CN110551729A - 一种红鳍东方鲀白介素15受体基因IL-15Rα及其应用 - Google Patents

一种红鳍东方鲀白介素15受体基因IL-15Rα及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种红鳍东方鲀白介素15受体基因IL‑15Rα，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。以及所述红鳍东方鲀白介素15受体基因IL‑15Rα的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。还公开了一种包含上述红鳍东方鲀白介素15受体基因IL‑15Rα的重组表达质粒和重组表达载体，以及由所述重组表达载体按常规方法免疫的大鼠形成的单克隆抗体和以及重组蛋白。本发明还公开了上述受体基因IL‑15Rα、其编码蛋白以及重组蛋白在识别IL‑2并激活其介导的细胞因子受体系统信号通路、活化免疫细胞和提高鱼体免疫力方面的应用。

Description

一种红鳍东方鲀白介素15受体基因IL-15Rα及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种红鳍东方鲀白介素15受体基因IL-15Rα及其应用。
背景技术
高等脊椎动物体内的淋巴细胞种类及其数量的恒定是通过新生或者活化的淋巴细胞和凋亡淋巴细胞之间的相对平衡维系的，而淋巴细胞的存活或者凋亡是由许多不同的细胞因子、抗原和激素参与激活的信号通路决定的。
白细胞介素(IL)是细胞因子的主要成员，是由某些白细胞合成并分泌的，能影响自身或其它白细胞，进而调节机体免疫反应。随着人和小鼠基因组计划的不断深入以及各种模式动物的运用，科学家发现越来越多的白细胞介素参与机体免疫调节；到目前为止，发现了大约30种白细胞介素。其中，IL-2家族的细胞因子在维持淋巴细胞的动态平衡中扮演着非常重要的角色。IL-2家族成员包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21，起初它们都被发现是T细胞生长因子，后来逐渐发现它们对不同的细胞也有重要作用。其中，IL-2和IL-15是研究得最为深入的两种细胞因子。
在哺乳类系统中，IL-15最初作为一种与IL-2具有相同T细胞活化功能的因子而被发现。目前研究表明，IL-15在NK细胞的发生和分化过程中扮演关键角色，且对记忆T细胞的存活和增殖起重要作用。虽然IL-15与IL-2序列相似性很低，但是与其它IL-2家族成员一样，IL-15具有4个α螺旋结构。它们在功能上有许多相似之处，但也有着各自独特的作用。在非哺乳动物中，鸡的IL-15基因已被报道，虽然与哺乳类同源基因的蛋白序列相似性很低，但是鸡IL-15具有保守的基因结构和蛋白结构，以及相似的基因表达模式，并能活化T细胞和NK细胞。此外，近年来在硬骨鱼如泥鳅、虹鳟中也发现了IL-15及其受体IL-15Rα基因的存在，并证实其能够参与IFNγ的表达调控。
在哺乳类系统中，IL-2的多功能活性是通过膜受体复合物(IL-2R)介导，它包括三个不同的亚基：IL-2Rα(CD25)、IL-2/15Rβ以及γc。IL-2Rα是IL-2低亲和力受体亚基，结合力低而且不介导信号。IL-2Rβ单独与IL-2的结合力非常低，而γc单独不与IL-2结合，但在IL-2存在的情况下，IL-2Rβ和γc组成中等结合力的复合物，可以转导信号，引起受体胞内区的异质双聚化作用(heterodimerization)并激活下游信号途径。IL-2Rα联合其它两个受体亚基形成高亲和力的功能性受体，介导IL-2的生物学功能。与IL-2相似，IL-15也能以中等亲和力，与IL-2/15Rβ和γc组成的异质双聚化复合物结合，并介导信号；IL-15Rα亚基与它们构成IL-15的高亲和力受体复合物。但是，在没有IL-2/15Rβ和γc亚基的参与下，IL-15Rα亚基仍能单独与配体结合，而且保持高亲和力。IL-15Rα与配体的结合力比IL-2Rα与配体的结合力高约1000倍，也是它们相互区别的特征之一。
红鳍东方鲀为鲀形目(Tetraodontiformes)，海水鱼类，是我国主要的东方鲀养殖种类之一，在北方养殖量较大。其肉质鲜美，营养丰富，具有高蛋白、低脂肪的特点，有很高的经济价值。随着海水养殖环境的不断恶化，红鳍东方鲀个体抗病力的弱化,病害时有发生,这严重影响了其养殖、生产和出口，造成了巨大的经济损失。
IL-15Rα是介导IL-15信号转导的高亲和力膜受体复合物的重要亚基。TMHMM蛋白结构预测显示红鳍东方鲀IL-15Rα为单次跨膜蛋白；荧光显微镜和流式细胞仪分析均显示整合红鳍东方鲀IL-15Rα基因的NRK-52E细胞在膜上表达了重组蛋白融合标签，说明重组红鳍东方鲀IL-15Rα能正确跨膜并表达于细胞膜表面，是一种膜受体蛋白。哺乳类IL-15Rα最初在D10细胞(T辅助细胞株)被发现并克隆，通过流式细胞术检测出这种细胞能高效结合IL-15，说明IL-15Rα是一种膜蛋白受体；随后的研究表明IL-15Rα广泛表达于各种哺乳类免疫细胞和非免疫细胞膜表面。结合这些研究结果，说明红鳍东方鲀IL-15Rα和其它脊椎动物一样，是通过膜蛋白形式结合配体从而介导信号转导的。此外，在哺乳类中，天然IL-15Rα膜蛋白能够被蛋白酶水解，产生只含胞外区的可溶性IL-15Rα(sIL-15Rα)片段，而且大肠杆菌表达的sIL-15Rα亦保持与IL-15的高亲和力，从而降低配体水平并抑制其功能的发挥。另一方面，Rubinstein等(2006)利用哺乳细胞表达了sIL-15Rα-Fc融合蛋白，发现它能结合IL-15并增强其体内和体外的生物学功能。随后，Sigrid Dubois等(2008)发现在小鼠中，IL-15与IL-15Rα-IgG1-Fc联合可以增强其自身活性，进而在体内和体外诱导NK细胞和CD8+/CD44high T细胞增殖。Kutlu G.Elpek等(2010)发现IL-15/IL-15Rα复合体对NK细胞和CD8+T细胞的持续刺激会导致其活性及功能的损伤，但是慢性刺激能够稳定的发挥其免疫效应，这对免疫治疗和疫苗的制备具有重要意义。Jing Chen等(2013)发现IL-15和IL-15Rα的紊乱可能参与了I型糖尿病的发病机制，IL-15/IL15Rα系统及其信号通路可能是早期I型糖尿病的合理治疗靶点。Meiqi Zhao等(2019)评价了IL-15·SIL-15Rα/Fc和抗PD-1单克隆抗体联合应用的效果，为联合应用该策略刺激宿主对癌症的强烈免疫提供了证据。同年4月，Cristina Bergamaschi等研究发现了一种前所未有的细胞因子-受体生物合成途径，其中IL-15Rα作为IL-15的伴侣，随后膜结合的IL-15Rα-IL-15复合物通过直接接触细胞激活NK细胞。5月，Run Xiao等发现脂肪特异的IL-15/IL-15Ra复合载体是一种新的安全有效的基因免疫疗法。此外IL-15Rα在鱼类中也有相关报道。Wei Fang等(2007)首次在硬骨鱼虹鳟中克隆得到IL-15Rα。Jin-Sol Bae等(2013)克隆得到了条石鲷IL-15及IL-15Rα的cDNA序列，并探究了二者在病毒和细菌感染后的表达模式。XiaoyaoChen等(2018)在泥鳅中克隆得到了IL-15及IL-15Rα的cDNA序列，并探究了其在细菌、寄生虫和真菌感染中的重要作用。至于在红鳍东方鲀中，IL-15及IL-15Rα是否能够协同参与调节细菌等病原微生物引起的免疫反应，有待于深入研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种红鳍东方鲀白介素15受体基因IL-15Rα及其编码蛋白。
本发明的目的还在于提供一种包含上述红鳍东方鲀白介素15受体基因IL-15Rα的重组表达质粒和重组表达菌株。
本发明的第三个目的在于提供一种单克隆抗体的制备方法以及一种IL-15Rα重组蛋白。
本发明的最后一个目的在于提供上述红鳍东方鲀白介素15受体基因IL-15Rα、其编码蛋白以及IL-15Rα重组蛋白的新用途。
本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种红鳍东方鲀白介素15受体基因IL-15Rα，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
具体的，红鳍东方鲀白介素15受体基因IL-15RαcDNA全长为1153bp，如SEQ ID NO:3所示，拼接的正确性通过全长ORF克隆(IL-15RA-ORF-B1-3)并测序验证。红鳍东方鲀IL-15RαcDNA全长包括：5′-UTR为139bp，ORF为603bp，3′-UTR为338bp，接着为73bp的Poly(A)尾。此外，多聚腺苷酸加尾信号AATAAA在Poly(A)尾上游27bp位置。
上述红鳍东方鲀白介素15受体基因IL-15Rα的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
具体的，红鳍东方鲀IL-15Rα cDNA编码200aa的多肽，蛋白结构包含150aa的胞外区、23aa(氨基酸位点151～173)的单次跨膜区和27aa的胞内区，其中胞外区具有一个sushi结构域。此外，其具有多个糖基化位点，预测蛋白分子量约为18.7kDa。
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种重组表达质粒，包括上述红鳍东方鲀白介素15受体基因IL-15Rα。
该重组表达质粒的制备方法，将上述受体基因IL-15Rα成熟肽编码cDNA克隆至pFlag-CMV-1载体，构建融合前胰岛素原信号肽和Flag标签的编码序列，将所述编码序列通过pENTR/D-TOPO载体重组交换至目的载体pMX-puro-GW中，构建成含有重组IL-15Rα的逆转录病毒表达质粒pMX-FL-15Rα。
本发明还提供了一种重组表达菌株，包括上述红鳍东方鲀白介素15受体基因IL-15Rα。
该重组表达菌株的制备方法，将上述受体基因IL-15Rα成熟肽编码cDNA克隆至pFlag-CMV-1载体，构建融合前胰岛素原信号肽和Flag标签的编码序列，将所述编码序列通过pENTR/D-TOPO载体重组交换至目的载体pMX-puro-GW中，构建成含有重组IL-15Rα的逆转录病毒表达质粒pMX-FL-15Rα，再经感染靶细胞NRK-52E得到重组表达菌株FL-15RA-NRK。
本发明的上述第三个目的可以通过以下技术方案来实现：一种单克隆抗体的制备方法，采用上述重组表达菌株免疫大鼠，分离免疫大鼠的外周淋巴结细胞，并与骨髓瘤细胞进行融合后，经过HAT筛选，收集杂交瘤细胞，腹腔接种至裸鼠，诱发腹水，收集腹水，腹水离心，取上清液并进行灭活处理，稀释后用滤膜过滤，获得单克隆抗体。
本发明还提供了一种IL-15Rα重组蛋白，通过以下方法制备获得：采用上述重组表达菌株免疫大鼠，分离免疫大鼠的外周淋巴结细胞，并与骨髓瘤细胞进行融合后，经过HAT筛选，收集杂交瘤细胞，制备细胞裂解液，将细胞裂解液加入抗体-琼脂糖凝胶颗粒悬浮液中；洗涤去上清，变性液洗脱目的蛋白，即获得IL-15Rα重组蛋白。
该重组蛋白的制备方法，是通过高效的病毒包装系统(PLAT-E)，成功筛选得到一株稳定表达重组红鳍东方鲀IL-15Rα膜蛋白的哺乳动物细胞株FL-15Rα-NRK；通过常规方法细胞免疫大鼠，制备能特异识别重组IL-15Rα膜蛋白的单克隆抗体2E6；并以2E6通过常规免疫共沉淀分离得到重组IL-15Rα蛋白。
本发明的最后一个目的可以通过以下技术方案来实现的：上述红鳍东方鲀白介素15受体基因IL-15Rα、上述编码蛋白以及上述重组蛋白在识别IL-2并激活其介导的细胞因子受体系统信号通路、活化免疫细胞和提高鱼体免疫力方面的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明在红鳍东方鲀白细胞介素(IL)-15受体IL-15Rα亚基的功能分析及其编码蛋白在鱼类先天免疫过程中的应用方面进行了研究；
(2)本发明获得了一个高效、稳定的表达蛋白，获得的抗体特异性高，极大的减少了假阳性；
(3)本发明通过高效的病毒包装系统(PLAT-E)，成功筛选得到一株稳定表达重组红鳍东方鲀IL-15Rα膜蛋白的哺乳动物细胞株FL-15Rα-NRK；通过细胞免疫大鼠，制备能特异识别重组IL-15Rα膜蛋白的单克隆抗体2E6；并以2E6通过免疫共沉淀分离得到重组IL-15Rα蛋白；
(4)本发明中的红鳍东方鲀白介素15受体蛋白IL-15Rα能与配体IL-2结合，但未能与IL-15或IL-15L结合，说明鱼类可能利用不同于哺乳类的细胞因子受体系统介导信号转导。IL-15Rα与IL-2结合，从而活化免疫细胞的生物学功能，有望应用于实际生产中，提高鱼体免疫力增强鱼体免疫力。
附图说明
图1是实施例1中红鳍东方鲀IL-15RαcDNA扩增琼脂糖电泳图；
图2-1是实施例2中红鳍东方鲀IL-15Rα编码片断和pFlag-CMV-1载体酶切产物电泳图；
图2-2是实施例2中红鳍东方鲀IL-15Rα和Flag蛋白标签编码cDNA扩增产物电泳图；
图3-1是实施例3中荧光显微镜下可以看到FL-15Rα-NRK被激发荧光检测到；
图3-2是实施例3中流式细胞仪检测MX-NRK细胞(左)和FL-15Rα-NRK(右)荧光信号，FL-15Rα-NRK细胞能够稳定表达红鳍东方鲀IL-15Rα；
图4-1是实施例4中流式细胞仪检测免疫血清效价，单克隆抗体2E6能够与IL--15Rα结合，1、2和3分别为FL-15Rα-NRK与稀释250、50和10倍免疫大鼠血清孵育后结果；NC为FL-15Rα-NRK与10倍稀释免疫前大鼠血清孵育结果。X轴代表结合信号强度；
图4-2是实施例4中流式细胞仪检测MX-NRK细胞和FL-15Rα-NRK与不同稀释倍数的单克隆抗体2E6孵育后都能够结合，且结合强度稳定；
图4-3是实施例4中单克隆抗体2E6属于IgG2a亚类；
图4-4是实施例4中流式细胞仪检测MX-NRK细胞(左)和15Rα-NRK(右)与单克隆抗体2E6孵育后荧光信号为阳性；
图5是实施例5中Western杂交检测到了红鳍东方鲀IL-15Rα蛋白的表达；
图6-1是实施例6中PCR扩增红鳍东方鲀IL-2、IL-15和IL-15L成熟肽cDNA电泳图；
图6-2是实施例6中PCR鉴定红鳍东方鲀IL-2(A)、IL-15(B)和IL-15L(C)筛选到了阳性的酵母重组子；
图6-3是实施例6中Western杂交检测到重组红鳍东方鲀IL-2、IL-15和IL-15L蛋白的表达；
图7是实施例7中流式细胞仪检测结果显示红鳍东方鲀IL-15Rα能够和IL-2结合；
图8是实施例8中不同浓度重组红鳍东方鲀IL2、IL-15和IL-15L蛋白能够增强黑青斑河鲀头肾细胞(A)和斜带石斑鱼胸腺细胞(B)增殖程度。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的应用方法。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的生试剂原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。
实施例1红鳍东方鲀IL-15Rα基因的克隆
1)红鳍东方鲀总RNA的提取
取健康的红鳍东方鲀于冰上麻醉，分离脾脏组织，采用Trizol试剂提取其总RNA。
2)cDNA第一链的合成
取1μg红鳍东方鲀脾脏组织总RNA样品进行DNA酶处理以去除基因组DNA的污染；与RNA Oligo(dT)混合，进行反转录，所得产物置于-20℃保存备用。
3)红鳍东方鲀IL-15Rα基因cDNA全序列的克隆
设计特异性引物，上游引物为15RA-F7：5′-TTTACCGACGCCGACCTGTTGT-3′；下游引物为15RA-R4：5′-AGTCTTTGCCAGGTTCAGATAA-3′，扩增结果如图1，1和2分别为5′-RACE第一和第二轮产物电泳结果，4和3分别为3-RACE第一和第二轮产物电泳结果；其中M为DNA分子量标记(1057、770、612、495、392、345、297bp)。IL-15Rα5′产物预计条带约320bp，3′产物预计条带约960bp，分别以短箭头标出。
4)PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳后，割下预计条带，使用胶回收试剂盒(Qiagen)进行DNA回收，然后将纯化产物连接至pGEM-T载体。
5)将连接产物，转化至DH5α大肠杆菌后挑选阳性克隆测序。经两者拼接，得到红鳍东方鲀IL-15RαcDNA全长为1153bp，拼接的正确性通过全长克隆(IL-15RA-ORF-B1-3)并测序验证。红鳍东方鲀IL-15RαcDNA全长包括：5′-UTR为139bp，ORF为603bp，3′-UTR为338bp，接着为73bp的Poly(A)尾。此外，多聚腺苷酸加尾信号AATAAA在Poly(A)尾上游27bp位置。红鳍东方鲀IL-15RαcDNA编码200aa的多肽，其中，包含24aa的预测信号肽，成熟肽长度为176aa，预测蛋白分子量为18.7kDa。
具体的，红鳍东方鲀白介素15受体基因IL-15Rα，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。红鳍东方鲀白介素15受体基因IL-15Rα的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，红鳍东方鲀白介素15受体基因IL-15Rα的cDNA序列如SEQ ID NO:3所示。
实施例2重组IL-15Rα逆转录病毒表达质粒的构建
1)为了引入Flag融合标签以及哺乳类信号肽，首先将编码红鳍东方鲀IL-15Rα成熟肽的cDNA亚克隆到pFlag-CMV-1载体中，构建了Flag融合标签的真核表达载体pFlag-15Rα。如图2-1，M1，DNA分子量标记(1057、770、612、495、392、345、297、210、162bp)；15R，IL-15Rα编码片断酶切产物，预计大小为521bp；M2，DNA分子量标记(4361、2322、1353、1078、872、603bp)；－和+分别代表未酶切和酶切后的pFlag-CMV-1产物。所用引物及其序列如下表1。
表1所用引物及其序列
(方向均为5′-3′)
2)扩增带有融合标签的完整ORF编码序列，定向克隆到pENTR/D-TOPO载体，如图2-2，M，同附图2-1中M1；1为预计625bp编码cDNA产物。
3)通过Gateway技术(invitrogen)将目的基因重组转座到逆转录病毒表达载体pMX-puro-GW中，成功构建了重组IL-15Rα逆转录病毒表达质粒pMX-FL-15Rα。经测序验证，该表达质粒含有预期的插入序列，编码一段203aa的多肽，信号肽长度为15aa，预测成熟肽长度为188aa，蛋白分子量大小为20.0kDa，其中，包括N端8aa长的Flag融合标签以及IL-15Rα的完整成熟肽；编码的膜蛋白胞外区保留了IL-15Rα的两个N糖基化位点和11个O糖基化位点。
实施例3稳定表达重组红鳍东方鲀IL-15Rα的稳定细胞系的建立
1)在进行包装和感染实验前3天，复苏病毒包装细胞PLAT-E(东京大学水产试验室保存)和感染靶细胞NRK-52E(正常大鼠肾脏细胞，东京大学水产试验室保存)。
2)接种后2～3天，将2～4×105PLAT-E细胞接种至6孔板中并调整体积至3mL每孔。培养基成分：10％FBS(GIBCO)、1％Penicilin-Streptomycin-Fungizone。
3)培养24小时后，进行转染：将3μg(约3μL)逆转录病毒载体(pMX-puro-GW)或重组载体(pMX-FL-15Rα)转染到PLAT-E细胞中，转染试剂为FuGENE6。
4)接种NRK-52E至6孔板中，每孔接种5～10×104NRK-52E细胞，使用无抗性培养基(DMEM+10％FBS)调整体积至1mL。
5)24小时后收集病毒颗粒并进行感染：首先收集步骤3)中的培养上清，离心收集含病毒颗粒上清；然后将2mL上清与20μL Polybrene(800μg/μL，Sigma，H9268-5G)混合，室温孵育15min；将混合液加入步骤4)中的培养孔中，轻柔晃动混匀；继续培养细胞。
6)24小时后，吸弃上清，加入新鲜的条件培养基(DMEM含10％FBS、1％PSF和5μg/mLPuromycin)进行抗性筛选；每隔2～3天更换一次培养基，直到阳性细胞株形成而且无细胞大规模死亡现象。当阳性克隆达到80％汇合度时，将其接种到10cm培养皿。
7)保存细胞株：首先吸弃10cm培养皿中的上清，加入2mL胰蛋白酶-EDTA消化细胞，消化时间为5min，立即加入5mL DMEM，吹打混匀重悬细胞；离心收集细胞，并以5mL DMEM重悬细胞，计数后再次离心；吸弃上清，弹松细胞团，以0.2～1×106/mL的密度加入适量的细胞保存液(cell banker，Wako)，各分装1mL于冻存管中并迅速置于-80℃冻存。
8)NRK-52E或者病毒感染NRK-52E细胞培养2～3天后，吸弃上清，每个10cm细胞培养皿中加入3mL D-PBS润洗，吸弃上清。
9)各加入2mL细胞解离液(cell dissociation buffer,GIBCO)，置于37℃继续培养5～10min；然后再各加入3mL D-PBS，用细胞刮剥离并收集所有细胞至15mL离心管中，1000rpm离心10min。
10)吸弃上清，弹松细胞团后加入适量(约3mL每10cm细胞培养皿)D-PBS，吹打重悬细胞。计数后，以MACS缓冲液(含2mM EDTA和0.5％BSA的D-PBS，配制后需过0.45μm滤膜除颗粒和菌，并抽真空去除气泡)调整细胞数至5×106/mL；同时，以MACS缓冲液稀释Anti-Flag抗体(1:250，Sigma，F-3165)。
11)按照1：1(各50μL)的比例向96孔培养板各孔加入细胞悬浮液和一抗(anti-Flag)稀释液，阴性对照孔只加入MACS缓冲液，置于4℃或冰上1h。
12)每孔加入100μLMACS缓冲液，1000rpm离心10min后，吸弃约150～180μL上清，再加入等量的MACS缓冲液，吹打重悬细胞，再次离心。
13)此时，以MACS缓冲液按1:100稀释FITC标记的羊抗鼠Ig(G+M)抗体(Jackson)；离心结束后，吸弃180μL上清并加入100μL上述二抗稀释液，吹打使细胞悬浮，于4℃或冰上避光放置30min。
14)用MACS缓冲液洗涤细胞两次；最后以200μL MACS缓冲液重悬细胞。
15)取少量细胞悬浮液滴加于载玻片并盖上盖玻片，在荧光显微镜(Nikon)下观察细胞。
16)取100μL细胞悬浮液加到预装了1mL D-PBS和2μL PI(propidium iodide，2mg/mL，SigmaP-4170)的玻璃检测管中，轻晃混匀，使用Partec PAS流式细胞仪(Partec GmBH，德国)检测阳性细胞信号。如图3-1，只有阳性细胞结合FITC荧光标记抗体后能被激发荧光并被检测出，激发荧光为绿色。流式细胞仪检测MX-NRK细胞和FL-15Rα-NRK荧光信号，如图3-2，X轴为绿色荧光信号强度，Y轴为细胞计数；RN1为阳性信号区。
本发明以逆转录病毒介导外源基因转移的真核表达系统。逆转录病毒载体是一种稳定高效的转基因介质，特别对于那些难以进行转染的细胞，如原代培养细胞。高滴度活性病毒颗粒的产生跟包装细胞有关。目前，哺乳类逆转录病毒主要的包装细胞来源于293、NIH-3T3或者COS-7。PLAT-E来源于鼠293细胞，携带gag、pol和env等病毒包装蛋白重组基因载体并通过EF1-α启动子作用；在puromycin和blasticidin抗性选择压力下，能在长达4个月内维持包装病毒的高感染力。重组红鳍东方鲀IL-15Rα逆转录病毒载体转染PLAT-E后，包装细胞能在短时间内(24h)产生病毒颗粒。当病毒感染宿主细胞后，能迅速将携带基因(包括抗性基因)整合到宿主基因组中并得到有效表达，因此，即使在高浓度选择压力下，细胞也不至于大量死亡。此外，整合红鳍东方鲀IL-15Rα基因的细胞株在传代10次以上，仍维持高抗性，并且荧光显微镜和流式细胞仪结果也表明重组IL-15Rα基因得到高效表达，说明本研究构建了一株表达重组IL-15Rα的稳定细胞系。
同源稳定细胞株的建立，为免疫大鼠制备单克隆抗体准备了极佳的抗原。在FL-15Rα-NRK稳定细胞系免疫大鼠后，机体会产生针对外源膜蛋白的特异性抗体。由于宿主细胞NRK-52E是大鼠正常肾脏细胞株，与免疫动物同源，所以绝大部分细胞膜表面分子均一致，减少机体产生非目的抗体，降低单克隆抗体假阳性率。
实施例4重组红鳍东方鲀IL-15Rα单克隆抗体的制备
1)以FL-15Rα-NRK细胞免疫大鼠，能促使大鼠在较短时间内(7～9天)产生足够效价的抗血清(稀释250倍后，流式细胞仪仍能检测到它与细胞的结合信号；)。如图4-1，流式细胞仪检测免疫血清效价，1、2和3分别为FL-15Rα-NRK与稀释250、50和10倍免疫大鼠血清孵育后结果；NC为FL-15Rα-NRK与10倍稀释免疫前大鼠血清孵育结果。X轴代表结合信号强度。
2)分离免疫大鼠的外周淋巴结细胞，并与骨髓瘤细胞进行融合后，经过HAT筛选，产生大约150株杂交瘤细胞。融合后第10天，取杂交瘤细胞培养上清，进行特异性抗体检测，其中有1株能识别正常NRK-52E细胞，2株能特异识别FL-15Rα-NRK，但只有1株2E6生长能力强；进行克隆化后，仍能产生高效抗体。如图4-2，流式细胞仪检测MX-NRK细胞和FL-15Rα-NRK与单克隆抗体2E6孵育后荧光信号，X轴为绿色荧光信号强度，Y轴为细胞计数；RN1为阳性信号区。
3)通过大鼠单克隆抗体亚类测定试纸测出2E6杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体为IgG2a。如图4-3，+为阳性对照，κ为轻链类型，2a为IgG2a。
4)杂交瘤细胞注射裸鼠诱发腹水，每只小鼠收集3次，共约10mL，收集腹水上清约8mL，稀释10倍后，流式细胞仪测定效价为10-3。如图4-4，1、2、3和分别为FL-15Rα-NRK与稀释1000、100、10和2倍的2E6单克隆抗体腹水孵育后结果；NC为不加2E6的FL-15Rα-NRK阴性对照。X轴代表结合信号强度。
实施例5红鳍东方鲀IL-15Rα重组蛋白的制备
1)细胞裂解液制备：吸弃细胞培养基，用预冷的PBS洗涤两次；然后用1mL预冷的非变性裂解液(如下表2)重悬，加入蛋白酶抑制剂(Pierce，78410)，置于冰上30min后转移至1.5mL离心管；4℃，16000×g离心15min，收集上清至新管；加入30μL 50％的蛋白G-琼脂糖凝胶颗粒(Pierce)，并于4℃孵育30min，吸弃非特异结合蛋白；4℃、16000×g离心5min，收集上清至新管；此时细胞裂解液可置于-80℃冻存备用或者立即使用。
2)制备抗体-琼脂糖凝胶颗粒：在1.5mL离心管中，分别加入30μL 50％的蛋白G-琼脂糖凝胶颗粒、0.5mL预冷的PBS和50μL阳性单克隆杂交瘤细胞的培养上清。阴性单克隆杂交瘤细胞的培养上清作为对照。将上述溶液置于旋转混匀器中，4℃过夜(或≥1h)以混合。4℃，16000×g离心2s，吸弃上清；加入1mL非变性裂解液，上下颠倒3～4次以混匀凝胶；再次离心2s，吸弃上清，以非变性裂解液重复洗涤3次。
表2非变性裂解液和洗涤液成分
3)分别在抗体-琼脂糖凝胶颗粒悬浮液中加入10μL 10％BSA，然后再分别加入细胞裂解液各0.4mL；其中BSA能降低混合液中蛋白与抗体-凝胶颗粒之间的非特异性结合。
4)将上述混合溶液置于旋转混匀器中，4℃上下颠倒，混合3h。
5)4℃，16000×g离心5s，吸弃上清；加入1mL预冷的洗涤缓冲液(见表2)，上下颠倒3～4次混匀凝胶；再次离心2s，吸弃上清，以洗涤缓冲液重复洗涤3次。
6)再以冰冷的PBS洗涤一次，然后离心吸弃所有上清，沉淀的凝胶颗粒含有目的蛋白(阳性管)。
7)每30μL蛋白-G琼脂糖凝胶加入25μL含0.1M 2-ME和0.1％SDS的变性液，90℃处理5min。
8)冷却后，分别加入50μL30mM PBS(pH＝7.2，含有2％Triton X-100和蛋白酶抑制剂)；16000×g离心5s，收集上清用于SDS-PAGE。红鳍东方鲀IL-15Rα蛋白Western杂交结果如图5，M为蛋白分子量标记(左侧示大小)，C1、C2为蛋白冻存样品。
实施例6红鳍东方鲀IL-2、IL-15、IL-15L的蛋白纯化及功能分析
1)以如下表3引物对扩增，分别得到红鳍东方鲀IL-2、IL-15和IL-15L成熟肽编码cDNA，PCR产物大小等于预计值。如图6-1，M，DNA分子量标记(最大1500bp，以下为1000～100bp，100bp递减)；1、2、3分别为IL-2、IL-15和IL-15L成熟肽cDNA；预计大小分布为420、381、375bp。基因克隆所需的引物如下表3：
表3基因克隆所用到的引物及其序列(方向均为5′-3′)
2)目的产物回收并进行双酶切后，分别连接到表达载体pPICZα-A中，经过PCR筛选并测序验证得到pPICZα-IL2、pPICZα-IL15和pPICZα-IL15L重组表达质粒，它们各自编码的重组蛋白均含α-factor信号肽、信号肽切割位点、目的蛋白成熟肽和6-His标签。重组表达载体构建所用到的引物如下表4：
表4重组表达载体构建所用到的引物及其序列(方向均为5′-3′)
3)值得注意的是，本实验通过在各反向引物中加入6-His标签编码序列和终止密码子，所构建载体表达的重组蛋白不再含有原载体上携带的c-myc蛋白融合标签。
4)将阳性重组质粒进行线性化酶切(SacI)，然后通过乙醇沉淀回收酶切产物，以MilliQ调整至1μg/μL。
5)接种毕赤酵母GS115(本实验室保存)单克隆至5mLYPD培养基中，30℃220rpm培养20～22h。按照1∶1000比例，稀释GS115培养液至100mL新鲜YPD培养基，继续培养约20h，至OD600约为1.3～1.5。4℃，1500×g离心5min，收集菌体；依次以冰冷的100mL和50mL无菌MilliQ、4mL 1M山梨醇洗涤菌体；最后重悬于200μL 1M山梨醇，置于冰上备用。
6)分别将10μg DNA与80μL细胞悬浮液混合，转移至2mm电转杯(Bio-Rad)，冰上孵育5min。以电击转化仪(Bio-Rad)将DNA转入酵母，转化条件：2.5kV，25μF，200Ω；电击结束后，立即加入1mL冰冷1M山梨醇，吸打混合后将所有液体转移到15mL离心管，置于30℃培养箱培养1～2h。分别将转化产物涂布于ZeocinTM(Invitrogen)梯度(500、1000、2000μg/mL)YPD培养板，置于30℃培养箱培养，直至阳性克隆生长(2～3天)。
7)一般情况下，外源基因以高拷贝数整合到酵母基因组中能产生较高的ZeocinTM抗性；分别在高抗性(2000μg/mL)平板上各挑取6个单克隆接种到一新板中继续培养。并挑取相应克隆至10μL H2O中，分别加入5μL5U/μL的裂解液(lyticase，Sigma)，37℃孵育20min；然后置于液氮中速冻1～3min；95℃加热3min后，直接以此作为PCR鉴定反应的模板。筛选结果如图6-2，M，DNA分子量标记(由小到大分别为100、250、500、750、1000和1500bp)；各组1～6为阳性重组子模板，7为阴性对照。使用各自特异的引物对进行PCR扩增，能从相应酵母重组子的克隆裂解液中得到目的条带，说明红鳍东方鲀IL-2、IL-15或IL-15L基因均成功整合到酵母基因组中。
8)将各组6个阳性克隆分别接种于5mL含100μg/mLZeocin抗生素的BMGY培养基，培养管置于30℃，230rpm培养约20h，直到达到对数生长期。分别转移2.5mL细胞培养液至另一新管，并做好标记，用于设置诱导组。常温下，3000×g离心5min，收集酵母细胞。弃上清，分别加入适量新鲜培养基，稀释至OD600＝1.0；其中对照组加入BMGY，而诱导组加入BMMY。每个50mL培养管内培养物≤15mL；每24h时，诱导组需补加适量100％甲醇，使得终浓度为0.5％。培养72h后，各收集1mL培养物，13000×g离心5min，分别收集上清和菌体，做好标记，冻存于-20℃备用。浓缩上清样品：每800μL上清样品中加入8μL2％DOC，振荡混匀，置于4℃或冰上孵育30min；加入150μL 100％TCA至最终浓度为15％，振荡混匀约30秒(注意：TCA具有腐蚀性，小心操作！)；将样品放置于4℃沉淀过夜(或≥1h)；15000×g离心10min，弃上清；沉淀中加入500μL丙酮，剧烈振荡，充分洗涤沉淀，室温静置5min；再以300μL丙酮洗涤一次；最终，倒弃丙酮，将样品管敞开管口，室温放置，让剩余的丙酮挥发干净，或者通过2000×g离心5min后干燥样品；加入30μL 0.1MNaOH重溶沉淀蛋白。
9)准备Ni-NTA His·Bind树脂(Novagen，70666-3)，2mL填充柱子(Pierce，89896)，5M NaCl，1M PBS pH＝8.0，1M Imidazole，并配制以下梯度溶液。
Buffer NaCl PBS Imidazole
1×Ni-NTA binding buffer 500mM 50mM 10mM
1×Ni-NTA Wash buffer A 500mM 50mM 20mM
1×Ni-NTA Wash buffer B 500mM 50mM 50mM
1×Ni-NTA Wash buffer C 500mM 50mM 100mM
1×Ni-NTA Wash buffer D 500mM 50mM 150mM
1×Ni-NTA Elution buffer 500mM 50mM 250mM
10)将填充柱子固定在铁架台支架上，拧断底部胶头；加入4mL灭菌水洗涤柱子；待水剩下1～1.5mL时，用胶塞封住柱子底部。混匀Ni-NTA His·Bind树脂，用切去嘴尖部分的吸头吸取1mL树脂悬液，加入上述柱子，等待树脂自由沉降。向样品溶液中加入适量盐溶液以及PMSF(丝氨酸蛋白酶抑制剂)，使得溶液包含：500mM NaCl，50mM PBS，10mM Imidazole和1mM PMSF；10000×g离心5min，如有沉淀，将上清转移到新管。柱床稳定后，打开胶塞，排出柱内液体；并依次用1mL灭菌水和3×1mL Binding buffer洗涤4次。将step8)中澄清上清加到柱子中，并分别收集过柱后第2mL，第3mL和最后1mL(记为S1、S2和S3)，4℃放置备用。依次用Wash buffer A，B洗涤柱子各4次，每次1mL；分别收集各洗出液(记为a1～4，b1～4)。分别用Wash buffer C，D以及ElutionBuffer洗涤柱子各4次，每次0.5mL；收集各洗脱液(依次记为c1～4、d1～4和e1～4)。用4mL灭菌水洗涤柱子，塞上胶塞，加入4mL灭菌水并拧上旋盖，将柱子放置于4℃保存。
11)按照最佳蛋白洗涤洗脱条件(以BMGY作为种子菌培养基，菌体密度OD600达到5时，重悬于二分之一体积的BMMY中开始诱导表达，诱导时间分别为：24h、24h和36h)，以Elution buffer洗脱目的蛋白，并以PBS(0.1M pH＝7.8)调整至2.5mL。以25mL PBS(0.1MpH＝7.8)平衡PD-10脱盐柱(Phamacia)后，将2.5mL样品加入柱床上方，丢弃流出液。加入3.5mLPBS，收集洗脱蛋白峰；柱子再次以30mL H2O洗涤，然后用25mLPBS平衡后放置于4℃保存以重复使用。
12)使用BCA(Pierce)试剂测定蛋白浓度(按说明书方法操作)后，分装并于-80℃冻存备用。然后进行SDS-PAGE分析蛋白表达情况，如图6-3，重组红鳍东方鲀IL-2、IL-15和IL-15L阳性菌株在甲醇培养基下，诱导表达的新增蛋白条带，均能被6-His抗体识别，说明红鳍东方鲀IL-2、IL-15和IL-15L重组质粒分别整合到酵母基因组中，能被甲醇诱导，正确表达含有6-His标签的融合蛋白。方框上方为各组蛋白，其中M为蛋白分子量标记，－和+分别为未加甲醇对照和甲醇诱导产物，W为转膜后进行Western杂交信号。图示Western杂交结果条带与相应SDS-PAGE条带(左侧)一致。
实施例7红鳍东方鲀IL-15Rα与配体结合能力分析
1)通过上述的方法获得重组IL-15Rα蛋白。
2)分别收集空载体pMX-puro-GW感染NRK-52E(MX-NRK)和携带重组IL-15Rα病毒感染NRK-52E细胞(15Rα-NRK)，以MACS缓冲液调整细胞数至5×106/mL。
3)向96孔U底培养板各孔加入50μL细胞悬浮液，然后分别加入50μL含重组红鳍东方鲀IL-2、IL-15、IL-15L蛋白的COS-7细胞转染上清，阴性对照孔只加入COS-7培养上清或者是空载体(pFlag-CMV-1)的转染上清，4℃或置于冰上1h。
4)每孔加入100μL MACS缓冲液，1000rpm离心10min，并以移液器吸弃约150～180μL上清，再加入等量的MACS缓冲液吹打重悬细胞，再次离心。
5)此时以MACS缓冲液按1:250稀释鼠抗Flag(Anti-Flag，Sigma)；离心结束后，吸弃180μL上清并加入100μL上述一抗稀释液，吹打使细胞悬浮，于4℃或冰上避光放置1h。
6)按步骤5)洗涤细胞后，加入以MACS缓冲液按1:100稀释的FITC标记的羊抗鼠Ig(G+M)抗体(Jackson)，吹打使细胞悬浮，于4℃或冰上避光放置30min。
7)用MACS缓冲液洗涤细胞两次；最后以200μL MACS缓冲液重悬细胞。
8)取100μL细胞悬浮液，加到预装了1mL D-PBS和2μL PI的玻璃检测管中，轻晃混匀，使用Partec PAS流式细胞仪检测信号。如图7，FL-IL-2能够和红鳍东方鲀IL-15Rα结合。虚线上方和下方分别为15Rα-NRK和MX-NRK与各COS-7细胞培养上清孵育后样品检测结果；其中medium、Mock、FL-IL-2、FL-IL-15和FL-IL-15L依次为无DNA、空载体pFlag-CMV-1、重组FL-IL-2、重组FL-IL-15和重组FL-IL-15L质粒的转染COS-7培养上清。Q1信号显示阳性活细胞，Q2为死细胞，因此容易产生非特异结合信号，Q3为阴性活细胞信号，Q4信号显示死细胞。其中FL-IL-2阳性结合组以方框标出。
实施例8重组红鳍东方鲀IL-2、IL-15和IL-15L蛋白的活性检测
1)健康黑青斑河鲀购于广州芳村花鸟鱼虫市场，在循环水水池中驯养1周以上。实验鱼以MS-222(100μg/mL)浸泡麻醉后，剪取头肾组织，于超静工作台内，小心去除其它结缔组织，剪成小块转移到另一含有培养液的平皿中；以玻片磨砂面研碎组织块，并用70μm滤网过滤。800×g离心10min，弃上清；弹击管底使细胞松散，以10mL完全培养基(10％FBS、1％PSF和2mM L-Glutamine的RPMI-1640)重悬，计数后调整到5×105/mL。分别在96孔板各孔中加入100μL细胞悬浮液，然后依次加入含0.001ng/μL、0.01ng/μL、0.1ng/μL、1ng/μL和10ng/μL等浓度的重组蛋白细胞培养液(实施例6中获得的IL-2,IL-15,IL-15L的重组蛋白纯化液)100μL，各组设置3孔平行。其中，设置背景组(只加200μL培养基)，阴性对照组(细胞悬浮液和培养基各100μL)以及染料空白校正组(只加200μL培养基，用于加染料)。细胞置于5％CO2、37℃温湿培养箱中培养24h。分别在各孔加入20μL Alamar blue(biosource)；继续培养6～8h，分别读取OD630和OD570读数，并计算各组细胞还原染料程度(各组平均值减去背景值分别得到A570和A630，校正值(R0)为染料空白组A570/A630；各组还原程度R％＝(A570-A630*R0)*100。数据表示为平均值±标准误差(n＝3)。
结果如图8中(A)图，不同浓度的重组红鳍东方鲀IL-2、IL-15和IL-15L蛋白，均能提高Alamar blue的还原程度，而且与各自蛋白浓度呈正相关，说明重组蛋白均能以剂量依存关系促使黑青斑河鲀头肾细胞活化。各个刺激组0.1～1000ng的浓度梯度代表每孔重组蛋白用量；Y轴为实验细胞在刺激条件下还原Alamar blue染料程度与空白对照的比值，反映了重组蛋白的活化能力，数据表示为平均值±标准误差(n＝3)。
2)2龄健康斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)购于广州黄沙水产品市场，体重约1kg。以冰速冷实验鱼后，切断颈椎骨致死，以手术刀切下两旁鳃盖内侧胸腺组织，浸泡于10mL RPMI-1640培养液中；然后按照step1)方法进行胸腺细胞活化实验。如图8中(B)图，不同浓度梯度的重组红鳍东方鲀IL-2、IL-15和IL-15L蛋白，均能提高斜带石斑鱼胸腺细胞还原Alamar blue的能力，并呈正相关关系，说明红鳍东方鲀重组蛋白同样能以剂量依存关系促使斜带石斑鱼胸腺细胞的活化。本研究获得的红鳍东方鲀IL-2、IL-15和IL-15L重组蛋白具有活化免疫细胞的生物学功能，有望运用于实际生产中，提高鱼体免疫力。
本发明不局限于上述特定的实施方案范围内，上述实施方案仅仅是为了能够对本发明的使用过程进行详细地说明，而且有相等功能的生产方法和技术细节也属于本发明内容的一部分。事实上，本领域技术人员根据前文的描述，就能够根据各自需要找到不同的调整方案，这些调整都应在本文所附的权利要求书的范围内。
序列表
<110> 中山大学
<120> 一种红鳍东方鲀白介素15受体基因IL-15Rα及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 603
<212> DNA
<213> 白细胞介素-15受体阿尔法(IL-15Rα)
<400> 1
atggatctgg gctcctcttt agcgccgctt ttcgtcctga tttattgggt tttcccgact 60
cctgcaacgt gccgcagcga taaaatatgt tgcccggaaa ttccacctgt gaatctgact 120
gaaacccctc cgcgggagtg cttcgtggtc agtgagaaat tccgctacca gtgtaaggcc 180
ggctacaagc ggaaggcggg gacctccaac ctcatcagat gtattcaaac cgcccacggg 240
gtcgaatggt cgcagctcaa cctcatttgt atatgtgtcc caccgggaag ctgcggagag 300
ccctccagcc ctcctccagc agccactgga agttccactt ctgtgcctga agcaacaacg 360
agcgcagcag tagcggccac gagcgacggg ggggcttcca cagagaccag cctgcacttg 420
gacctgtctg accaccatct caacagcaca cacattgtgt ctctctgttt tgcactggtt 480
tttgtctgtg cgctggccgg aatgatctcc ttttgcttta aaaggaggac atcaggtgtg 540
acgctgccgt taccagcaga acagattccc ataaacaatg atccacttga ggcggatcaa 600
taa 603
<210> 2
<211> 200
<212> PRT
<213> 白细胞介素-15受体阿尔法(IL-15Rα)
<400> 2
Met Asp Leu Gly Ser Ser Leu Ala Pro Leu Phe Val Leu Ile Tyr Trp
1 5 10 15
Val Phe Pro Thr Pro Ala Thr Cys Arg Ser Asp Lys Ile Cys Cys Pro
20 25 30
Glu Ile Pro Pro Val Asn Leu Thr Glu Thr Pro Pro Arg Glu Cys Phe
35 40 45
Val Val Ser Glu Lys Phe Arg Tyr Gln Cys Lys Ala Gly Tyr Lys Arg
50 55 60
Lys Ala Gly Thr Ser Asn Leu Ile Arg Cys Ile Gln Thr Ala His Gly
65 70 75 80
Val Glu Trp Ser Gln Leu Asn Leu Ile Cys Ile Cys Val Pro Pro Gly
85 90 95
Ser Cys Gly Glu Pro Ser Ser Pro Pro Pro Ala Ala Thr Gly Ser Ser
100 105 110
Thr Ser Val Pro Glu Ala Thr Thr Ser Ala Ala Val Ala Ala Thr Ser
115 120 125
Asp Gly Gly Ala Ser Thr Glu Thr Ser Leu His Leu Asp Leu Ser Asp
130 135 140
His His Leu Asn Ser Thr His Ile Val Ser Leu Cys Phe Ala Leu Val
145 150 155 160
Phe Val Cys Ala Leu Ala Gly Met Ile Ser Phe Cys Phe Lys Arg Arg
165 170 175
Thr Ser Gly Val Thr Leu Pro Leu Pro Ala Glu Gln Ile Pro Ile Asn
180 185 190
Asn Asp Pro Leu Glu Ala Asp Gln
195 200
<210> 3
<211> 1153
<212> DNA
<213> 白细胞介素-15受体阿尔法(IL-15Rα)
<400> 3
gattcctcgt cggcgctgac ggcgcgtcca cagtcatgca ccctgaatca gtcggaaagt 60
gaaagtagga gcagaagacg cacgtctcga aacgctttta ccgacgccga cctgttgtgc 120
ctccgcaggt agctgtcaga tggatctggg ctcctcttta gcgccgcttt tcgtcctgat 180
ttattgggtt ttcccgactc ctgcaacgtg ccgcagcgat aaaatatgtt gcccggaaat 240
tccacctgtg aatctgactg aaacccctcc gcgggagtgc ttcgtggtca gtgagaaatt 300
ccgctaccag tgtaaggccg gctacaagcg gaaggcgggg acctccaacc tcatcagatg 360
tattcaaacc gcccacgggg tcgaatggtc gcagctcaac ctcatttgta tatgtgtccc 420
accgggaagc tgcggagagc cctccagccc tcctccagca gccactggaa gttccacttc 480
tgtgcctgaa gcaacaacga gcgcagcagt agcggccacg agcgacgggg gggcttccac 540
agagaccagc ctgcacttgg acctgtctga ccaccatctc aacagcacac acattgtgtc 600
tctctgtttt gcactggttt ttgtctgtgc gctggccgga atgatctcct tttgctttaa 660
aaggaggaca tcaggtgtga cgctgccgtt accagcagaa cagattccca taaacaatga 720
tccacttgag gcggatcaat aatttccttc gcttgtgcct ttaattaaag agcgttattg 780
cacagagaag ctcttggaac tgttgacgcg tcgtaaggag gaccatctgg acagatgttt 840
gtttctgcca ggacaaatgt tatgtggacg ttagtgttgg gcagctgtca aactcccgtc 900
ctggctggga tgaacagtta gcgggagggt aaatatttac tgaagaaggt gaggaggaat 960
ctgcgtttgt cacacccaca ttcagacctc ttgttgtttc ggagcgtgcc agaagttctc 1020
cagctgtttt atctgaacct ggcaaagact ttggaataaa aggggctttt cccacagcct 1080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140
aaaaaaaaaa aaa 1153

Claims (9)

1.一种红鳍东方鲀白介素15受体基因IL-15Rα，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述红鳍东方鲀白介素15受体基因IL-15Rα的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种重组表达质粒，其特征是包括权利要求1所述红鳍东方鲀白介素15受体基因IL-15Rα。
4.一种重组表达菌株，其特征是包括权利要求1所述红鳍东方鲀白介素15受体基因IL-15Rα。
5.权利要求3所述的重组表达质粒的制备方法，其特征是：将权利要求1所述受体基因IL-15Rα成熟肽编码cDNA克隆至pFlag-CMV-1载体，构建融合前胰岛素原信号肽和Flag标签的编码序列，将所述编码序列通过pENTR/D-TOPO载体重组交换至目的载体pMX-puro-GW中，构建成含有重组IL-15Rα的逆转录病毒表达质粒pMX-FL-15Rα。
6.权利要求4所述的重组表达菌株的制备方法，其特征是：将权利要求1所述受体基因IL-15Rα成熟肽编码cDNA克隆至pFlag-CMV-1载体，构建融合前胰岛素原信号肽和Flag标签的编码序列，将所述编码序列通过pENTR/D-TOPO载体重组交换至目的载体pMX-puro-GW中，构建成含有重组IL-15Rα的逆转录病毒表达质粒pMX-FL-15Rα，再经感染靶细胞NRK-52E得到重组表达菌株FL-15RA-NRK。
7.一种单克隆抗体的制备方法，其特征是：采用权利要求4所述重组表达菌株免疫大鼠，分离免疫大鼠的外周淋巴结细胞，并与骨髓瘤细胞进行融合后，经过HAT筛选，收集杂交瘤细胞，腹腔接种至裸鼠，诱发腹水，收集腹水，腹水离心，取上清液并进行灭活处理，稀释后用滤膜过滤，获得单克隆抗体。
8.一种IL-15Rα重组蛋白，其特征是通过以下方法制备获得：采用权利要求4所述重组表达菌株免疫大鼠，分离免疫大鼠的外周淋巴结细胞，并与骨髓瘤细胞进行融合后，经过HAT筛选，收集杂交瘤细胞，制备细胞裂解液，将细胞裂解液加入抗体-琼脂糖凝胶颗粒悬浮液中；洗涤去上清，变性液洗脱目的蛋白，即获得IL-15Rα重组蛋白。
9.权利要求1所述红鳍东方鲀白介素15受体基因IL-15Rα、权利要求2所述编码蛋白以及权利要求8所述重组蛋白在识别IL-2并激活其介导的细胞因子受体系统信号通路、活化免疫细胞和提高鱼体免疫力方面的应用。
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