CN112795543B - 杂交瘤细胞株及其分泌的抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种杂交瘤细胞株及其分泌的抗草鱼IL‑15Rα单克隆抗体和应用，所述杂交瘤细胞株已于2021年01月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:C202135。本发明针对现有技术中草鱼IL‑15Rα单克隆抗体缺失的问题，采用重组草鱼IL‑15Rα的Sushi结构域蛋白作为抗原免疫小鼠，并筛选得到了一株可特异性分泌抗草鱼IL‑15Rα单克隆抗体的杂交瘤细胞株E7‑17，其分泌产生的单克隆抗体可特异性地识别草鱼IL‑15Rα蛋白，并且效价高，因此可用于特异性识别检测草鱼IL‑15Rα蛋白及草鱼IL‑15Rα阳性细胞，实现对草鱼IL‑15Rα阳性细胞的分离与功能研究，识别特异性高，反应灵敏。

Description

杂交瘤细胞株及其分泌的抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体和应用

技术领域

本发明属于蛋白检测技术领域，具体涉及一种杂交瘤细胞株及其分泌的抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体和应用。

背景技术

IL-15Rα，即IL-15受体α链，其可与IL-2/15β亚基和γ链亚基组成IL-15的异源三聚体受体。IL-2/15β亚基和γ链亚基亦可以与IL-2Rα组成IL-2的异源三聚体受体。IL-2Rα也被称为CD25，其在哺乳动物中主要表达于T细胞和B细胞。研究表明，CD25可作为哺乳动物Treg细胞和部分Breg细胞的一种特异性表面标志分子，Treg细胞和Breg细胞可以通过分泌一些抗炎细胞因子如IL-10、TGF-β和IL-35等发挥免疫抑制作用。

IL-15Rα和IL-2Rα基因在哺乳动物中位于同一条染色体且基因座的位置紧密相连，并且都具有Sushi结构域(Anderson et al.,1995,Functional characterization ofthe human interleukin-15 receptorαchain and close linkage of IL15RA and IL2RAgenes,Journal of Biological Chemistry,270(50):29862-29869.)。但是，IL-2Rα包含两个Sushi结构域，而IL-15Rα仅包含一个Sushi结构域。鱼类中目前仅发现IL-15Rα分子，体外实验证实其既可以与IL-15结合又可以和IL-2结合，并且其与IL-15的结合能力强于其与IL-2的结合。鱼类IL-15Rα分子既具有哺乳动物IL-15Rα类似的活性，又具有哺乳动物IL-2Rα类似的活性，且已有研究证实鱼类CD4⁺IL-15Rα⁺细胞具有类似于哺乳动物Treg细胞的功能。因此，鱼类IL-15Rα分子也被称为CD25-like(Wen et al.,2011,Identification ofTreg-like cells in Tetraodon:insight into the origin of regulatory T subsetsduring early vertebrate evolution,Cellular&Molecular Life Sciences,68(15):2615-2626.)。

Treg细胞和Breg细胞在维持机体的免疫平衡中发挥着重要的作用，检测其细胞比例可用于反映草鱼炎症反应过程。但是，特异性抗体的缺乏限制了草鱼Treg细胞和Breg细胞的检测。因此，急需发展准确、特异的IL-15Rα单克隆抗体用于检测草鱼Treg细胞和Breg细胞，为监测草鱼炎症过程提供参数指标。

发明内容

本发明针对现有技术中草鱼IL-15Rα单克隆抗体缺失的问题，提供了一种抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述单克隆抗体可特异性地识别草鱼IL-15Rα蛋白，而不与草鱼的其他蛋白发生反应，并且效价大于64000，因此可用于特异性检测草鱼IL-15Rα蛋白，特异性高，反应灵敏。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明提供了一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为：CCTCC NO:C202135。所述杂交瘤细胞株是采用重组草鱼IL-15Rα的Sushi结构域蛋白作为抗原免疫小鼠得到的，将其命名为杂交瘤细胞株E7-17，已于2021年01月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉市武汉大学。

本发明还提供了一种抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体，所述抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体由上述杂交瘤细胞株E7-17或其传代细胞株分泌产生。

进一步的，所述抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体的制备方法为：取上述杂交瘤细胞株E7-17的培养上清液和/或将上述杂交瘤细胞株E7-17注射于小鼠体内后取小鼠腹水，经分离纯化后得到所述抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体。

本发明还提供了上述抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体在检测草鱼IL-15Rα蛋白中的应用。通过检测草鱼IL-15Rα蛋白，并结合其他特异性抗体如CD4、IgM和IgT等可用于检测草鱼体内T细胞和B细胞比例，进而反映草鱼炎症反应过程，为监测草鱼炎症提供参数指标。

本发明还提供了上述抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体在分选IL-15Rα阳性细胞和/或分析IL-15Rα阳性细胞比例中的应用。

本发明还提供了一种草鱼IL-15Rα蛋白检测试剂盒，所述试剂盒包括上述抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体。

进一步的，所述检测试剂盒为ELISA检测试剂盒。

进一步的，所述检测试剂盒为胶体金免疫层析检测试剂盒。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明针对现有技术中草鱼IL-15Rα单克隆抗体缺失的问题，采用重组草鱼IL-15Rα的Sushi结构域蛋白作为抗原免疫小鼠并筛选得到了一株可特异性分泌抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体的杂交瘤细胞株E7-17，所述杂交瘤细胞株E7-17分泌产生的单克隆抗体可特异性地识别草鱼IL-15Rα蛋白，而不与草鱼的其他蛋白发生反应，并且效价高，因此可用于特异性识别检测草鱼IL-15Rα蛋白及草鱼IL-15Rα阳性细胞，实现对草鱼IL-15Rα阳性细胞的分离与功能研究，识别特异性高，反应灵敏。

附图说明

图1为本发明实施例1中重组草鱼IL-15Rα蛋白的SDS-PAGE检测结果图；

图2为本发明实施例3中Western-blot检测结果图，其中上半部分的WB:GST表示用GST抗体杂交的条带，下半部分的WB：IL-15Rα表示用抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体杂交的条带；

图3为本发明实施例3中流式细胞术分选及qRT-PCR检测结果图，其中图A表示流式细胞术分选检测结果图，图B表示分选的两种细胞中IL-15Rα基因的表达水平，图C表示白细胞不同亚群中IL-15Rα⁺细胞比例的检测结果。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1草鱼IL-15Rα抗原的制备

1.1草鱼IL-15Rα的克隆

根据Genebank中IL-15Rα及其异构体(基因登录号：KT192440.1、KT192441.1、KT192442.1、KT192443.1和KT192444.1)的基因序列设计特异性引物，上游引物引入EcoR I酶切位点，下游引物引入Xhol I酶切位点。

上游引物为：CGGAATTCCATAATTTTGCCAGAGCAAGCG

下游引物：CCGCTCGAGCTATTGTGGCTTTTTGGGATCAGGTA

以草鱼头肾cDNA为模板，PCR扩增IL-15Rα基因，将扩增到的片段连接到pMD-18T载体上，选择测序鉴定正确的质粒以EcoR I和Xhol I进行双酶切，将酶切后的片段连接至经相同酶切位点酶切后的pGX-4T-1质粒上，转化DH5α感受态细胞，通过氨苄抗性筛选得到的阳性质粒pGEX-4T-1-IL-15Rα再转化大肠杆菌BL21(DE3)，通过抗性筛选阳性表达菌株。

1.2重组草鱼IL-15Rα蛋白的诱导表达及纯化

1)接种表达菌株至1L含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.6时，加入IPTG至终浓度为0.4mM，18℃、120rpm诱导培养12h；

2)4℃离心收集菌体，然后将菌体重悬于30mL预冷的结合缓冲液(500mM NaCl,20mM Tris,1mM EDTA,0.1％Triton X-100,pH＝7.5)中，高压破碎(1200psi，破碎三次)，4℃，18000g离心20min，收集上清；

3)将经过0.4μm滤膜过滤后的菌液上清与1.5mL Glutathione Sepharose 4B树脂(预先用结合缓冲液平衡)于4℃旋转孵育2h；

4)将混合物加入PD-10亲和柱，弃掉流穿液；

5)加入漂洗缓冲液1(500mM NaCl,20mM Na₂HPO₄,1mM EDTA,0.1％Triton X-100,pH＝5.0)洗涤树脂至无蛋白流出；

6)加入漂洗缓冲液2(500mM NaCl,20mM Tris,1mM EDTA,0.1％Triton X-100,pH＝9.0)洗涤树脂至无蛋白流出；

7)加入洗脱缓冲液(150mM NaCl,20mM Tris,20mM reduced glutathione,pH＝7.4)，孵育15min，收集流穿液，即为含与GST融合表达的蛋白；

8)SDS-PAGE检测蛋白纯度，检测结果如图1所示。

9)纯化的重组草鱼IL-15Rα蛋白装入孔径为3kDa的透析袋并放入PBS中透析，透析过程在4℃中搅拌进行；24h后，收集透析袋中液体，4℃，18000g离心20min，收集上清，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。

实施例2单克隆抗体的制备

2.1动物免疫

2.1.1动物:6～8周龄BALB/c小鼠5只。

2.1.2抗原：实施例1中制备的重组草鱼IL-15Rα蛋白。

2.1.3免疫途径及程序：重组草鱼IL-15Rα蛋白50μL(约40μg)与等体积弗氏完全佐剂充分混合乳化，于小鼠背部皮下多点注射。两周后加强免疫两次，每次间隔两周，加强免疫时重组IL-15Rα蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化，背部皮下多点注射。第二次加强免疫后第7天取尾血20μL，ELISA检测抗体效价。抗体效价达到要求时加强免疫一次，于3天后取脾脏，进行细胞融合。

2.2细胞融合与培养

2.2.1细胞融合：将小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0以5:1的细胞比例混合，1000rpm离心10min，倒掉上清，用100μL移液器吸去残余液体。食指轻弹试管，打散细胞团块。吸取1mL PEG-4000，缓慢加入试管中，边加边晃动，控制在1min内加完，轻轻搅动一分钟。随后缓慢加入1mL完全培养基，控制在1min中内加完。再加入3mL完全培养基，控制在3min中内加完。最后加入5mL完全培养基，控制在1min中内加完。整个融合过程须在37℃水浴中进行。1000rpm离心10min，去除上清，完成细胞融合。

2.2.2细胞培养：将离心后的细胞团块轻轻弹散，用HAT培养基重悬，加入到已用大鼠胸腺细胞铺好的96孔板中，每孔200μL。置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养。一周后，于显微镜下观察克隆生长情况并记录每孔克隆数。待细胞生长至占培养孔底1/3面积时即可吸取培养液上清进行ELISA检测。

2.3阳性克隆的筛选与亚克隆

2.3.1阳性克隆的筛选：以重组草鱼IL-15Rα蛋白包被ELISA板，4℃孵育。次日洗涤、封闭后每孔加入100μL待检测杂交瘤细胞培养上清，37℃孵育1h；弃置上清后每孔加入稀释后的羊抗鼠IgG-HRP，37℃孵育1h。弃置上清，每孔加入TMB显色液，室温显示10～30min后，每孔加入50μL终止液终止反应。用酶标仪450nm检测吸光值，吸光值大于阴性对照2倍以上为阳性，选择阳性克隆进行亚克隆。

2.3.2杂交瘤细胞的亚克隆：将ELISA检测为阳性的杂交瘤细胞从培养板中轻轻洗脱计数，用培养液连续稀释细胞悬液接种于铺有大鼠胸腺细胞的96孔板中，100μL每孔。培养10天左右，杂交瘤细胞集落长至孔底1/3面积时，开始测定上清中抗体活性。对有抗体活性的阳性克隆再进行亚克隆，共进行3次。反复筛选后最终获得一株稳定表达抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将其命名为杂交瘤细胞株E7-17，已于2021年01月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉市武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:C202135。

2.4单克隆抗体大量制备：将上述筛选到的细胞株E7-17注射到经降植烷处理的BALB/c小鼠腹腔中，每只小鼠的注射量为5×10⁷个细胞，10～14天后待小鼠腹部明显膨胀后采集腹水。将收集后的腹水离心后取上清进行亲和层析纯化，即得所述抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体。

实施例3单克隆抗体的鉴定

3.1抗体亚类

将羊抗鼠IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA和IgM分别包被至ELISA板中，4℃过夜或37℃孵育2h；用洗涤液洗涤3次，随后每孔加入100μL待检测的单克隆抗体，37℃孵育1h；洗涤3次后加入稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠多价免疫球蛋白(IgA、IgM和IgG)抗体，每孔100μL，37℃孵育1h；洗涤3次后，每孔加入TMB底物溶液100μL，37℃避光孵育20min；随后每孔加入终止液终止反应。在酶标仪上读取OD₄₅₀吸光值，以阳性反应孔包被的亚类类别为待测上清的抗体类别。鉴定结果表明，本发明制备的抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体亚类为IgG1。

3.2Western-blot检测

原核表达草鱼IL-15Rα的各异构体IL-15Rα-1、IL-15Rα-2、IL-15Rα-3、IL-15Rα-4和IL-15Rα-5(其中草鱼IL-15Rα-1和IL-15Rα-5基因编码相同蛋白，故将其编码的蛋白命名为IL-15Rα-1/5，其余异构体蛋白分别命名为IL-15Rα-2、IL-15Rα-3和IL-15Rα-4)。将诱导表达后的大肠杆菌BL21(DE3)菌液超声破碎，金属浴中100℃煮10min；12000g，4℃离心5min取上清，用于Western-blot检测。以实施例2制备得到的抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG为二抗，采用ECL系统曝光存图。

检测结果如图2所示，其中上半部分的WB:GST表示用GST抗体杂交的条带，下半部分的WB：IL-15Rα表示用抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体杂交的条带。结果显示，本发明制备的抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体可以特异性识别草鱼IL-15Rα五种异构体编码的四种蛋白。

3.3流式细胞术分选检测

采用Percoll密度梯度离心法分离草鱼头肾白细胞，细胞计数后取1mL白细胞加入2mL EP管中(约10⁷细胞)。向细胞悬液中加入抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体，冰上孵育1h，期间轻轻涡旋细胞两次；PBS洗涤两次，加入PE标记的山羊抗小鼠IgG抗体，冰上孵育30min，轻轻涡旋一次；PBS洗涤两次，流式细胞仪分选各亚群IL-15Rα阳性和阴性细胞，以只加二抗未加一抗的细胞作为阴性对照。分选检测结果如图3中图A所示，图A的上图从左至右依次表示淋巴细胞亚群、仅加入二抗和加入两种抗体后淋巴细胞亚群中的分选结果图，下图从左至右依次表示髓样细胞亚群Ⅰ、仅加入二抗和加入两种抗体后髓样细胞亚群Ⅰ中的分选结果图，结果显示，利用本发明的抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体可在不同亚群中实现细胞分选。

分别提取所分选到的细胞的总RNA，反转录为cDNA，qRT-PCR检测IL-15Rα基因在分选细胞中的表达水平，结果如图3中图B所示，结果显示，IL-15RαmRNA在IL-15Rα阳性(IL-15Rα⁺)细胞中的表达水平显著高于IL-15Rα阴性(IL-15Rα^-)细胞中的表达水平，即利用本发明所述的抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体结合流式细胞术可实现对IL-15Rα⁺细胞的分选。同时利用流式细胞仪可检测IL-15Rα⁺细胞的比例，结果如图3中图C所示，其中Lymphocytes表示淋巴细胞亚群中IL-15Rα⁺细胞的比例，结果为43.4％±10.6，Myeloid cell subsetⅠ表示髓样细胞亚群Ⅰ中IL-15Rα⁺细胞的比例，结果为20.5％±4.9。

3.4抗体效价检测

采用ELISA法检测所述抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体的效价。酶标板各孔加入2μg重组草鱼IL-15Rα蛋白，4℃过夜孵育；PBS洗涤两次，加入100μL封闭液，37℃封闭1h，PBST洗涤三次；将抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体用封闭液按照1:1000、1:4000、1:16000、1:32000和1:64000进行稀释，稀释后的抗体分别加至蛋白包被过的孔中，每孔100μL，各稀释梯度设置三个重复，只加重组蛋白不加一抗的孔设为空白对照，加入未免疫小鼠IgG的孔设为阴性对照，37℃孵育1h，PBST洗涤三次；每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体，37℃孵育30min，PBST洗涤三次；加入100μL底物反应液，37℃避光放置10min；加入50μL终止液，分光光度计450nm波长下检测吸光度值，结果如表1所示。根据表1的检测结果，本发明所述的抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体的效价大于64000。

表1抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体效价

综上所述，本发明制备得到的单克隆抗体可特异性识别并检测草鱼IL-15Rα蛋白，进而特异性分选草鱼IL-15Rα⁺细胞并分析IL-15Rα⁺细胞比例，弥补了目前尚无特异性抗体进行流式细胞术分选的不足，检测特异性高、反应灵敏。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为：CCTCC NO:C202135。

2.一种抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体，其特征在于，所述抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。

3.如权利要求2所述的抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体在制备检测草鱼IL-15Rα蛋白的试剂中的应用。

4.如权利要求2所述的抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体在制备分选草鱼IL-15Rα阳性细胞和/或分析草鱼IL-15Rα阳性细胞比例的试剂中的应用。

5.一种草鱼IL-15Rα蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括如权利要求2所述的抗草鱼IL-15Rα单克隆抗体。

6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒为ELISA检测试剂盒。

7.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒为胶体金免疫层析检测试剂盒。

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