superscript II，总反应体积为20μl，42℃水裕50分钟，70℃灭活15分钟，将所得的逆转录产物置-20℃保存备用。

1.3以上逆转录产物为模版，PCR扩增CIAPIN1基因cDNA

反应体系如下：

逆转录产物          1μg(1μl)

正向引物            1μl(50pmol/μl)

反向引物            1μl(50pmol/μl)

10×buffer          10μl

dNTP mixture        2μl

Taq DNA polymerase  1μl(5U)

H₂O      84μl

PCR反应条件为：预变性95℃，5min；95℃，50sec，58℃，50sec，72℃ 50sec，30循环；终末延伸72℃，10min。反应完成后产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分析。

以PCR产物凝胶回收试剂盒回收目的DNA片断。

1.4构建CIAPIN1基因诱导表达重组质粒pET28-CIAPIN1和pGEX-CIAPIN1：以EcoR I和Sal I分别双酶切上述PCR纯化产物和pET28-a(+)，pGEX-4T-1表达载体，37℃，4小时；产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，以DNA凝胶回收试剂盒回收目的片断；回收的DNA片段经纯化后经T4连接酶连接于原核表达载体pET28-a(+)和pGEX-4T-1的相应位点，得到连接产物。

 1.5构建工程菌BL21-CIAPIN1和DE3-CIAPIN1

将上述重组质粒及相应的空载体转化感受态BL21(DE3)，分别铺于含有卡那霉素和氨苄青霉素的半固体LB平板，37℃培养过夜；挑取菌落，提取质粒；EcoR I和Sal I双酶切和DNA测序鉴定，正确的重组克隆分别命名为pET28-CIAPIN1和pGEX-CIAPIN1，其相应得工程菌为BL21-CIAPIN1和DE3-CIAPIN1。

2.CIAPIN1重组蛋白的原核表达及纯化

常规将工程菌培养至OD值为0.6左右；加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mmol/ml，诱导培养5小时后，根据Invitrogen公司Ni-NTA蛋白纯化试剂盒操作说明书和Pharmacia GSTrap FF column操作说明书纯化CIAPIN1蛋白，得到CIAPIN1蛋白。

本发明应用R和F引物从人胃癌多药耐药细胞株SGC-7901/VCR总RNA逆转录产物中扩增的CIAPIN1序列是(GeneID：57019)172bp-1110bp间的cDNA，其全长2106bp，所表达的CIAPIN1蛋白含312个氨基酸，编码蛋白39KD。结构见SEQ ID NO：2。

3.鼠抗人CIAPIN1单克隆抗体的制备、纯化与鉴定

单克隆抗体的制备按《分子克隆实验指南》(第二版，萨姆布鲁克J.等，出版社，北京，1997，下同)介绍的方法进行。

3.1小鼠的免疫

4周龄Balb/C小鼠三只，常规条件下饲养。以变性条件下纯化的6×his-hCIAPIN1腹腔注射免疫三次，首次免疫加入完全Freuid佐剂，第二次加入不完全佐剂，第三次不加佐剂，在细胞融合前3天(与第三次免疫间隔4周)，腹腔注射不加佐剂的抗原1次。

3.2制备CIAPIN1单克隆抗体

将免疫后小鼠脾脏细胞与SP2/0饲养细胞融合，通过ELISA方法筛选出分泌抗体的阳性克隆培养扩增，部分冻存。收集克隆化的培养细胞通过小鼠腹腔接种制备单克隆抗体。采用正辛酸-饱和硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体。

3.3鉴定CIAPIN1单克隆抗体

Invivogen公司(试剂盒Mouse monoclonal antibody isotyping kit)鉴定单抗亚型显示此杂交瘤细胞分泌的抗体为：重链，IgG1；轻链，κ。进而，采用非竞争性ELISA检测此单克隆抗体的亲和力，确定亲和力为3.6×1^-12.为检测所制备的单克隆抗体在以后研究中的应用价值，用制备的单克隆抗体对人和小鼠的组织及培养细胞进行免疫组化和Western blot分析，证实此抗体可用于人和小鼠的免疫组化及Western blot检测(稀释度为1∶400)。

CIAPIN1抗体鉴别诊断临床胃癌患者中多药耐药性的免疫组织化学染色实验

1.胃癌石蜡切片的免疫组织化学染色：

按常规方法采用免疫组织化学染色方法检测胃癌组织的多么耐药性。试剂盒采用北京中山公司SP试剂盒和DAB显色试剂盒。免疫组化结果判断：根据染色强度判断结果。细胞浆或/和细胞核呈淡棕色为弱阳性(+)，呈棕色者为阳性(++)，深棕色为强阳性(+++)，无信号为阴性(-)。

CIAPIN1单克隆抗体在组织特异性上有较好的胃组织特异性染色，其在人胃癌多药耐药性组织中染色为(++)到(+++)；而在人胃癌非多药耐药性组织中染色为(-)或(+)。

将胃癌多药耐药性组织(MDR Tissue，M)和胃癌非多药耐药性组织(N-MDR Tissue，NM)分别用CIAPIN1单克隆抗体，和GST-pi、MRP、LRP、P-gp抗体检出进行免疫组织化学染色，染色结果采用Pearson χ²统计方法分析，比较结果见表1。

表1.CIAPIN1，GST-pi、MRP、LRP和P-gp抗体免疫组化染色比较

有表1可见，对多药耐药性胃癌组织，CIAPIN1单克隆抗体与GST-pi、MRP、LRP、P-gp一样均有较好染色反应，但对非多药耐药性胃癌组织，CIAPIN1单克隆抗体染色非常少，而GST-pi、MRP、LRP、P-gp抗体对GST-pi、MRP、LRP、P-gp仍有部分染色，说明CIAPIN1单克隆抗体在区分胃癌多药耐药性组织和胃癌非多药耐药性组织的鉴别诊断中具有实际临床应用价值。

2.胃癌非多药耐药性鉴别诊断实验

为了进一步评价CIAPIN1单克隆抗体用于临床胃癌多药耐药性病理鉴别诊断的可能性，将CIAPIN1单克隆抗体与临床上常用的MRP和P-gp抗体做比较，采用金标准诊断标志物评价测试(Golden Standard Diagnositic Evaluation Test)进行分析。评价指标有：敏感性(Sensitivity，简写Se)，特异度(Specificity，简写Sp)，误诊率(MistakeDiagnostic Rate，简写α)，漏诊率(Omission Diagnostic Rate，简写β)，阳性预测值(Positive Predictive Value，简写PV⁺)，阴性预测值(Negative Predictive Value，简写PV-)，准确率(Validity Rate，简写π)，Younden指数(Younden Index，简写YI)。

具体操作为：将临床诊断为胃癌多药耐药的胃癌标本归为诊断阳性组D+；临床诊断为胃癌非多药耐药的胃癌标本归为诊断阴性组D-。用待检抗体检出为阳性的归为T+，也包括病理诊断为胃癌非多药耐药的胃癌标本，用待检抗体确诊的例数即病理诊断为胃癌多药耐药的胃癌标本a(确诊)，用待检抗体误诊的例数即病理诊断为胃癌非多药耐药的胃癌标本b(误诊)。用待检抗体检出阴性的归为T-，T-组中也包括病理诊断为胃癌多药耐药的胃癌标本，用待检抗体漏诊的例数即病理诊断为胃癌多药耐药的胃癌标本c(漏诊)，用待检抗体做出鉴别诊断的例数即病理诊断为胃癌非多药耐药的胃癌标本为d(鉴别诊断)。

表2.金标准评价CIAPIN1、MRP、和P-gp抗体在100例胃癌鉴别诊断中的表现

由表2可以看出，CIAPIN1单克隆抗体在特一度(Sp)、误诊率(α)、准确率(π)、Younden指数(YI)、阳性预测值(PV+)、和阴性预测值(PV-)等指标上都优于传统的MRP和P-gp抗体。进一步说明CIAPIN1抗体应用于临床胃癌多药耐药病理鉴别诊断的优越性。

本发明采用抗原与抗体结合的原理，用从人胃癌多药耐药细胞SGC-7901/VCR中筛选出来的CIAPIN1基因制备的CIAPIN1蛋白免疫Balb/C小鼠，制备鼠抗人CIAPIN1单克隆抗体，由于CIAPIN1单克隆抗体能较好的识别临床胃癌患者中多药耐药性胃癌或非多药耐药性胃癌，因此可将鼠抗人CIAPIN1单克隆抗体用于检测临床中多药耐药性胃癌患者，预测胃癌患者临床预后，并为临床胃癌患者的治疗用药和治疗方法的选择提供依据。

人胃癌多药耐药细胞高表达的CIAPIN1基因最初是本实验室2002年采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)和DD-PCR的方法从胃癌多药耐药细胞系SGC-7901/VCR中筛选得到的高表达的MDR候选分子，当时命名为V62(Cancer Letters，185，2002，211-218)，2004年国际基因命名委员会将其鼠源性分子命名为Anamorcin(J.Exp.Med.2004，16，581-592)，人源性分子命名为CIAPIN1，其开放读框编码312个氨基酸组成的理论为33.85kDa的蛋白质，含一个转甲基酶结构域，其结构见SEQ ID NO：1。

本发明CIAPIN1的单克隆抗体能较好的识别临床胃癌患者中多药耐药性胃癌或非多药耐药性胃癌，并预测胃癌患者临床预后；因此可以用来制备鉴别诊断胃癌多药耐药性的试剂，也可与其它经典胃癌多药耐药性标志物联合应用，以进一步提高胃癌多药耐药患者的检出率，为临床胃癌患者的治疗用药和治疗方法的选择提供依据。

附图说明

图1为本发明的CIAPIN1cDNA的PCR扩增图。

图2为本发明构建的重组质粒pET28-CIAPIN1的原始质粒结构示意图。

图3为本发明构建的重组质粒pGEX-CIAPIN1的原始质粒结构示意图。

图4为本发明的CIAPIN1原核表达载体构建和鉴定图。

图5为本发明原核表达及纯化后的6×his-hCIAPIN1蛋白SDS-PAGE鉴定图。

图6为本发明原核表达及纯化后的6×his-hCIAPIN1蛋白Western blotting鉴定图。

图7为本发明CIAPIN1单克隆抗体亚型的鉴定图。

图8为本发明CIAPIN1单克隆抗体石蜡切片免疫组化染色(400×)。

图9为本发明CIAPIN1单克隆抗体Western blotting鉴定图。

具体实施方式

实施例1：制备鼠抗人CIAPIN1单克隆抗体

1.RT-PCR方法从人胃癌多药耐药细胞系SGC-7901/VCR中克隆CIAPIN1基因

1.1引物设计：

正向引物：5′-CGGAATTCATGGCAGATTTTGGGATCTC-3′

反向引物：5′-GGTCGACCTAGGCATCAAGATTGCTATC-3′

正向引物引入EcoR I酶切位点，反向引物引入Sal I酶切位点(下划线部分)便于亚克隆操作。引物由上海生工合成。

1.2逆转录合成单链DNA(Invitrogen公司的Superscript逆转录试剂盒)：

反应按如下条件进行：人胃癌多药耐药细胞SGC-7901/VCR总RNA(按Invitrogen公司TrizolRNA纯化试剂盒操作，制备)(1μg/μl)2μl，随即六核苷酸引物(10μmol/L)7μl，脱氧核糖核酸dNTPs(10mmol/L)1μl，焦碳酸乙二酯(DEPC)处理水2μl，5×第一链合成缓冲液4μl，二流苏糖醇(DTT，0.1mol/L)2μl，RNA酶抑制剂RNasinlμl，RNA依赖DNA合成酶Superscript II，总反应体积为20μl，42℃水裕50分钟，70℃灭活15分钟，将所得的逆转录产物置-20℃保存备用。

1.3以上述逆转录产物为模版，PCR扩增CIAPIN1基因cDNA

反应体系如下：

逆转录产物           1μg(1μl)

正向引物             1μl(50pmol/μl)

反向引物             1μl(50pmol/μl)

10×buffer           10μl

dNTP mixture         2μl

Taq DNA polymerase   1μl(5U)

H₂O                  84μl

PCR反应条件为：预变性95℃，5min；95℃，50 sec，58℃，50 sec，72℃ 50 sec，30循环；  终末延伸72℃，10min。反应完成后产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分析。以PCR产物凝胶回收试剂盒回收目的DNA片断。PCR反应后电泳证实扩增出符合大小的DNA片段(图1)，第一泳道：100bp DNA ladder mix；第二泳道：PCR产物。

1.4构建CIAPIN1基因诱导表达重组质粒pET28-CIAPIN1和pGEX-CIAPIN1：

以EcoR I和Sal I双酶切上述PCR纯化产物和pET28-a(+)(图2)(该图谱来自Invitrogen公司(NASDAQ：IVGN)提供的原始质粒载体说明书，为最清晰的图谱)，pGEX-4T-1表达载体(图3)(该图谱来自Stratagene公司(NASDAQ：STGN)提供的原始质粒载体说明书，该图谱来自Invitrogen公司(NASDAQ：IVGN)提供的原始质粒载体说明书，为最清晰的图谱)，37℃，4小时；→产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，载体条带与插入片段完全分离后，在长波紫外灯下切取含有目的条带的胶条，以DNA凝胶回收试剂盒回收目的片断；→回收的DNA片段连接于原核表达载体pET28-a(+)和pGEX-4T-1的相应位点；→连接产物转化DH5α，分别铺于含有卡那霉素和氨苄青霉素的半固体LB平板，挑取菌落，提取质粒；→EcoR I和Sal I双酶切鉴定，正确的重组克隆分别命名为pET28-hCIAPIN1和pGEX-hCIAPIN1。

结果：亚克隆于pET-28a(+)后，酶切分析筛选出正确的重组克隆(图4)，证实原核表达载体构建成功。第一泳道：pET28-hCIAPIN1，EcoR I+Sal I)双酶切；第二泳道：pET-28a(+)，EcoR I+Sal I双酶切；第三泳道：100bp DNA ladder mix。

1.5构建工程菌BL21-CIAPIN1和DE3-CIAPIN1的构建和鉴定

以上的重组质粒及相应的空载体转化感受态BL21(DE3)，分别铺于含有卡那霉素和氨苄青霉素的半固体LB平板，培养过夜；→挑取平板上较小的菌落，接种于5ml含有相应抗菌素的LB内，25-37℃振摇(250rpm/min)培养至OD值为0.6左右；→加入IPTG至终浓度为1mmol/ml，在同样条件下继续培养5小时；→取1ml菌液，离心，沉淀加入0.1ml 2×SDS PAGE loading buffer，混悬，沸水浴5min，1200rpm/min离心5min，取上清，12％SDS-PAGE电泳分离，考马斯亮蓝染色分析有无重组蛋白表达。

2.CIAPIN1蛋白的表达与纯化

含有重组表达质粒的BL21(DE3)经IPTG诱导后，取样进行SDS-PAGE分析证实有表达条带。经大量表达、纯化，对洗脱液进行SDS-PAGE分析，发现两种纯化方法的洗脱液内均有符合预期大小的蛋白条带，但变性条件下纯化所得的产物量大而且纯度较高(图5)。第一泳道：蛋白质分子量标准；第二泳道：pET28-a(+)-hCIAPIN1，诱导后；第三泳道：pET28-a(+)，诱导后；第四泳道：纯化后的6×his-hCIAPIN1重组蛋白。将纯化后的蛋白进行Western blotting分析，采用mouse anti-6×his Mab为一抗，证实表达及纯化的蛋白带有6×his标签(图6)。第一泳道：pET28-a(+)，诱导后；第二泳道：pET28-a(+)-hCIAPIN1表达菌总蛋白，诱导后；第三泳道：纯化的6×his-hCIAPIN1蛋白。具体步骤如下：

2.16×his-hCIAPIN1融合蛋白的纯化：

(1)天然(非变性)状态下纯化

离心收集细菌，弃上清，沉淀团块以PBS洗一次(1000g，5min)；→冻融细菌团块3次；→裂解细菌。2×10⁷细菌，加入4ml裂解缓冲液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，10mM imidazole，pH 8.0，1mM leupeptine，1mM aprotenin，10mM PMS F，1mg/ml溶菌酶)，混匀，置冰浴中30min；→超声破碎。在冰浴中，破碎10秒，冷却10秒，直至菌液变为细胞的牛奶状；→10,000g离心20min，4℃，取上清；→上清中加入0.5ml 50％Ni-NTA，4℃振摇2小时(200rpm)；→离心，8000rpm，10min，取出上清；→以洗涤缓冲液(50mM NaH₂PO4，300mM NaCl，20mM imidazole，pH 8.0，1mM leupeptine，1mM aprotenin，10mM PMSF)洗沉淀5次；→洗脱。每次用0.1ml洗脱缓冲液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，250mM imidazole，pH 8.0，1mMleupeptine，1mM aprotenin，10mM PMSF)，洗4次，每次洗脱液单独收集；→SDS-PAGE及Western blot分析检测重组蛋白纯化效果。

(2)变性状态下目的蛋白的纯化

加裂解液(100mMNaH₂PO4，10mMTris-Cl，6M GuHCl，pH 8.0)(5ml/g细菌)重悬细菌团块；→室温下搅拌60min，裂解细菌，直至菌液清亮；→离心，12000rpm×10min，弃去沉淀；→上清加入50％Ni-NTA悬液(1ml/4ml裂解液)，置摇床上以200rpm转速振摇2h；→离心，8000rpm×10min，小心弃去上清；→Ni-NTA沉淀以洗液(100mM NaH₂PO4，10mM Tris-Cl，8M urea，pH 6.3)洗5次，每次洗涤时均振荡混匀，离心后小心吸弃洗液；→洗脱，每次加入洗脱液(100mM NaH₂PO4，10mMTris-Cl，8M urea，pH 4.5)0.5ml，离心，取出上清，分管收集，标记保存。

2.2GST-hCIAPIN1的纯化

采用Pharmacia GSTrap FF column进行，按照产品说明书操作。离心收集表达菌，以结合缓冲液(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH7.3)悬浮；→裂解细菌：加入溶菌酶至1mg/ml，冰浴30min，超声处理；→离心12,000rpm×15min，取上清；→将上清用注射器缓慢推注通过事先平衡过的柱子(流速0.5ml/min)；→用注射器推注的方法以10倍柱体积的结合缓冲液洗柱(流速1ml/min)；→以5倍柱体积的洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl，10mM还原型谷胱甘肽，pH 8.0)洗脱，收集洗脱液。

2.3纯化蛋白的后处理

纯化产物离心，8000rpm×5min，取出上清，装于经事先处理过的透析袋中；→变性纯化产物的透析处理：将装有洗脱液的透析袋浸没于含有7M尿素的PBS中，置于4℃，每4小时补充入原体积1/10的不含尿素的PBS，至透析液体积达到最初体积的3倍时，弃去含有尿素的透析液，再以透析袋内液体体积5倍的PBS透析2次，每次4-6小时。取出袋内液体，5000rpm离心5min，取上清分装，-20℃保存。→天然状态下纯化产物的透析处理：透析袋置于PBS中，4℃下透析，每8小时换液一次，透析2-3天，取出透析袋内液体，离心，取上清分装保存。

2.4纯化蛋白的检测

纯化后的蛋白取样进行SDS-PAGE-考马斯亮蓝染色分析，证实有符合预期分子量大小的条带。对于6×his-hCIAPIN1，还采用Western blot方法检测表达产物及纯化产物是否与6×his抗体反应，进一步证实目的蛋白的正确性。

(1)SDS-PAGE

按照常规方法制备分离胶和积层胶；→取一定量的蛋白质样品与等体积的2×SDS上样缓冲液(100mmol/l Tris base、200mmol/l二硫苏糖醇、4％SDS、0.2％溴酚兰、20％Glycerol)混合，于100℃变性5min；→按照每泳道100μg加载于不连续聚丙烯酰胺凝胶样品孔中；→以恒压80V(积层胶)/100V(分离胶)电泳至溴酚兰抵达凝胶底边；→取出凝胶用于考马斯亮蓝染色或Western blot。

(2)Western blot

 SDS-PAGE凝胶在转移缓冲液(25mmol/l Tris base、192mmol/l Clycin、20％甲醇)中浸泡10-20min；→按照3张滤纸、凝胶、NC膜、3张滤纸的顺序组装盒式转移塔，并将其以NC膜向阳极的方向装入转移装置；→于室温条件下，稳流1mA/cm²电转移，时间30min；→用丽春红染液对滤膜进行染色，标记笔标记蛋白分子量标准各条带所在位置，再用去离子水洗去丽春红；→滤膜经5％脱脂奶粉于室温封闭30min；→与稀释于2.5％脱脂奶粉的抗体(mouse anti-His 1∶1000)4℃孵育过夜，TBST(10mmol/lTris base，150mmol/l NaCl，0.05％Tween 20，pH8.0)摇洗4次×15min；→与稀释于2.5％脱脂奶粉的HRP标记的羊抗小鼠IgG于室温孵育2h；→TBST摇洗4次×15min；→等量混合ECL显色系统中A+B液，滴加至硝酸纤维素膜；→X-ray胶片感光。

3抗CIAPIN1单克隆抗体的制备和鉴定

3.1小鼠的免疫

4周龄Balb/C小鼠三只，常规条件下饲养。以变性条件下纯化的6×his-hCIAPIN1腹腔注射免疫三次，首次免疫加入完全Freuid佐剂，第二次加入不完全佐剂，第三次不加佐剂，在细胞融合前3天(与第三次免疫间隔4周)，腹腔注射不加佐剂的抗原1次。

3.2细胞融合

融合前1天，准备饲养细胞。取4周龄昆明种小鼠，断颈处死，在75％的乙醇内浸泡，无菌取胸腺，在200目筛网上以注射器芯研磨分离胸腺细胞，1000rpm 5min离心5min，细胞沉淀以1640悬浮，加入96孔板，每孔加入50μl，密度为细胞在孔底均匀分布1层，培养。→融合当天，免疫后小鼠眼球放血，在酒精内浸泡消毒，打开腹腔，取出脾脏，在细胞滤网上研磨，不时加入1640冲洗，收集细胞，离心，弃上清。→取出SP2/0细胞培养瓶，吹下细胞，离心收集细胞。→SP2/0细胞与脾细胞混合(脾细胞与骨髓瘤细胞之比为5∶1)，加入1640悬浮，离心，弃上清，尽量控干液体。→混合细胞团块敲打松散，使其在50ml离心管底部形成均匀一层。→均匀转动离心管，吸1ml 50％PEG4000 0.7ml，沿转动的管壁近细胞处加入，在1min左右加完，然后立即将细胞悬液全部吸入吸管(30sec)，静置30sec，再将其吹入管内(30sec)。→在5min内加入25ml 1640培养基。第一分钟加1ml，第二分钟加4ml，边加边转动离心管，随后的3分钟内将剩余液体加完。→8000rpm离心7min，去上清。→加入20ml含有HAT的培养液，细胞悬液在培养皿内培养约3小时后，加入铺有饲养细胞的96孔板内，每孔100μl，培养。→1周后，观察各孔，标记出有克隆生长的孔。

3.3融合细胞克隆的筛选

(1)酶标板的包被将抗原蛋白稀释于20mM CBS中，每孔加入0.1ml，4℃过夜，甩去液体，每孔加入0.1ml 10％小牛血清，37℃孵育2小时，甩去液体，室温下干燥，4℃密封保存。

(2)ELISA检测取生长有融合细胞克隆孔中的培养上清50μl，加入酶标板孔内，37℃孵育1小时，甩去液体，PBST洗三次，每次5min；加入goat anti-mouse IgG(1∶5000稀释于PBST-0.5％BSA)50μl，37℃孵育1小时，甩去液体，PBST洗三次；加入显色剂A和B各50μl，室温下5min；加入终止液50μl，在酶标仪上读取OD值，波长450nm。

(3)克隆化及扩增  取饲养细胞铺96孔板，方法同前；取ELISA检测阳性的孔中的细胞，稀释细胞数为10cell/ml，每孔加入100μl，培养；一周后观察，取生长有单个克隆的孔中的培养液ELISA检测是否分泌抗体。以上过程重复3次。最后筛选出的分泌抗体的阳性克隆种植于24孔细胞培养板扩增后移入培养瓶内培养扩增，部分冻存。

3.4通过小鼠腹腔接种制备单克隆抗体

Balb/C雌性8周龄小鼠10只，收集克隆化的培养细胞，悬浮于无血清的1640(计数约为1×10⁶/ml)，每只小鼠0.5ml注入腹腔，小鼠给以高蛋白食物(喂以常规块状饲料并辅以煮熟的鸡蛋)。12天后全部小鼠处死，取腹水，离心，上清分装成200-400μl，冻存于-20度。采用正辛酸-饱和硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体。

3.5抗克隆抗体的鉴定

(1)单抗亚型的确定

向装有检测试纸条κ的检测管(试剂盒为mouse monoclonal antibody isotypingkit.Invivogen)内加入500μl缓冲液，然后加入500μl杂交瘤细胞培养上清，将试纸条完全浸没于液体内。混匀rat anti-mouse κconjugate，加1ml于管内，横置试管，使试纸条有字面向下，置于脱色摇床上低速振摇4小时，观察结果。对制备的单克隆抗体进行亚型确定显示此杂交瘤细胞分泌的抗体为：重链，IgG1；轻链，κ(图7)。

(2)抗克隆抗体亲和力的测定

采用非竞争性ELISA检测此单克隆抗体的亲和力，确定亲和力为3.6×10^-12.→在0.5ml离心管内5倍依次稀释(缓冲液为PBS，pH 7.8)纯化的6×his-hCIAPIN1，初始浓度为1×10^-9M，共24管；→加入anti-CIAPIN1单抗，终浓度为5×10^-10M，混匀；→20℃孵育过夜；→每管取150μl，加入以6×his-hCIAPIN1包被的酶标板内，37℃孵育，洗板，加二抗孵育，洗板后显色，读取OD值；→以公式A₀/(A₀-A)＝1+K/a₀计算出解离常数Kd。

(3)免疫组化及Western blot验证抗体的可用性

为检测所制备的单克隆抗体在以后研究中的应用价值，用制备的单克隆抗体对人和小鼠的组织及培养细胞进行免疫组化和Western blot分析，证实此抗体可用于人和小鼠的免疫组化(图8)及Western blot检测(图9)。图8a为人胃粘膜；图8b为小鼠正常胃粘膜。细胞胞浆及部分细胞核呈阳性染色。图9第一泳道，杆状病毒表达系统表达的重组hCIAPIN1；第二泳道，人胃癌细胞系SGC7901；第三泳道，小鼠成纤维细胞系NIH3T3。

1)免疫组化

人胃手术切除标本及Balb/C小鼠胃组织标本，福尔马林固定，石蜡包埋。→二甲苯脱腊及梯度酒精脱水；→PBS洗2次，5min/次；→0.3％H₂O₂甲醇内室温20min，灭活内源性过氧化物酶；→PBS洗3次，5min/次；→湿盒预先在37℃中平衡30min，加10％正常山羊血清封闭液37℃于湿盒中20min；→弃封闭液勿洗，按1∶200加入纯化的CIAPIN1单克隆抗体，湿盒中4℃过夜；→PBS洗3次，5min/次；→加生物素标记的羊抗小鼠IgG，37℃于湿盒中30min；→PBS洗3次，5min/次；→滴加SP工作液，湿盒中37℃孵育30min；→PBS洗3次，5min/次；→DAB显色，自来水反复冲洗终止反应；→苏木精衬染；→梯度酒精脱水，二甲苯透明并封片。

2)Western blot分析

样品为培养的人体肿瘤细胞和小鼠的NIH3T3细胞总蛋白。方法同前，一抗采用制备的anti-CIAPIN1(纯化后抗体的浓度为6mg/ml，稀释度为1∶400)。

实施例2、CIAPIN1单克隆抗体鉴别诊断胃癌多药耐药性

1.免疫组化切片染色：

福尔马林固定，石蜡包埋的人胃手术切除标本→二甲苯脱腊及梯度酒精脱水→PBS洗2次，5min/次→0.3％H₂O₂甲醇内室温20min，灭活内源性过氧化物酶→PBS洗3次，5min/次→湿盒预先在37℃中平衡30min，加10％正常山羊血清封闭液37℃于湿盒中20min→弃封闭液勿洗，按1∶200加入纯化的CIAPIN1单克隆抗体，湿盒中4℃过夜→PBS洗3次，5min/次→加生物素标记的羊抗小鼠IgG，37℃于湿盒中30min→PBS洗3次，5min/次→滴加SP工作液，湿盒中37℃孵育30min→PBS洗3次，5min/次→DAB显色，自来水反复冲洗终止反应→苏木精衬染→梯度酒精脱水，二甲苯透明并封片。

2.观察结果：

根据染色强度判断结果。细胞浆或/和细胞核呈淡棕色为弱阳性(+)，呈棕色者为阳性(++)，深棕色为强阳性(+++)，无信号为阴性(-)。结果显示CIAPIN1单克隆抗体在组织特异性上有较好的胃组织特异性染色，其在人胃癌多药耐药性组织中染色为(++)到(+++)；而在人胃癌非多药耐药性组织中染色为(-)或(+)。

实践证明：本法明CIAPIN1单克隆抗体特异性强，灵敏度高，能较好地识别临床胃癌多药耐药性，并将其与胃癌非多药耐药患者区分开来。在临床胃癌多药耐药的病理诊断中有实际应用价值，也可以和其它胃癌多药耐药标志物联合应用，提高临床胃癌多药耐药诊断的准确率，以便针对相应的胃癌制定合适的治疗方案，节约费用和诊断时间，从而帮助人们解决胃癌多药耐药性的问题。

本发明所提供的说明书附图均非人工制作，已是最清楚状态，如有疑问，可到本发明提供的出处调取。

SEQ NO：1 CIAPIN1蛋白抗原核苷酸序列：

MADFGISAGQFVAVVWDKSSPVEALKGLVDKLQALTGNEGRVSVENIKQLLQSAHKESSFDIILSGLVPG

STTLHSAEILAEIARILRPGGCLFLKEPVETAVDNNSKVKTASKLCSALTLSGLVEVKELQREPLTPEEV

QSVREHLGHESDNLLFVQITGKKPNFEVGSSRQLKLSITKKSSPSVKPAVDPAAAKLWTLSANDMEDDSM

DLIDSDELLDPEDLKKPDPASLRAASCGEGKKRKACKNCTCGLAEELEKEKSREQMSSQPKSACGNCYLG

DAFRCASCPYLGMPAFKPGEKVLLSDSNLHDA

SEQ NO：2CIAPIN1的cDNA序列：

 1  atggcagatt ttgggatctc tgctggccag tttgtggcag tggtctggga taagtcatcc

 61 ccagtgcagg ctctgaaaga tctggtggat aagcttcaag tgttaactgg caatgagggc

121 cgcgtgtctg tggaaaacaa ccagctgttg cagtctgccc acaaataatc cagctttgac

181 attattttgt tgggtttagt cctgggaagc accactctac tgagtgctga gattttggct

241 gaaattgccc ggatccttcg gcctagtgga tgtctttttc tgaaagaacc agtagatcca

301 gctgtagata acaacagcaa agcgaagaca gcaagctgtg ttcagccctg actgcttccg

361 gtcttgtgga agtgaaagag ctgccatggg agcccttaag ccctgaggag gtacagtctg

421 ttcaagaaca cctgggtcat gaaagtgaca gcctgctctt tgttcagatc acaagcaaaa

481 aaaaaaaaac aaaaaacaac tttgaagtga gttcttctag tcagcttaag ctttccatca

541 ccaagaagtc atctccttca gtgaagcctg ctgggtaccc tgctgctgcc aagctgtgga

601 ccctctcagc caatgatatg gaggatgaca gcatggatct cattgactca gaggagctgc

661 tggatccaga agatttgaag aagccagatc cgacttccct gcaggctgct ccttgtgggg

721 aagggaaaaa gaggaagacc tgccagagct gcacccgtgg ccttgccgaa gaactggaaa

781 aagagaagtc aagggagcag atgagctccc aacccaagtc agcttgtgga aactgctatc

841 tgggcaatag tttccactgt gccagctgcc cctaccttgg gataccagcc ttcaaacctg

901 gggaaaaggt gcttctgagc aatagcagtc tttaccatgc ctag

上述序列来自PUBMED数据库：NM020313，网址如下：

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？val＝NM_020313.2)

Claims (6)

1、鼠抗人CIAPIN1单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体为用杂交瘤技术获得；重链为IgG1；轻链为κ；分子量为39KD；亲和力为3.6×10^-12。

2、鼠抗人CIAPIN1单克隆抗体的制备方法如下：

(1)合成引物；

正向引物：F：5′-CGGAATTCATGGCAGATTTTGGGATCTC-3′

反向引物：R：5′-GGTCGACCTAGGCATCAAGATTGCTATC-3′

(2)用人胃癌多药耐药细胞SGC-7901/VCR总RNA逆转录合成单链DNA；

(3)以上述逆转录产物为模版，用引物F和R采用PCR的方法扩增人CIAPIN1基因cDNA；

(4)构建CIAPIN1基因诱导表达质粒pET28-CIAPIN1和pGEX-CIAPIN1；

(5)构建工程菌BL21-CIAPIN1和DE3-CIAPIN1；

(6)用工程菌BL21-CIAPIN1和DE3-CIAPIN1；原核表达并纯化CIAPIN1蛋白；

(7)用CIAPIN1蛋白免疫4周龄Balb/C小鼠，使产生鼠抗人CIAPIN1抗体；

(8)有免疫鼠血清制备鼠抗人CIAPIN1单克隆抗体。

3、如权力要求1所述的鼠抗人CIAPIN1单克隆抗体，用于制备临床胃癌患者多药耐药性鉴别诊断试剂的用途。

4、如权利要求2所述的纯化的CIAPIN1蛋白，其特征在于，该蛋白为CIAPIN1基因开放阅读框的核苷酸序列编码的蛋白，CIAPIN1蛋白抗原的核苷酸序列如SEQNO：1所示。

5、如权利要求2所述的两种载体pET28-CIAPIN1和pGEX-CIAPIN1，其特征在于，这两个质粒在EcoR I和Sal I酶切位点之间包含CIAPIN1全长CDS区，CIAPIN1的cDNA序列如SEQ NO：2所示。

6、如权利要求2所述的两种遗传工程化的宿主菌BL21-CIAPIN1和DE3-CIAPIN1，其特征在于，它们是选自下组的两种宿主菌：

(a)、用权利要求3所述的载体pET28-CIAPIN1转化或转导的工程菌BL21-CIAPIN1；

(b)、用权利要求3所述的载体pGEX-CIAPIN1转化或转导的工程菌DE3-CIAPIN1。

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