CN103993030A

CN103993030A - 一种大肠杆菌细胞内蛋白酶剪切融合蛋白的方法

Info

Publication number: CN103993030A
Application number: CN201410232934.8A
Authority: CN
Inventors: 尚广东; 李玲; 骆希; 张青; 杨瑶
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2014-05-28
Filing date: 2014-05-28
Publication date: 2014-08-20

Abstract

本发明涉及一种大肠杆菌细胞内蛋白酶剪切融合蛋白以分离目的蛋白的方法。所使用的宿主菌为通过重组工程方法将强启动子T7驱动的TEV蛋白酶基因整合至大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)而获得。表达载体为将麦芽糖结合蛋白和填充片段克隆至表达载体pET30(+)而获得。将不含终止子目的基因取代填充片段而获得目的基因融合表达载体，融合蛋白的末端含载体的6个组氨酸。表达载体转化至宿主菌后，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导之下，同时表达融合蛋白和基于染色体的TEV蛋白酶，TEV作用于麦芽糖结合蛋白和目的蛋白之间的酶切位点而将目的蛋白分离。此细胞内剪切方法省略了融合蛋白分离和TEV酶切等步骤。

Description

一种大肠杆菌细胞内蛋白酶剪切融合蛋白的方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种大肠杆菌细胞内蛋白酶剪切融合蛋白的方法。

背景技术

异源基因在大肠杆菌内的高表达来获得大量的蛋白是获得蛋白质药物、基因功能研究以及蛋白质研究的一种最常见的形式。由于生物体种属间的差异，许多异源蛋白在大肠杆菌内表达时以不可溶的形式存在。不可溶蛋白存在于包涵体中，需要以强离子变性剂处理才能释放蛋白用于纯化，蛋白纯化后再以还原剂进行复性。变性和复性的过程因为需要强氧化剂和还原剂，极易造成蛋白活性的减少或丧失，这将直接导致蛋白药物治疗效果的减弱以及蛋白功能研究的不准确。

将目的蛋白和融合标签的进行融合表达是提高蛋白可溶性、增加蛋白表达量，并且有利于分离纯化的有效方法之一。融合蛋白在纯化后，通过蛋白酶的酶切而使目的蛋白和融合标签相分离而释放目的蛋白，即包含蛋白纯化和酶切为两个步骤，实验操作难度较大，目的蛋白的收率常常较低；而且由于是对纯化的蛋白进行酶切，蛋白也很容易失去活性。此外，高专一性的蛋白酶(如TEV和PreScission)非常昂贵，大量使用必将造成很大的经济负担，难以在大规模蛋白药物的生产方面进行使用。

因此减少操作步骤，减少或不在体外进行蛋白酶的酶切是提高蛋白收率和增加蛋白活性的重要研究内容。

发明内容

为简化分离纯化目的蛋白的操作步骤，本发明提供了一种细胞内剪切融合蛋白以分离得到目的蛋白的方法。运用该方法，可使得融合蛋白在细胞内表达的同时，以基于染色体的基因所表达的TEV蛋白酶进行酶切而与融合标签分离，所分离的目的蛋白可通过亲和层析等步骤分离纯化目的蛋白。

本发明所涉及的一种大肠杆菌细胞内蛋白酶剪切融合蛋白以分离目的蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)将融合标签蛋白和填充片段克隆至表达载体，将不含终止子的目的基因取代填充片段而获得融合表达载体；

(2)融合表达载体转化至细胞内剪切宿主菌后，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导之下，同时表达融合蛋白和基于宿主菌染色体的TEV，TEV作用于融合标签蛋白和目的蛋白之间的TEV酶切位点而将目的蛋白分离。

所述细胞内剪切宿主菌为通过重组工程方法将强启动子T7驱动的TEV蛋白酶基因整合至大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)而获得。

具体地，本表达体系所使用的大肠杆菌表达菌株(细胞内剪切宿主菌)，是大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No.8850。

CGMCC No8850.是由如下方法获得：将TEV蛋白酶基因置于强启动子T7之下，与庆大霉素抗性基因(aacC1)相连后，两侧再克隆有大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)malE基因上下游各500bp同源片段，质粒为R6K的复制子。将包含T7-TEV、aacC1和两侧同源片段的DNA片段电转化至表达重组酶的BL21(DE3)，重组酶催化同源片段之间的同源重组，在庆大霉素抗性筛选之下获得T7-TEV整合至BL21(DE3)的基因工程菌株。

所使用的蛋白表达载体为将麦芽糖结合蛋白基因(MBP)和填充片段克隆至表达载体pET30(+)而获得。MBP为最常用的融合标签，而原理上其他融合标签也可以同样使用。

而填充片段引入为克隆方便，5'端的NcoI和BamHI酶切位点、3'端的HindIII、NotI和XhoI酶切位点用于异源基因的克隆。目的基因取代填充片段而克隆至表达载体。目的基因的克隆方式是其开放阅读框的3'端不含有密码终止子，因此，MBP和异源基因与载体上的6个组氨酸和终止子密码融合，即使用载体上的终止子密码。融合蛋白表达后3'带用6个组氨酸可用于亲和层析分离纯化。

本发明是运用重组工程方法将目的基因敲入至大肠杆菌的染色体。重组工程是利用组重组酶催化的DNA片段之间的同源重组而进行克隆和修饰的一种基因工程手段。最常用的重组酶基因来源于lambda噬菌体的exo，bet和gam基因。这三个基因的功能如下：exo(redα)编码DNA5'→3'外切酶，其作用于双链DNA分子而得到3'端突出的单链DNA分子；bet(redβ)编码DNA单链结合蛋白，其结合在突出的DNA分子上，Bet兼有重组酶活性，即可催化同源片段之间发生同源重组；gam(redγ)编码Gam蛋白，Gam抑制内源性DNA核酸酶的活性，可保护外源双链DNA片段免受降解。重组酶催化的效率高，操作简便，已成为基因操作的重要手段。

获得大量的、保持最大活性的蛋白是蛋白质药物以及基因和蛋白功能研究的必备手段。融合蛋白表达后的目的蛋白分离纯化也是获得目的蛋白的重要途径。本发明将最为常见TEV蛋白酶基因整合至BL21(DE3)的基因组上，通过诱导产生TEV蛋白酶。融合蛋白表达后，在细胞内，TEV酶切融合蛋白获得分离的目的蛋白，后者可进一步地进行分离和纯化。可通过调节IPTG浓度和诱导时间等参数使得细胞内酶切的效率最优化。细胞内酶切不会影响蛋白的活性，所切割的蛋白可方便地用于分纯化，这就最大限度地保留了蛋白的活性，省略了昂贵的蛋白酶的使用。本方法简便快捷，减少了在体外酶切蛋白的步骤，利于目的蛋白的分离纯化。使得操作时间和纯化效率均得以提高，将有着很好的应用前景。

附图说明

图1为以重组工程法获得基因工程菌株LS2416及其基因型验证的示意图。

pTKRed所表达的重组酶催化DNA底物中与基因组上同源片段(H1和H2)之间的同源重组而将含T7强启动子的TEV蛋白酶基因和庆大霉素抗性基因(aacC1)整合至大肠杆BL21(DE3)的基因组获得LS2416。R1059，R1083，R1084和R1060为基因型验证的引物。

图2为LS2416基因型验证的凝胶电泳结果。

[1]北京天根公司DNA分子量标准Trans2K PlusII：8.0,5.0,3.0,2.0,1.0,0.75,0.5,0.25,0.1kb；

[2]以BL21(DE3)为模板，R1059-R1060PCR扩增得到2454bp；

[3]以LS2416为模板，R1059-R1083PCR扩增得到1135bp；

[4]以LS2416为模板，R1084-R1060PCR扩增得到645bp；

[5]以LS2416为模板，R1059-R1060PCR扩增得到2985bp。

图3为细胞内剪切融合蛋白的示意图。

表达质粒转化至基因工程菌株LS2416后，IPTG同时诱导质粒上外源基因和LS2416染色体上TEV的表达。基因表达得到MBP(麦芽糖结合蛋白)和目的蛋白(Protein)二者的融合蛋白(MBP-S-Protein)，TEV作用于MBP和目的蛋白之间的识别位点(S)，发生细胞内剪切而分离MBP和目的蛋白。

图4是融合蛋白表达以及细胞内剪切的SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)图谱。其中：

1.蛋白质分子量标准，大小在图的左侧显示；

2.E.coli LS2416诱导表达的总蛋白；

3.E.coli LS2416诱导表达的可溶性蛋白；

4.E.coli BL21(DE3)/pLS2347诱导表达MBP-GFP的总蛋白；

5.E.coli BL21(DE3)/pLS2347诱导表达MBP-GFP的可溶性蛋白；

6.E.coli LS2416/pLS2347诱导表达MBP-GFP并细胞内剪切的总蛋白；

7.E.coli LS2416/pLS2347诱导表达MBP-GFP并细胞内剪切的可溶性蛋白；

8.E.coli BL21(DE3)/pLS2349诱导表达MBP-shRnBP的总蛋白；

9.E.coli BL21(DE3)/pLS2349诱导表达MBP-shRnBP的可溶性蛋白；

10.E.coli LS2416/pLS2349诱导表达MBP-shRnBP并细胞内剪切的总蛋白；

11.E.coli LS2416/pLS2349诱导表达MBP-shRnBP并细胞内剪切的可溶性蛋白；

图中融合蛋白，细胞内TEV剪切后所分离的蛋白均以箭头表示。

本发明中所涉及的基因工程菌株LS2416，于2014年2月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏编号为CGMCC No.8850。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例中所用到的菌株和质粒，均为已公开的菌株和质粒：

1.Escherichia coli DH10B。基因型F^-mcrA△(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80△lacZ△M15△lacX74deoR recA1araD139△(ara,leu)7697galU galK rpsL endA1nupG。文献：LifeTechnologies,Inc.Focus,1990,12:19。购自美国Invitrogen公司。

2.Escherichia coli BW25141。含Pir基因的大肠杆菌菌株，为含R6K复制子的质粒的宿主菌。文献：Datsenko KA,Wanner BL.One-step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proc Natl Acad Sci U S A.2000,97(12):6640-5。来自美国Purdue大学Barry Wanner教授。

3.Escherichia coli BL21(DE3)。基因型E.coli B F^–dcm ompT hsdS(r_B ^–m_B ^–)galλ(DE3)。购自美国Invitrogen公司。

4.pBAD322G。文献：Cronan JE.A family of arabinose-inducible Escherichia coli expressionvectors having pBR322copy control.Plasmid.2006,55(2):152-7。来自美国Illinois大学Urbana-Champaign分校John Cronan教授。

5.pBluescript II KS(-)。文献：Alting-Mees MA,Short JM.pBluescript II:gene mapping vectors.Nucleic Acids Res.1989,17(22):9494.购自美国Novagen公司。

6.pTKRed。文献：Kuhlman TE,Cox EC.Site-specific chromosomal integration of large syntheticconstructs.Nucleic Acids Research,2010,38(6),e92。来自美国Princeton大学ThomasKuhlman教授。

7.pJOE4905.1。文献：Motejadded H,Josef Altenbuchner J.Construction of a dual-tag system forgene expression,protein affinity purification and fusion protein processing.Biotechnol Lett.2009,31(4):543–549。来自德国University of Stuttgart的Josef Altenbuchner教授。

8.pLS912、phRnBP和pLS966。文献：张飞飞，王瑞青，朱宇鹏，马超，尚广东.大肠杆菌系列融合表达载体的构建，南京师大学报(自然科学版)，2013，36(3):97-102.

9.pLS2429和pR6KMCS。来源：尚广东，李玲，严振亚，石牡丹《一种大肠杆菌表达菌株及用其生产N-乙酰-D-神经氨酸的方法》，专利申请号：201310222109.5，公开号：CN103305450A。

10.pET30a(+)。基因表达载体，购自美国Novagen公司。

实施例1.TEV蛋白酶基因整合至BL21(DE3)染色体的细胞内剪切菌株的构建

首先构建含抗性基因和用于同源重组的同源片段的载体。设计引物R1077：5'-GTTAACGAGCTCGAATTGGCCGCGGCGTTG-3'，(SEQ ID NO.1)，酶切位点HpaI和SacI以下划线表示；R1078：5'-GAGCTCGAATTGACATAAGCCTG-3'，(SEQ ID NO.2)，SacI以下划线表示。以pBAD322为模板，PCR扩增得到0.8kb的庆大霉素基因片段。0.8kb钝端克隆至pLS2429的SnaBI位点，获得重组克隆pLS2459。pLS2459以KpnI-SaII酶切后，1.8kb片段克隆pR6KMCS的KpnI-SaII位点，获得重组克隆pLS2460。pLS2460使用R6K复制子，故宿主菌为BW25141。BL21(DE3)不含有R6K复制所需的Pir基因，故环状的载体残留无转化背景干扰。

TEV基因由上海生工公司合成，克隆至pBluescirpt II(KS+)，命名为pLS966。pLS966中TEV基因的5'端带有TEV酶切位点和7个HiaTag标签，3'端带有5个精氨酸位点，为将它们去除，设计引物R1079：5'-GGACCATGGGGAGAAAGCTTGTTTAAGG-3'，(SEQ ID NO.3)，R1080：5'-GGACTCGAGTTAATTCATGAGTTGAGTCGCTTCC-3'，(SEQ ID NO.4)，引物中的酶切位点NcoI和XhoI均以下划线表示。以pLS966为模板，PRC扩增0.7kb的TEV基因，NdeI和XhoI酶切后，克隆至pET30a(+)的相同位点，获得pLS2461。

为将TEV基因克隆至用于同源重组的两侧同源片段之间，设计引物R1081：5'-GGAGTTAACCCATACCCACGCCGAAACAAG-3'，(SEQ ID NO.5)，R1082：5'-GGAGTTAACTTAATTCATGAGTTGAGTCGCTTCC-3'，(SEQ ID NO.6)，两个引物中的酶切位点HpaI位点以下划线表示。以pLS2461为模板，PCR扩增1.0kb含T7启动子区域的TEV基因，钝端至pMD19-T Simple载体(大连宝生物公司)，获得重组克隆pLS2462。pLS2462以HpaI酶切回收的1.0kb片段克隆至pLS2460的HpaI位点，获得最终用于基因敲入的克隆pLS2464。pLS2464为两端为BL21(DE3)上的malE两侧各0.5kb，中间为T7启动子驱动的TEV基因和用于筛选的庆大霉素抗性基因。为避免庆大霉素在T7启动子诱导下的高表达，庆大霉素抗性基因的读码框方向与TEV基因的读码框方向相反。

将含有pTKRed的BL21(DE3)菌株单菌落接至3ml含100μg/ml大观霉素的LB液体培养中，30℃，220rpm，震荡培养过夜。2ml转接至100ml同样培养基，30℃，振荡培养至OD600约0.2时，加入2mM IPTG诱导重组酶的表达。培养至OD600约0.4时,将菌液倒入预冷的离心管，冰浴10分钟，4℃，7000rpm离心5分钟，弃上清。以冰冷的10％甘油洗涤菌体沉淀3次，以200μl冰冷的10％甘油悬浮，50μl分装。pLS2464以KpnI-SaII酶切,分离2.8kb的DNA片段，溶解于ddH₂O，1μg加至电转化感受态细胞中，轻弹混匀。转移至冰上预冷的1mm电转杯中，以1.8kV，200Ω的条件进行电击转化。电转化仪为美国Bio-Rad公司的Gene Pulser II^R。1mL SOC培养基悬浮，37℃振荡培养培养2h后，涂布至含25μg/ml的庆大霉素的LB平板筛选重组菌株。

设计引物，R1059：5'-GAGCGCCAGTTGCCACTCATC-3'，(SEQ ID NO.7)，R1060：5'-ACGCGTTGGTTAATCACCTC-3'，(SEQ ID NO.8)，R1083：5'-ACACCATGTAGTGATTGGACC-3'，(SEQ ID NO.9)，R1084：5'-GCGTGAGCGCATACGCTACTTG-3'，(SEQ ID NO.10)。R1059和R1060分别位于整合位点上游和下游的约100个碱基处，R1083为TEV蛋白酶基因5'一段序列的反向互补，R1084为庆大霉素抗性基因启动子区域的一段序列。以不同的引物配对抗性菌株进行PCR验证。重组工程法获得TEV敲入基因组BL21(DE3)基因组的示意图如附图1所示。基因组分析的凝胶电泳结果如附图2所示，所获得基因工程菌株命名为LS2416，其中pTKRed通过高温(42℃)培养消除。LS2416已作为专利菌株保存在中国微生物菌种保藏中心，菌株保存号为CGMCC8850。

LS2416单菌落转接至含25μg/ml的庆大霉素LB培养基培养过夜后，1:50转接10ml扩大培养，当培养至OD600约0.8时,加入1mM IPTG于30℃诱导表达6h。以SDS-PAGE检测蛋白表达的结果见附图4的第2,3泳道，可见LS2416诱导表达的TEV量较少。

实施例2.表达载体的构建

pLS912为含His和MBP两个融合标签和1.5kb填充片段的融合表达载体，描述见文献7。为将与MBP融合的His标签去除，设计引物P1901：5'-GGGGAATTCATATGGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTG-3'，(SEQ ID NO.11)，引入的EcoRI和NdeI酶切位点以下划线表示；P1902：5'-GGGGGATCCAGCAGA TCTTTGTTATAAATC-3'，(SEQ ID NO.12)，引入的EcoRI位点和扩增序列中所含的BglII酶切位点以下划线表示。以pLS912为模板，PCR扩增得到0.4kb片段，以NdeI-BglII酶切后，与7.5kb pLS912以NdeI-BglII酶切的载体连接，筛选得到重组克隆pLS1902。在MBP融合标签和填充片段之间含GAGAATCTTTATTTTCAGGGC，其编码氨基酸的序列为ENLYFQ↓G，↓表示TEV酶切位点。

以LS2416进行细胞内剪切的示意图如图3所示。将目的基因克隆至pLS1902后转化至LS2416，在IPTG诱导之下同时表达TEV蛋白酶和融合蛋白，TEV作用于MBP和目的蛋白之间的TEV识别位点而发生细胞内剪切而释放目的蛋白。

实施例3.细胞内剪切MBP-GFP蛋白

设计引物RG3：5'-GAAGGATCCAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC-3'，(SEQ ID NO.13)，RG4：5'-GAACTCGAGCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3'，(SEQ ID NO.14)，引入的BamHI和XhoI酶切位点以下划线表示。以质粒pJOE4905.1为模板，PCR扩增得到0.7kb的GFP基因，以BamHI-XhoI酶切后，克隆至pKS的BamHI-XhoI酶切位点，酶切和测序正确，得到pLS2436。pLS2436以BamHI-XhoI酶切，回收0.7kb的GFP基因片段，克隆至pLS1902以BamHI-XhoI酶切所得6.4kb载体，得到MBP-GFP融合表达载体pLS2437。GFP的3'端和载体上的Histag融合，以此后的终止子来终止表达。pLS2437转化至BL21(DE3)，在30℃，以1mM IPTG诱导表达，6h获得69.1KD表达蛋白，见附图4的第4,5泳道，可见MBP-GFP融合蛋白为高表达。

将pLS2437转化至LS2416，在30μg/ml卡那霉素和25μg/ml庆大霉素筛选之下获得菌株LS2416/pLS2437。LS2416/pLS2437单菌落接种至3ml含30μg/ml卡那霉素和25μg/ml庆大霉素于220rpm，37C培养过夜后，0.2ml转接10ml相同培养基，37C继续培养至OD600～0.6时，加入1mM IPTG同时诱导TEV的表达和MBP-GFP融合蛋白的表达，30℃培养6小时，离心收集1ml菌体。悬浮于300μl ddH₂O，超声处理，SDS-PAGE观察总蛋白和可溶性蛋白的表达，并分析细胞内剪切的效率。结果如附图4的第6,7泳道，可见TEV实现了对MBP-GFP完全的细胞内酶切，所释放的GFP可溶性蛋白的组份约占总蛋白的50％，可通过以天然蛋白的形式进行分离纯化。

实施例4.细胞内剪切MBP-shRnBP蛋白

设计引物RBP3：5'-GAAGGATCC ATGGAGAAAGAGCGAGAGACTC-3'，(SEQ IDNO.15)，RBP4：5'-GAACTCGAG TGGTCAGGGTCCCATCCGGAG-3'，(SEQ ID NO.16)，引入的BamHI和XhoI酶切位点以下划线表示。含hRnBP基因的质粒phRnBP为模板，PCR扩增得到0.9kb的截短的hRnBP片段，以shRnBP表示。以BamHI-XhoI酶切后，克隆至pKS的BamHI-XhoI酶切位点，酶切和测序正确，得到pLS2438。pLS2438以BamHI-XhoI酶切，回收0.9kb的shRnBP，克隆至pLS1902以BamHI-XhoI酶切所得6.4kb载体，得到MBP-GFP融合表达载体pLS2439。shRnBP的3'端和载体上的Histag融合，以此后的终止子来终止表达。pLS2439转化至BL21(DE3)，在30℃，以1mM IPTG诱导表达，6h获得74.5KD表达蛋白，见附图4的的第8,9泳道，可见MBP-shRnBP为高表达。如上述的方法，将pLS2439转化至LS2416，在30μg/ml卡那霉素和25μg/ml庆大霉素筛选之下获得菌株LS2416/pLS2439。LS2416/pLS2439细胞内酶切结果见附图4的第10,11泳道。约60％的酶切效率，shRnBP几乎完全以包涵体的形式存在，可以通过将菌体以变性剂溶解，再通过变性和复性的方式进行分离纯化。

Claims

1.一种大肠杆菌细胞内蛋白酶剪切融合蛋白以分离目的蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：

(2)融合表达载体转化至细胞内剪切宿主菌后，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导之下，同时表达融合蛋白和基于宿主菌染色体的TEV蛋白酶，TEV作用于融合标签蛋白和目的蛋白之间的TEV酶切位点而将目的蛋白分离。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细胞内剪切宿主菌为通过重组工程方法将强启动子T7驱动的TEV蛋白酶基因整合至大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)而获得。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：重组工程所使用的重组酶基因来源于lambda噬菌体，通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导而表达。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的融合标签蛋白是麦芽糖结合蛋白。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：表达载体为将麦芽糖结合蛋白和填充片段克隆至表达载体pET30(+)而获得，将不含终止子目的基因取代填充片段而获得融合表达载体，融合表达蛋白的末端含载体的6个组氨酸。