CN101392249A - 一种抗菌肽基因及其制备方法和该基因在毕赤酵母载体中的表达质粒的构建 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体是一种抗菌肽基因及其制备方法和该基因在毕赤酵母载体中的表达质粒的构建。具体抗菌肽基因序列为序列前端加Kex2蛋白酶切割位点，后面加终止密码子TAA，两端有EcoR I和Xba I酶切位点，如SEQ ID NO.1所示序列由135bp组成。而后将所述抗菌肽克隆至毕赤酵母表达载体pPICZαA中，经过DNA测序证明序列克隆正确，通过此方法成功设计了该抗菌肽的基因序列，并构建获得了其真核重组表达质粒pPICZαA－Shiva。本发明人工构建的抗菌肽Shiva－1为异源表达提供了新途径；为后续的Shiva－1在毕赤酵母中转基因表达的研究和应用鉴定基础。

Description

一种抗菌肽基因及其制备方法和该基因在毕赤酵母载体中的表达质粒的构建

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种抗菌肽基因及其制备方法和该基因在毕赤酵母载体中的表达质粒的构建。

背景技术

抗生素在过去的大半个世纪里极大地延长了人类的寿命，但同时随着抗生素的长期使用，引发了许多抗药性病源微生物。而近年来发展起来的抗菌肽不仅具有广谱抗菌活性和其他一些药用价值，更重要的是它们几乎不会产生耐药性问题。

抗菌肽是一类具有免疫学功能的小分子活性多肽的统称。它们具有抗细菌、真菌、肿瘤、病毒、内毒素和原生动物，刺激单核细胞和嗜中性白细胞的趋化作用，促进创伤愈合等生物活性。主要存在于昆虫中，现在几乎在所有的物种中都分离到了。

微生物很容易通过基因突变对传统的抗生素产生耐受性，然而，微生物通过基因突变的方式来产生对抗菌肽的耐受性几乎是不可能的。因为其抗菌机制是不同的：抗生素一般是通过抑制细菌的细胞壁、蛋白质或DNA等的合成来发挥作用的，这种作用需要一些特殊受体；而抗菌肽一般是通过物理作用造成细胞膜的穿孔，这样就不需要一些特殊的受体。

1975年瑞典科学家G.Boman等人从惜古比天蚕(Hyatophoracecropia)蛹中诱导分离得到一种杀菌肽，并将其命名为cecropin。1988年Jaynes J M利用电脑模拟技术以天蚕素(Cecropin)B为蓝本，在不改变二级结构的前提下，合成了一个与天蚕素B类似的抗菌肽——Shiva-1。结果Shiva-1中有约60％的氨基酸被置换，且C末端的酰胺化的甘氨酸也变成去酰胺化的甘氨酸。分子螺旋度Shiva-1为65％，Cecropin为53％。N端一半形成一个结构近于完美的极化的两亲性(amphipathic)α-螺旋，即圆柱形分子的纵轴一边是带正电荷的亲水集团而对称面是疏水区；C端一半为疏水尾。具有两亲性α-螺旋结构的蛋白质与质膜相作用，这使Shiva-1抗菌活性主要依赖于两亲性α-螺旋结构。Shiva-1对革兰氏阳性菌、特别是对革兰氏阴性菌有强大的杀伤力，致死浓度均在μ mol/L级；100μmol/L就可以使疟疾原虫完全致死；对肿瘤细胞的杀伤作用具有选择性，与目前常用的抗癌药物有明显的不同，肿瘤细胞的细胞骨架的缺陷是杀菌肽选择性杀伤作用的位点。Shiva-1的抗菌和疟疾原虫活性远强于天然的天蚕素B，而对感染和未感染的寄主细胞均没有伤害。对癌细胞的作用优于Cecropin B，如对癌细胞钙离子逸出的浓度Shiva-1为50μg/ml，而Cecropin B为150μg/ml。Shiva-1破坏肿瘤细胞的钙离子通道使胞内的钙离子在短时间内大量逸出，也是导致肿瘤细胞损伤不可恢复的原因之一。近年来已有人报道将38个氨基酸的Shiva-1序列N端的两个氨基酸蛋氨酸和脯氨酸去掉，活性和表达量基本不受影响。

Shiva-1已经在大肠杆菌、泡桐、苍蝇之中得到了表达，Cecropin B也已经在毕赤酵母中得到了表达。酵母本生就是很好的高蛋白饲料，通过基因表达技术可实现将具有抗菌活性的肽类随着酵母饲料的喂养直接摄入禽畜体内，增强其免疫力，简单方便；在饲料发酵过程中同步获得，成本降低。用酵母表达抗菌肽易于实现其药用价值的早日市场化。

发明内容

本发明目的在于提供一种用酵母表达抗菌肽易于实现其药用价值的抗菌肽基因及其制备方法和该基因在毕赤酵母载体中的表达质粒的构建。

为实现上述目的本发明采用的技术方案为：

抗菌肽基因：由SEQ ID NO.1序列表所示，其中序列由135bp组成，序列前端加Kex2蛋白酶切割位点，后面加终止密码子TAA，两端有EcoR I和Xba I酶切位点。

抗菌肽基因的制备方法：

a.用引物F1和R1互为模板，通过聚合酶链式反应得抗菌肽Shiva-1基因序列的中间段78bp的粗产物；

b.将上述扩增产物在质量百分比为15％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，回收抗菌肽Shiva-1基因序列的中间段78bp的目的片断；

c.以步骤b)回收得到的产物为模板，用引物F2和R2通过聚合酶链式反应得到抗菌肽Shiva-1基因全序列的粗产物；

d.将步骤c)扩增产物进行质量百分比为15％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，回收抗菌肽Shiva-1基因全序列；

其中：

F1：5′TgTTCAgAAgAATCgACAgAgTTggTAAgCAAATTAAgCAAggTATCC 3′

R1：5′CgACCAAggCgATAgCTggACCggCTCTCAggATACCTTgCTTAATTTg 3′

F2：5′gCggAATTCAAAAgAAgATggAgATTgTTCAgAAgAATCgACAgAg 3′

R2：5′gCgTCTAgATTAACCAACAgCTCTAgCATCACCgACCAAggCgATAgC 3′。

所述步骤a)中聚合酶链式反应的PCR体系：F1：50-100pmol，R1：50-100pmol，10pfu DNA聚合酶buffer：5±0.1μl，dNTP：各32-40pmol，pfuDNA聚合酶：2-5U，无菌水补足50μl；

PCR反应条件：将上述PCR体系混匀，第一阶段94-95℃预变性2-5min；第二阶段94-95℃，30-50S；54-56℃，30-40S；70-72℃，30-40S，共进行30-35个循环；第三阶段70-72℃延伸4-7min。

所述步骤c)中聚合酶链式反应的PCR体系：模板：0.5-2μl，F2：20-50pmol，R2：20-50pmol，10pfu DNA聚合酶buffer：5±0.1μl，dNTP：各32-40pmol，pfu DNA聚合酶：2-5U，无菌水补足50μl；

PCR反应条件：将上述PCR体系混匀，第一阶段94-95℃预变性2-5min；第二阶段94-95℃，30-50S；56-59℃，30-40S；70-72℃，30-40S，共进行30-35个循环；第三阶段70-72℃延伸5-7min。

抗菌肽基因在毕赤酵母载体中的表达质粒的构建：

a.取0.8-1.0μg所述的抗菌肽Shiva-1的DNA和毕赤酵母载体pPICZα A分别在37±2℃进行Xba I和EcoR I的双酶切2-6小时，备用；

b.按摩尔比计取步骤a)双酶切后所得的pPICZ α和AShiva-1的DNA序列，pPICZα和AShiva-1的DNA序列摩尔数之比＝1:3-9，而后将其在16±4℃下置于10-15μl的连接体系中，连接8-12小时；

其中，连接反应体系为：10×T4 DNA连接酶buffer 1±0.1μl，T4 DNA连接酶3-350U，余量为ddH₂O；

c.将冷冻保藏的大肠杆菌DH5 α感受态细胞取出后置于冰浴中，取80-200μl感受态细胞并加入10-15μl上述连接后的连接产物，继续在冰水浴中放置25-35分钟，然后置于42±0.5℃水浴中热激60-90秒，再置于冰水浴中2-5分钟，将冰浴后产物加入400-900μl的液体SOC培养基，在37±2℃摇床中160-200rpm培养0.5-1小时，然后将培养0.5-1小时之后的培养物均匀涂在含有25-30μg/ml的Zeocin的LLB平板固体培养基上，在37±2℃培养箱倒置培养12-20小时，备用；

d.将步骤c)培养后长出的单菌落挑取再接种到含有25-30μg/ml的Zeocin的LLB平板培养基，在37±2℃培养箱倒置培养12-20小时，备用；

e.挑取步骤d)中培养的单菌落于20-50μl无菌水中，98-100℃煮沸5-10分钟，然后置于冰浴中2-5分钟，再1000-12000rpm离心1-5分钟，收集上清，取0.5±0.2μl作为模板，用引物F3和R3或F1和R3进行PCR检验目的序列是否已经克隆到大肠杆菌DH5 α中，

引物为：F3：5′gCggAATTCAAAAgAAgATg 3′

R3：5′gCgTCTAgATTAACCAACAg 3′

F1：5′TgTTCAgAAgAATCgACAgAgTTggTAAgCAAATTAAgCAAggTATCC 3′；

f.将步骤e)菌落PCR扩增验证得到的阳性克隆菌株，接种于10ml的含有25-30μg/ml的Zeocin的LLB液体培养基中，37±2℃ 180-220rpm培养8-12个小时，取3-5ml培养后的菌液，4000-6000rpm离心4-5min收集菌体，而后用试剂盒提取质粒，提取的质粒经在37±1℃进行Xba I和EcoR I的双酶切4-6小时并电泳验证正确，即得到了构建的重组质粒pPICZα A-Shiva。

所述步骤a、f所述的双酶切为：将待酶切的物质在Xba I的20±1μl酶切体系37±0.5℃下酶切4±2小时，然后向该体系中补加1mol/L的NaCl溶液1.3±0.3μL和pH7.5的1mol/L的Tris-HCl溶液1±0.1μl，进行Xba I酶切；而后加入EcoR I 1±0.2μl，继续置于37±0.5℃酶切2±0.5小时，得双酶切产物。

所述20±1μl Xba I的酶切为：待酶切的DNA序列0.8-1.1μg，质量百分比为0.1％的BSA 2±0.1μl，10×M buffer 2±0.1μl，Xba I 5-10U，余量为无菌水。

所述步骤e)中PCR体系：模板：0.5-1μl，F3或F1：10-30pmol，R3：10-30pmol，10×pfu DNA聚合酶buffer：2.5±0.1μl，dNTP：各16-20pmol，pfu DNA聚合酶：1-2U，用无菌水补足至25μl。

PCR反应条件：将上述PCR体系混匀，第一阶段94-95℃预变性4-5min，第二阶段94-95℃，30-40S；54-56℃，30-40S；70-72℃，30-40S，共进行30-35个循环；第三阶段70-72℃延伸4-7min。

本发明具有如下优点：

1.本发明人工构建的抗菌肽Shiva-1适于毕赤酵母使用的核苷酸序列，有利于密码子在毕赤酵母中的识别和表达。

2.本发明将人工构建抗菌肽Shiva-1的核苷酸序列克隆到适于在大肠杆菌和毕赤酵母中穿梭的质粒pPICZ α A中，既可以保证质粒pPICZ α A在大肠杆菌中得到足量的扩增以便于将pPICZ α A转入毕赤酵母，又可以使抗菌肽Shiva-1在毕赤酵母中的表达。

3.本发明人工构建的抗菌肽Shiva-1的用于毕赤酵母表达的重组质粒pPICZ α A-Shiva，首次将Shiva-1的基因序列克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中，为其在毕赤酵母中得表达奠定了基础。

4.本发明人工构建的抗菌肽Shiva-1为异源表达提供了新途径——在毕赤酵母中表达，该表达系统具有可对表达的外源蛋白进行有效的加工修饰，从而使表达的蛋白保留了原有的生物活性等优点。

5.本发明根据去掉N端的蛋氨酸和脯氨酸的Shiva-1序列，运用毕赤酵母密码子偏好性，兼顾引物设计需要，设计合成了Shiva-1的cDNA，并将其克隆到pPICZ α-A载体上。

6.本发明构建的适合于毕赤酵母表达的Shiva-1的DNA序列，将其克隆到用于毕赤酵母表达的可以在大肠杆菌和毕赤酵母中穿梭的质粒pPICZ α A中，构建重组表达质粒pPICZ α A-Shiva，为后续的Shiva-1在毕赤酵母中转基因表达的研究和应用鉴定基础。

附图说明

图1为Shiva-1序列PCR扩增所合成的序列片断的15％PAGE电泳图。其中1为20bp lander marker；2为第一对引物F1、R1扩增后所获得的78bp的序列片断；3为以第一次扩增产物78bp片段为模板，用第二对引物F2、R2扩增产物135bp目的片断。

图2为Shiva-1序列以第二对引物F2、R2经PCR扩增后所获得的135bp的序列片断的双酶切后15％PAGE电泳图。其中1为20bp lander marker；2为第二对引物扩增产物135bp目的片断；3为第二对引物扩增而成的135bp的Shiva-1目的序列经EcoR I和Xba I双酶切后的电泳图。

图3为本发明构建的用于毕赤酵母表达的重组质粒pPICZ α A-Shiva经菌落PCR后的15％PAGE电泳图。其中1为20bp lander marker；2为F3和R3扩增产物(135bp)；3为F1 and R3(110bp)。

图4为本发明构建的用于毕赤酵母表达的重组质粒pPICZ α A-Shiva经EcoRI和Xba I双酶切后的2.0％琼脂糖电泳图。其中1为DNA marker III；2为空质粒pPICZ α A双酶切产物；3为重组质粒pPICZ α A-Shiva双酶切产物；4为以重组质粒pPICZ α A-Shiva为模板，F3、R3为引物PCR产物。

20bp lander marker电泳条带：20，40，60，80，100，120，140，160，180，200bp。

DL2000 DNA marker电泳条带：100，250，500，750，1000，2000bp。

DNA marker III电泳条带：200，500，800，1200，2000，3000，4500bp。

具体实施方式

实施例1

1.抗菌肽Shiva-1的基因序列如SEQ ID NO.1(参见图1)：

GCGGAATTCA AAAGAAGATG GAGATTGTTC AGAAGAATCG ACAGAGTTGG TAAGCAAATT    60

AAGCAAGGTA TCCTGAGAGC CGGTCCAGCT ATCGCCTTGG TCGGTGATGC TAGAGCTGTT    120

GGTTAATCTA GACGC                                                    135

(a)序列特征：

●长度：135个碱基对

●类型：核酸

●链型：双链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：双链DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：人工设计

2.抗菌肽Shiva-1的DNA序列的合成：

a.用引物F1和R1互为模板，通过聚合酶链式反应得抗菌肽Shiva-1基因序列的中间段78bp的粗产物；

其中，PCR体系：F1：50pmol，R1：50pmol，10×pfu DNA聚合酶buffer溶液5μl，dNTP(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)：各10pmol，pfu DNA聚合酶：2U，无菌水：补足至总体积50μl；pfu DNA聚合酶和pfu DNA聚合酶buffer购自上海生物工程有限公司。

PCR反应条件：将上述PCR体系混匀，第一阶段95℃预变性2min；第二阶段94℃，30S；55℃，30S；72℃，30S，共进行30个循环；第三阶段72℃延伸7min。

引物：F1：5′TgTTCAgAAgAATCgACAgAgTTggTAAgCAAATTAAgCAAggTATCC 3′

      R1：5′CgACCAAggCgATAgCTggACCggCTCTCAggATACCTTgCTTAATTTg 3′

F为正向，R为反向。

b.将上述扩增产物进行15％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳条件为：先50V电泳0.5小时，再70-80V电泳至溴酚蓝条带跑到胶板边缘，停止电泳，用Genefinder染料染色，对78bp的目的片断切胶，用压碎与浸泡法回收抗菌肽Shiva-1基因序列的中间段78bp的目的片断(压碎与浸泡法参考《分子克隆》第三版，冷泉港出版社出版冷泉港出版社出版第三版)(参见图1)。

其中，质量百分(g/ml)比为15％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳配方参考《分子克隆》第三版，冷泉港出版社出版冷泉港出版社出版第三版)

c.以步骤b)回收得到的产物为模板，用引物F2和R2通过聚合酶链式反应得到抗菌肽Shiva-1基因全序列的粗产物；

其中PCR体系，模板：0.5-2μl，F2：20-50pmol，R2：20-50pmol，10pfuDNA聚合酶buffer：5±0.1μl，dNTP：32-40pmol，pfu DNA聚合酶：2-5U，无菌水补足50μl。

PCR反应条件：将上述PCR体系混匀，第一阶段95℃预变性5min；第二阶段94℃，30S；58℃，30S；72℃，40S，共进行30个循环；第三阶段72℃延伸7min。

引物：F2：5′gCggAATTCAAAAgAAgATggAgATTgTTCAgAAgAATCgACAgAg 3′

      R2：5′gCgTCTAgATTAACCAACAgCTCTAgCATCACCgACCAAggCgATAgC 3′

d.将步骤c)扩增产物进行15％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳条件为：先50V电泳0.5小时，再70-80V电泳至溴酚蓝条带跑到胶板边缘，停止电泳，用Genefinder染料染色，对135bp的目的序列切胶，用压碎与浸泡法回收抗菌肽Shiva-1基因全序列的目的片断(压碎与浸泡法参考《分子克隆》第三版，冷泉港出版社出版冷泉港出版社出版)(参见图1)。

通过图1可清楚看见Shiva-1目的序列中间的78bp和全长135bp都已经扩增得到。

实施例2

抗菌肽Shiva-1序列与载体pET28a的连接：

a.1)抗菌肽Shiva-1的DNA序列的双酶切及其回收：取1μg实施例1制得抗菌肽Shiva-1的DNA序列在Xba I的20μl酶切体系37℃酶切4小时，然后向该体系中补加1mol/L的NaCl溶液1.3μL和pH7.5的1mol/L的Tris-HCl溶液1μl，进行抗菌肽Shiva-1的DNA序列的Xba I酶切；而后加入EcoR I 1μl，继续置于37℃酶切2小时，得抗菌肽Shiva-1的DNA序列的双酶切初产物；再将双酶切产物进行15％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证。图2证明Shiva-1目的序列全长135bp已经扩增得到，并且酶切位点已经加上且正确地加在序列的两端。

其中：Xba I的20μl酶切体系按照Takara公司的说明书操作，具体为待酶切DNA 1μg，0.1％BSA 2μl，10×M buffer 2μl，Xba I 10U(或1μl)，余量无菌水20μl；限制性内切酶EcoR I、Xba I及其缓冲液购自Takara公司。

2)pPICZα A质粒的双酶切及其回收：

①pPICZα A质粒的提取：将本实验室-70℃甘油保藏的含有穿梭质粒pPICZα A的大肠杆菌Top10F’培养于含有25μg/ml的Zeocin(博来霉素，购自Invitrogen公司)的LLB平板培养基上，37℃过夜培养。然后挑去单菌落接种于10ml的含有25μg/ml的Zeocin的LLB培养基中，37℃200rpm培养9个小时收集菌体，并采用购自博大泰克公司的B型质粒提取试剂盒提取质粒，其操作按照说明书进行，得到pPICZα A质粒。

LLB平板培养基成分：酵母提取物0.5％，胰蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％。

②pPICZα A质粒的双酶切及其回收：取1μg上述pPICZα A质粒在XbaI的20μl酶切体系37℃酶切4小时，然后向该体系中补加1mol/L的NaCl溶液1.3μL和pH7.5的1mol/L的Tris-HCl溶液1μl，进行pPICZ α A质粒的Xba I酶切；而后加入EcoR I 1μl，继续置于37℃酶切2小时，得pPICZ α A质粒的双酶切初产物；再将初产物用质量百分比为1.0％的琼脂糖在120V电压下电泳，用TAKARA公司的A型DNA片断回收试剂盒回收得pPICZ α A质粒的双酶切产物。

b.按摩尔比计取步骤a)双酶切后所得的pPICZ α和AShiva-1的DNA序列，pPICZ α和AShiva-1的DNA序列摩尔数之比＝1:3，而后将其在16℃下置于10μl的连接体系中，连接8小时；

其中，连接反应10μl体系为：10×T4 DNA连接酶buffer 1±0.1μl，T4DNA连接酶3-350U，余量为ddH₂O。

c.将冷冻保藏的大肠杆菌DH5 α感受态细胞取出后立即置于冰浴取出后立即置于0℃的冰水浴中，然后在100μl感受态细胞中加入15μl连接产物，继续在0℃的冰水浴中放置30分钟，然后迅速置于42℃水浴中热激90秒，再立即置于0℃的冰水浴中2分钟，然后将其加入900μl的SOC培养基，在37℃下170rpm培养0.5小时，然后将培养0.5小时之后的培养物均匀涂在含有25μg/ml的Zeocin的LLB平板固体培养基上，在37±2℃培养箱倒置培养12小时，备用

其中，SOC培养基成分：2％蛋白胨，0.5％酵母提取物(购自OXOID公司)，10mM NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl 2，10mM MgSO4，20mM葡萄糖；LLB培养基配方：酵母提取物0.5％，胰蛋白胨1％，NaCl 0.5％。固体培养基中加入1.7％的琼脂；

感受态细胞溶解在0.10mol/L的CaCl₂溶液中，并加入占总体积10％的灭菌甘油，-70摄氏度保藏。感受态细胞浓度为：1万-3万个细胞/ml。

d.用牙签挑取挑取步骤c)LLB培养基上培养的单菌落(其中单菌落中含50-1000个细胞)接种到含有25μg/ml的Zeocin的LLB平板培养基，并编号以便在下面的步骤e中进行阳性可隆筛选，在37±2℃培养箱倒置培养12小时，得到单克隆平板。

e.用牙签挑取单克隆平板中培养的单菌落(其中单菌落中含50-1000个细胞)于20μl无菌水中，100℃煮沸5分钟，然后置于冰浴中2分钟，再12000rpm离心5分钟，收集上清作为模板，用引物F3和R3或F1和R3进行PCR检验目的序列是否已经连接到载体pPICZ α A中；

其中，PCR体系：模板：0.5-1μl，F3或F1：10pmol，R3：10pmol，10×pfuDNA聚合酶buffer：2.5μl，dNTP：各20pmol，pfu DNA聚合酶：1-2U，用无菌水补足至25μl。

PCR反应条件：将上述PCR体系混匀，第一阶段95℃预变性5min，第二阶段94℃，30S；55℃，30S；72℃，40S，共进行30个循环；第三阶段72℃延伸7min。

引物为：F3：5′gCggAATTCAAAAgAAgATg 3′

        R3：5′gCgTCTAgATTAACCAACAg 3′

        F1：5′TgTTCAgAAgAATCgACAgAgTTggTAAgCAAATTAAgCAAggTATCC 3′

经PCR扩增所得产物当引物为F3时，阳性克隆扩增产物为135bp；当引物为F1时，阳性克隆扩增产物为110bp。图3证明所设计的Shiva-1目的序列全长135bp去掉两端的酶切位点及其保护剪辑后剩余的117bp已经重组到重组载体中，并且序列大小正确，已经成功转入大肠杆菌DH5 α中。

f.将扩增得到的PCR初步验证获得的阳性克隆单菌落，用接种环挑取单菌落(其中单菌落中含50-1000个细胞)接种于10ml的含有25μg/ml的Zeocin的LLB试管液体培养基中，37℃ 200rpm培养9-11个小时，收集菌体，提取质粒。质粒提取采用购自博大泰克公司的B型质粒提取试剂盒，操作按照说明书进行。而后将提取好的1μg重组质粒pPICZ α A-Shiva经Xba I以20μl酶切体系37℃酶切过夜，Xba I酶切体系按照Takara公司的说明书操作，然后向该体系中补加1mol/L的NaCl溶液1.3μl，pH7.5的1mol/L的Tris-HCl溶液1μl，进行重组质粒pPICZ α A-Shiva的Xba I酶切，然后加入EcoR I 1μl，继续置于37℃酶切4小时，最终得到双酶切的重组质粒pPICZ α A-Shiva。(酶切结果参见图4)

所得质粒的保藏：

将双酶切验证后的阳性克隆单菌落接种至10ml的含有25μg/ml的Zeocin的LLB试管液体培养基中，37℃ 200rpm培养9-11个小时，然后向菌液中加入质量比30％终浓度的甘油，分装成1ml的若干份，保藏于-70℃，备用；同时将其送海生物工程服务有限公司测序。

图4证明Shiva-1目的序列全长135bp去掉两端的酶切位点及其保护剪辑后剩余的117bp已经重组到载体pPICZ α A中，获得了重组载体pPICZ α A-Shiva，重组载体中的目的序列大小和载体序列大小都正确，且重组位点正确。再经过测序进一步确证克隆序列碱基正确和重组质粒构建成功。

所得的重组质粒pPICZ α A-Shiva序列：AGATCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAATGAAACCTTTTTGCCATCCGACATCCACAGGTCCATTCTCACACATAAGTGCCAAACGCAACAGGAGGGGATACACTAGCAGCAGACCGTTGCAAACGCAGGACCTCCACTCCTCTTCTCCTCAACACCCACTTTTGCCATCGAAAAACCAGCCCAGTTATTGGGCTTGATTGGAGCTCGCTCATTCCAATTCCTTCTATTAGGCTACTAACACCATGACTTTATTAGCCTGTCTATCCTGGCCCCCCTGGCGAGGTTCATGTTTGTTTATTTCCGAATGCAACAAGCTCCGCATTACACCCGAACATCACTCCAGATGAGGGCTTTCTGAGTGTGGGGTCAAATAGTTTCATGTTCCCCAAATGGCCCAAAACTGACAGTTTAAACGCTGTCTTGGAACCTAATATGACAAAAGCGTGATCTCATCCAAGATGAACTAAGTTTGGTTCGTTGAAATGCTAACGGCCAGTTGGTCAAAAAGAAACTTCCAAAAGTCGGCATACCGTTTGTCTTGTTTGGTATTGATTGACGAATGCTCAAAAATAATCTCATTAATGCTTAGCGCAGTCTCTCTATCGCTTCTGAACCCCGGTGCACCTGTGCCGAAACGCAAATGGGGAAACACCCGCTTTTTGGATGATTATGCATTGTCTCCACATTGTATGCTTCCAAGATTCTGGTGGGAATACTGCTGATAGCCTAACGTTCATGATCAAAATTTAACTGTTCTAACCCCTACTTGACAGCAATATATAAACAGAAGGAAGCTGCCCTGTCTTAAACCTTTTTTTTTATCATCATTATTAGCTTACTTTCATAATTGCGACTGGTTCCAATTGACAAGCTTTTGATTTTAACGACTTTTAACGACAACTTGAGAAGATCAAAAAACAACTAATTATTCGAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAATTCAAAAGAAGATGGAGATTGTTCAGAAGAATCGACAGAGTTGGTAAGCAAATTAAGCAAGGTATCCTGAGAGCCGGTCCAGCTATCGCCTTGGTCGGTGATGCTAGAGCTGTTGGTTAATCTAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGAGTTTGTAGCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGACCTTCGTTTGTGCGGATCCCCCACACACCATAGCTTCAAAATGTTTCTACTCCTTTTTTACTCTTCCAGATTTTCTCGGACTCCGCGCATCGCCGTACCACTTCAAAACACCCAAGCACAGCATACTAAATTTTCCCTCTTTCTTCCTCTAGGGTGTCGTTAATTACCCGTACTAAAGGTTTGGAAAAGAAAAAAGAGACCGCCTCGTTTCTTTTTCTTCGTCGAAAAAGGCAATAAAAATTTTTATCACGTTTCTTTTTCTTGAAATTTTTTTTTTTAGTTTTTTTCTCTTTCAGTGACCTCCATTGATATTTAAGTTAATAAACGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAGTTTCATTTTTCTTGTTCTATTACAACTTTTTTTACTTCTTGTTCATTAGAAAGAAAGCATAGCAATCTAATCTAAGGGGCGGTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAACCATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACCGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGACACGTCCGACGGCGGCCCACGGGTCCCAGGCCTCGGAGATCCGTCCCCCTTTTCCTTTGTCGATATCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCCCCCACATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTTTTTATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTATATTTCAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAGACGCGTGTACGCATGTAACATTATACTGAAAACCTTGCTTGAGAAGGTTTTGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCAAGCTGGAGACCAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATC

(a)序列特征：

●长度：3653个碱基对

●类型：核酸

●链型：双链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：双链DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：人工设计

实施例3

与实施例2不同之处在于

抗菌肽基因在毕赤酵母载体中的表达质粒的构建：

a.取0.8μg所述的抗菌肽Shiva-1的DNA和毕赤酵母载体pPICZ α A分别在37±2℃进行Xba I和EcoR I的双酶切2-6小时，备用；

b.按摩尔数计取步骤a)双酶切后所得的pPICZ α和AShiva-1的DNA序列，pPICZ α和AShiva-1的DNA序列摩尔数之比＝1:9，而后将其在20℃下置于15μl的连接体系中，连接12小时；

其中，15μl的连接体系为：10×T4 DNA连接酶buffer 1-1.5μl，T4 DNA连接酶5-530U，余量为ddH₂O；

c.将冷冻保藏的大肠杆菌DH5 α感受态细胞取出后置于冰浴中，然后在200μl感受态细胞中加入10μl上述连接后的连接产物，继续在冰水浴中放置35分钟，然后置于42±0.5℃水浴中热激60秒，再置于冰水浴中5分钟，然后将其加入400μl的液体SOC培养基，在37±2℃摇床中200rpm培养1小时，然后将培养1小时之后的培养物均匀涂在含有30μg/ml的Zeocin的LLB平板固体培养基上，在37±2℃培养箱倒置培养20小时，备用；

d.将步骤c)培养后长出的单菌落挑取再接种到含有25-30μg/ml的Zeocin的LLB平板培养基，在37±2℃培养箱倒置培养12-20小时，备用；

e.用牙签挑取步骤d)中培养的单菌落与50μl无菌水中，98℃煮沸10分钟，然后置于冰浴中5分钟，再1000rpm离心5分钟，收集上清，取0.5±0.2μl作为模板，用引物F3和R3或F1和R3进行PCR检验目的序列是否已经克隆到大肠杆菌DH5 α中，

引物为：F3：5′gCggAATTCAAAAgAAgATg 3′

        R3：5′gCgTCTAgATTAACCAACAg 3′

        F1：5′TgTTCAgAAgAATCgACAgAgTTggTAAgCAAATTAAgCAAggTATCC 3′；

f.将步骤e)菌落PCR扩增验证得到的阳性克隆菌株，接种于10ml的含有25-30μg/ml的Zeocin的LLB液体培养基中，37±2℃180-220rpm培养8-12个小时，取3-5ml培养后的菌液，4000-6000rpm离心4-5min收集菌体，而后用试剂盒提取质粒，提取的质粒经在37±1℃进行Xba I和EcoR I的双酶切4-6小时并电泳验证正确，即得到了构建的重组质粒pPICZ α A-Shiva。

Untitled.ST25

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院沈阳应用生态研究所

<120>一种抗菌肽基因及其制备方法和该基因在毕赤酵母载体中的表达质粒的构建

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工设计

<220>

<221> CDS

<222> (10)..(126)

<223>

<400> 1

<210> 2

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工设计

<400> 2

<210> 3

<211> 3653

<212> DNA

<213> 人工设计

<220>

<221> CDS

<222> (1214)..(1330)

<223>

<400> 3

<210> 4

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工设计

<400> 4

Claims (9)

1.一种抗菌肽基因，其特征在于：由SEQ ID NO.1序列表所示，其中序列由135bp组成，序列前端加Kex2蛋白酶切割位点，后面加终止密码子TAA，两端有EcoR I和Xba I酶切位点。

2.一种按权利要求1所述的抗菌肽基因的制备方法，其特征在于：

a.用引物F1和R1互为模板，通过聚合酶链式反应得抗菌肽Shiva-1基因序列的中间段78bp的粗产物；

b.将上述扩增产物在质量百分比为15％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，回收抗菌肽Shiva-1基因序列的中间段78bp的目的片断；

c.以步骤b)回收得到的产物为模板，用引物F2和R2通过聚合酶链式反应得到抗菌肽Shiva-1基因全序列的粗产物；

d.将步骤c)扩增产物进行质量百分比为15％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，回收抗菌肽Shiva-1基因全序列；

其中：

F1：5′TgTTCAgAAgAATCgACAgAgTTggTAAgCAAATTAAgCAAggTATCC 3′

R1：5′CgACCAAggCgATAgCTggACCggCTCTCAggATACCTTgCTTAATTTg 3′

F2：5′gCggAATTCAAAAgAAgATggAgATTgTTCAgAAgAATCgACAgAg 3′

R2：5′gCgTCTAgATTAACCAACAgCTCTAgCATCACCgACCAAggCgATAgC 3′。

3.按权利要求2所述的抗菌肽基因的制备方法，其特征在于：所述步骤a)中聚合酶链式反应的PCR体系：

F1：50-100pmol，R1：50-100pmol，10pfu DNA聚合酶buffer：5±0.1μ1，dNTP：各32-40pmol，pfu DNA聚合酶：2-5U，无菌水补足50μl；

PCR反应条件：将上述PCR体系混匀，第一阶段94-95℃预变性2-5min；第二阶段94-95℃，30-50S；54-56℃，30-40S；70-72℃，30-40S，共进行30-35个循环；第三阶段70-72℃延伸4-7min。

4.按权利要求2所述的抗菌肽基因的制备方法，其特征在于：所述步骤c)中聚合酶链式反应的PCR体系：

模板：0.5-2μl，F2：20-50pmol，R2：20-50pmol，10pfu DNA聚合酶buffer：5±0.1μl，dNTP：各32-40pmol，pfu DNA聚合酶：2-5U，无菌水补足50μl；

PCR反应条件：将上述PCR体系混匀，第一阶段94-95℃预变性2-5min；第二阶段94-95℃，30-50S；56-59℃，30-40S；70-72℃，30-40S，共进行30-35个循环；第三阶段70-72℃延伸5-7min。

5.一种按权利要求1所述的抗菌肽基因在毕赤酵母载体中的表达质粒的构建，其特征在于：

a.取0.8-1.0μg所述的抗菌肽Shiva-1的DNA和毕赤酵母载体pPICZα A分别在37±2℃进行Xba I和EcoR I的双酶切2-6小时，备用；

b.按摩尔比计取步骤a)双酶切后所得的pPICZ α和AShiva-1的DNA序列，pPICZ α和AShiva-1的DNA序列摩尔数之比＝1：3-9，而后将其在16±4℃下置于10-15μl的连接体系中，连接8-12小时；

其中，连接反应体系为：10×T4DNA连接酶buffer 1±0.1μl，T4 DNA连接酶3-350U，余量为ddH₂O；

c.将冷冻保藏的大肠杆菌DH5 α感受态细胞取出后置于冰浴中，取80-200μ1感受态细胞并加入10-15μl上述连接后的连接产物，继续在冰水浴中放置25-35分钟，然后置于42±0.5℃水浴中热激60-90秒，再置于冰水浴中2-5分钟，将冰浴后产物加入400-900μl的液体SOC培养基，在37±2℃摇床中160-200rpm培养0.5-1小时，然后将培养0.5-1小时之后的培养物均匀涂在含有25-30μg/ml的Zeocin的LLB平板固体培养基上，在37±2℃培养箱倒置培养12-20小时，备用；

d.将步骤c)培养后长出的单菌落挑取再接种到含有25-30μg/ml的Zeocin的LLB平板培养基，在37±2℃培养箱倒置培养12-20小时，备用；

e.挑取步骤d)中培养的单菌落于20-50μl无菌水中，98-100℃煮沸5-10分钟，然后置于冰浴中2-5分钟，再1000-12000rpm离心1-5分钟，收集上清，取0.5±0.2μl作为模板，用引物F3和R3或F1和R3进行PCR检验目的序列是否已经克隆到大肠杆菌DH5 α中，

引物为：F3：5′gCggAATTCAAAAgAAgATg 3′

        R3：5′gCgTCTAgATTAACCAACAg 3′

        F1：5′TgTTCAgAAgAATCgACAgAgTTggTAAgCAAATTAAgCAAggTATCC 3′；

f.将步骤e)菌落PCR扩增验证得到的阳性克隆菌株，接种于10ml的含有25-30μg/ml的Zeocin的LLB液体培养基中，37±2℃ 180-220rpm培养8-12个小时，取3-5ml培养后的菌液，4000-6000rpm离心4-5min收集菌体，而后用试剂盒提取质粒，提取的质粒经在37±1℃进行Xba I和EcoR I的双酶切4-6小时并电泳验证正确，即得到了构建的重组质粒pPICZ α A-Shiva。

6.按权利要求5所述的抗菌肽基因在毕赤酵母载体中的表达质粒的构建，其特征在于：所述步骤a、f所述的双酶切为：将待酶切的物质在Xba I的20±1μl酶切体系37±0.5℃下酶切4±2小时，然后向该体系中补加1mol/L的NaCl溶液1.3±0.3μL和pH7.5的1mol/L的Tris-HCl溶液1±0.1μl，进行Xba I酶切；而后加入EcoR I 1±0.2μl，继续置于37±0.5℃酶切2±0.5小时，得双酶切产物。

7.按权利要求6所述的抗菌肽基因在毕赤酵母载体中的表达质粒的构建，其特征在于：所述20±1μl Xba I的酶切为：待酶切的DNA序列0.8-1.1μg，质量百分比为0.1％的BSA 2±0.1μl，10×M buffer 2±0.1μl，Xba I 5-10U，余量为无菌水。

8.按权利要求5所述的抗菌肽基因在毕赤酵母载体中的表达质粒的构建，其特征在于：所述步骤e)中PCR体系：模板：0.5-1μl，F3或F1：10-30pmol，R3：10-30pmol，10×pfu DNA聚合酶buffer：2.5±0.1μl，dNTP：各16-20pmol，pfu DNA聚合酶：1-2U，用无菌水补足至25μl。

PCR反应条件：将上述PCR体系混匀，第一阶段94-95℃预变性4-5min，第二阶段94-95℃，30-40S；54-56℃，30-40S；70-72℃，30-40S，共进行30-35个循环；第三阶段70-72℃延伸4-7min。

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