CN103667305A - 重组红鳍东方鲀干扰素γ蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种操作简便、成本低廉、重组蛋白纯度好、得率高、适应于工业化生产的重组红鳍东方鲀干扰素γ蛋白的制备方法，按照如下步骤进行：提取新鲜红鳍东方鲀肾脏总RNA并反转录进行第一链的cDNA的合成；以上述第一链的cDNA为模版进行RT-PCR扩增，上游引物NcoⅠ：5’-CATGCCATGGGCTCCTACATCCCAGTAGAAATG-3’；下游引物XhoⅠ：5’-CCGCTCGAGATGACCTCGAATCGACATCT-3’；建立克隆载体、表达载体、转化入表达菌内，培养菌株得到菌种；将所收集的菌种进行扩大培养，经IPTG诱导后收集菌体；将菌体破碎、裂解、纯化，收集纯化液。
Description
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种操作简便、成本低廉、重组蛋白纯度好、得率高、适应于工业化生产的重组红鳍东方鲀干扰素γ蛋白的制备方法。
背景技术
红鳍东方鲀（Fugu rubripes）在我国主要分布于黄海、渤海和东海，是近海底层肉食性鱼类，其肉味鲜美，具有很高的食用价值，在红鳍东方鲀的生殖腺和肝脏等内脏中产生河豚毒素，其高活性和高特异性的生物特征具有潜在的医药开发价值，在临床上具有广阔的前景。干扰素(interferon，IFN)是一类在机体受到病毒感染，或受核酸、细菌内毒素、促细胞分裂素等诱导时，由受体细胞分泌的、具有广谱抗病毒活性的蛋白质（主要是糖蛋白）。研究表明IFN通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，抑制病毒在宿主细胞中的复制。另外IFN还可增强自然杀伤细胞（NK细胞），巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，增强抗病毒能力，对细胞生长和细胞分化也有很重要的调节活性。然而，从红鳍东方鲀中直接提取该蛋白的操作复杂、成本高、产量少，不能大规模产业化生产。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作简便、成本低廉、重组蛋白纯度好、得率高、适应于工业化生产的重组红鳍东方鲀干扰素γ蛋白的制备方法。
本发明的技术解决方案是：一种重组红鳍东方鲀干扰素γ蛋白的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：
a. 提取新鲜红鳍东方鲀肾脏总RNA并反转录进行第一链的cDNA的合成；
b．以上述第一链的cDNA为模版进行RT-PCR扩增，扩增所用引物如下：
上游引物NcoⅠ：5’- CATGCCATGGGCTCCTACATCCCAGTAGAAATG-3’
下游引物XhoⅠ：5’-CCGCTCGAGATGACCTCGAATCGACATCT-3’
c．电泳回收RT-PCR产物与克隆载体pMD19T连接并转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α，在含氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，通过蓝白斑筛选阳性克隆，选择501大小的条带进行回收；
d．用限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ分别双酶切c步骤所回收产物的质粒和表达载体pET-32a(+)，将得到的两种目的基因片断用DNA连接酶连接，转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α进行培养并筛选提取重组表达质粒；
e．将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）内，培养菌株得到菌种；
f. 将所收集的菌种进行扩大培养，经IPTG诱导后收集菌体；
g. 将菌体破碎、裂解、纯化，收集纯化液。
所述RT-PCR反应条件为：94℃预变性5分钟后进行94℃变性30秒、58℃复性30秒、72℃延伸30秒的30个循环的扩增，72℃延伸7分钟后保存于4℃。
所述e步骤是将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）后，挑取单菌落接种于含有氨苄青霉素的5ml LB液体培养基过夜培养，而得到菌种。
所述f步骤是将所收集的菌种按1：100的比例接种于Amp LB液体培养基，37℃200转/分摇菌2.5小时，至OD600为0.4，所摇菌液加诱导剂IPTG至终浓度为0.5mM，37℃摇菌6小时，收集菌体。
所述g步骤是用磷酸盐缓冲液重悬f步骤所得菌体，用超声波破碎细菌并将细菌裂解液12000转，4℃离心20分钟，得上情并将上清上样于层析柱，用平衡液洗涤后加入300mM的咪唑洗脱，收集洗脱液。
本发明设计了针对干扰素γ蛋白编码序列的引物，以TRIzol Reagent提取新鲜红鳍东方鲀肾脏总RNA后进行RT-PCR扩增，RT-PCR产物与pMD19T载体连接得重组质粒，经双酶切后目的基因再与表达载体pET-32a (+)连接，获重组表达质粒并转化至大肠杆菌BL21（DE3）中；通过IPTG诱导实现了重组蛋白的可溶性表达。该表达质粒表达的融合蛋白带有组氨酸标签，将细胞破碎后取上清纯化，避免了样品的变性和复性，不但操作简单，降低了制作成本，更主要的是蛋白结构不受破坏；重组蛋白纯度好、得率高且不易降解，适应于工业化生产，为进一步研究红鳍东方鲀干扰素γ蛋白的功能奠定基础。
附图说明
图1 本发明实施例红鳍东方鲀肾脏总RNA的琼脂糖凝胶电泳分析图。
图2 本发明实施例红鳍东方鲀干扰素γ蛋白目的基因的琼脂糖凝胶电泳分析图。
图3 本发明实施例重组表达质粒的双酶切电泳鉴定图。
图4 本发明实施例纯化柱洗脱组分的SDS-PAGE分析图。
图5本发明实施例重组表达质粒表达产物的SDS-PAGE分析图。
图6本发明实施例重组表达质粒诱导表达的蛋白印迹分析图。
具体实施方式
实施例：
a. 以TRIzol Reagent提取新鲜红鳍东方鲀肾脏总RNA并反转录进行第一链的cDNA的合成。红鳍东方鲀总RNA的琼脂糖凝胶电泳分析图如图1所示，图中1：Maker DL2000； 2、3：红鳍东方鲀总RNA电泳条带；
b. 以上述第一链cDNA进行PCR扩增，用PCR技术获得目的基因。
引物对的核苷酸序列为：
上游引物：5’-CATGCCATGGGCTCCTACATCCCAGTAGAAATG-3’
下游引物：5’-CCGCTCGAGATGACCTCGAATCGACATCT-3’
RT-PCR反应条件为：94℃预变性5分钟后进行94℃变性30秒，58℃复性30秒、72℃延伸30秒的30个循环的扩增，72℃延伸7分钟后保存于4℃，引物对由上海生物工程有限公司合成，划线部分分别为NcoⅠ酶切位点和XhoI 酶切位点。目的基因的琼脂糖凝胶电泳分析图如图2所示，图中1：Maker DL2000；2-4：红鳍东方鲀干扰素γ基因的RT-PCR产物；
c. PCR电泳回收产物与克隆载体pMD19T连接并转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α，在含氨苄青霉素的LB固体培养基上培养通过蓝白斑法筛选阳性克隆，选择501bp大小的条带进行回收；
d. 用限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ分别双酶切c步骤所提取的质粒和表达载体pET-32a(+)，37℃作用2小时后，酶切产物用DNA胶回收试剂盒回收，pMD19T-IFNγ质粒酶切产物和载体酶切产物按1：10的摩尔比混合，T4 DNA连接酶（Takara公司）16℃过夜连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α于37℃过夜培养。提取重组表达质粒pET32a- IFNγ；用NcoⅠ和XhoⅠ对重组表达质粒双酶切鉴定，鉴定结果如图3所示：图中1：Maker DL2000；2：pET32a-IFNγ质粒；2：pET32a-IFNγ质粒经NcoⅠ和 XhoⅠ双酶切产物。测序结果表明，所测序列与GeneBank中红鳍东方鲀干扰素γ编码序列一致，故初步确认所提取的重组表达质粒为红鳍东方鲀干扰素γ的编码序列；
e. 将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）内，培养菌株得菌液，挑取单菌落接种5ml Amp LB液体培养基过夜培养，即得到菌种；
f. 将所收集的菌种按1：100的比例接种于Amp LB液体培养基，37℃200转/分摇菌2.5小时，至OD600为0.4，所摇菌液加诱导剂IPTG至终浓度为0.5mM，37℃摇菌6小时，收集菌体；
g．用ProteinIsoTM Ni-NTA Resin纯化融合蛋白，具体操作步骤是用PBS重悬f步骤所得菌体，用超声波破碎细菌并将细菌裂解液12000转，4℃离心20分钟。将上清上样于层析柱，用平衡液洗涤后加入300mM的咪唑洗脱，收集洗脱液。
SDS-PAGE分析各收集液，其结果如图4所示：图中1：蛋白Marker；2-5：纯化蛋白部分。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册（New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
重组红鳍东方鲀干扰素γ（IFNγ）的鉴定：
1. SDS-PAGE电泳
配制12%的分离胶和5%的浓缩胶。将诱导前的样品和诱导后的样品各取20ml分别加入20ml 2×SDS loading buffer混匀，沸水煮10分钟，12000转/分离心10分钟，留取上清做SDS-PAGE。160 V恒压电泳1 h、考马斯亮蓝R250染色2小时、脱色液脱色。
观察，在37.835kDa处有明显条带出现，如图5所示，图中1-4 ：pET32a-IFNγ诱导后表达蛋白；5：pET32a诱导后表达产物；6：蛋白Marker。
2. Western Blot鉴定
当SDS-PAGE电泳即将结束时，从SDS-PAGE胶上切下需要转膜的部分，切6张滤纸和1张硝酸纤维素膜（NC）。把硝酸纤维素膜浸没于去离子水的水面中，滤纸浸没于转移缓冲液中，平衡5分钟。按纸、膜、胶、纸的顺序从阳极到阴极摆放正确，连接电源，注意正负极。100mA接通电流，电转移1.5h。转移结束后，切断电源，从上至下拆卸装置，逐一拆去各层。在NC膜上标记正反面。将NC膜用PBS漂洗3次，每次5分钟，换封闭液漂洗30分钟。PBS漂洗2次后用TBST Buffer漂洗15分钟。然后加Anti-His Antibody（Anti-His Antibody为1：1000稀释），孵育1小时。用PBS漂洗2次，每次10分钟。用1：2000稀释的HRP标记的羊抗鼠酶标二抗孵育30分钟。取出NC膜，用PBS漂洗3次，每次15分钟。将NC膜放在显色液中避光显色（一般1-5min）。观察结果如图6所示，图中1：蛋白Marker；2：诱导后的pET32a-IFNγ，和预期大小一致； 3：对照组（未诱导的pET32a-IFNγ）。
序列表
<110> 大连海洋大学
<120> 重组红鳍东方鲀干扰素γ蛋白的制备方法
<160> 2
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
CATGCCATGGGCTCCTACATCCCAGTAGAAATG 33
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
CCGCTCGAGATGACCTCGAATCGACATCT 29
Claims (5)
1.一种重组红鳍东方鲀干扰素γ蛋白的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：
a. 提取新鲜红鳍东方鲀肾脏总RNA并反转录进行第一链的cDNA的合成；
b．以上述第一链的cDNA为模版进行RT-PCR扩增，扩增所用引物如下：
上游引物NcoⅠ：5’- CATGCCATGGGCTCCTACATCCCAGTAGAAATG-3’
下游引物XhoⅠ：5’-CCGCTCGAGATGACCTCGAATCGACATCT-3’
c．电泳回收RT-PCR产物与克隆载体pMD19T连接并转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α，在含氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，通过蓝白斑筛选阳性克隆，选择501大小的条带进行回收；
d．用限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ分别双酶切c步骤所回收产物的质粒和表达载体pET-32a(+)，将得到的两种目的基因片断用DNA连接酶连接，转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α进行培养并筛选提取重组表达质粒；
e．将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）内，培养菌株得到菌种；
f. 将所收集的菌种进行扩大培养，经IPTG诱导后收集菌体；
g. 将菌体破碎、裂解、纯化，收集纯化液。
2.根据权利要求1所述重组红鳍东方鲀干扰素γ蛋白的制备方法，其特征在于：所述RT-PCR反应条件为：94℃预变性5分钟后进行94℃变性30秒、58℃复性30秒、72℃延伸30秒的30个循环的扩增，72℃延伸7分钟后保存于4℃。
3. 根据权利要求2所述的重组红鳍东方鲀干扰素γ蛋白的制备方法，其特征在于：所述e步骤是将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）后，挑取单菌落接种于含有氨苄青霉素的5ml LB液体培养基过夜培养，而得到菌种。
4.根据权利要求3所述的重组红鳍东方鲀干扰素γ蛋白的制备方法，其特征在于：所述f步骤是将所收集的菌种按1：100的比例接种于Amp LB液体培养基，37℃200转/分摇菌2.5小时，至OD600为0.4，所摇菌液加诱导剂IPTG至终浓度为0.5mM，37℃摇菌6小时，收集菌体。
5.根据权利要求4所述的重组红鳍东方鲀干扰素γ蛋白的制备方法，其特征在于：所述g步骤是用磷酸盐缓冲液重悬f步骤所得菌体，用超声波破碎细菌并将细菌裂解液12000转，4℃离心20分钟，得上情并将上清上样于层析柱，用平衡液洗涤后加入300mM的咪唑洗脱，收集洗脱液。
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