CN1330758C - 抗真菌多肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新型抗真菌多肽及其制备方法，该重组抗真菌多肽含有可形成离子通道大肠菌素的离子通道结构域，以及白色念珠菌信息素。本发明的新型抗真菌多肽相较于现用抗真菌药物的优点在于，其直接在真菌细胞膜上形成离子通道来杀伤真菌，因此杀伤效率强于现用抗真菌药物数十倍；由于真菌难以通过突变一表达方式来修补该多肽在其胞膜上造成的几何损伤，因此该多肽不会诱导真菌产生传统的耐药性；由于该多肽对真菌是靶向性杀伤，因此它无现用抗真菌药物的毒副作用。

Description

抗真菌多肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种重组的抗真菌多肽的基因、重组质粒、多肽及其制备方法。
背景技术
深部真菌感染的常见治病菌为白色念珠菌，新型隐球菌和荚膜组织胞浆菌等，主要侵犯深部组织和内脏器官，危害性极大。随着广谱抗菌药物，免疫抑制剂，肾上腺皮质激素等的滥用和病毒性疾病尤其是爱滋病日益猖獗的传播，以往认为发生率较低的深部真菌感染发病率直线上升。
现用抗菌药物对真菌感染基本无效；真菌属真核细胞，它和人体细胞的相似性使得现用抗真菌药物如两性霉素和咪唑类抗真菌药在杀伤真菌细胞的同时也杀伤人体细胞，这就造成这类药物的疗效不够理想且毒副作用太大，因此人类一直在致力于开发高效且使用安全的抗真菌药物。
近年来真菌基础研究取得很大的进展，已确定某些真菌如白色念珠菌信息素的氨基酸序列，是13个氨基酸残基组成的多肽。它可以在生活介质中自由游动，具有自动寻找同种真菌细胞胞膜上相应受体的生物学活性。因此可以利用真菌信息素的这种自动寻找活性来诱导大肠菌素通道结构域到达这些真菌的细胞膜上形成离子通道来杀伤这些真菌。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种新型的重组抗真菌多肽的基因、重组质粒、多肽；此种多肽能特异的杀灭致病真菌细胞而不会伤害人体正常细胞。本发明的再一目的是提供上述重组抗真菌多肽的制备方法。
本发明的技术方案如下：
本发明所述抗真菌多肽的基因，含有编码大肠菌素离子通道结构域的基因，以及编码白色念珠菌信息素的基因。将编码白色念珠菌信息素的基因与大肠菌素离子通道结构域基因可操作地连接，从而获得表达重组抗真菌多肽的核苷酸序列。编码白色念珠菌信息素的基因为序列表中SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列。大肠菌素离子通道结构域可选自能形成离子通道的大肠菌素E1，Ia，Ib，A，B和N，在本发明的一个优选实施例中，将上述白色念珠菌信息素基因与大肠菌素Ia离子通道结构域(SEQ ID NO.1)的羧基端基因连接而形成如序列表中SEQ ID NO.4所述的核苷酸序列。在本发明的另一个优选实施例中，将上述白色念珠菌信息素基因与大肠菌素Ia离子通道结构域(SEQ ID NO.1)的氨基端基因连接而形成如序列表中SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列。
本发明所述重组质粒，是将如上所述的编码白色念珠菌信息素的核苷酸序列经双链寡聚核苷酸点突变技术插入大肠菌素离子通道结构域的羧基端或氨基端形成本发明的重组质粒。若选用大肠菌素Ia，则将编码白色念珠菌信息素的核苷酸序列插入Ia通道结构域基因的第626位氨基酸后(羧基端)或第451位氨基酸前(氨基端)而形成本发明的诸重组质粒。构建重组质粒的原始商用质粒pET-15b来自于Novagen公司，其中装载了大肠菌素Ia通道结构域和相应的Immunity蛋白基因，针对白色念珠菌信息素基因设计了数对引物，其序列见实施例1。利用双链寡聚核苷酸点突变技术，按照Strategene公司药箱操作获得重组质粒。
本发明的又一方面，提供本发明所述抗真菌多肽的制备方法，将编码白色念珠菌信息素的基因可操作地与大肠菌素基因连接获得编码重组抗真菌多肽基因的重组质粒，将获得的重组质粒转染入大肠杆菌工程菌中而获得可产生重组抗真菌多肽的工程菌细胞。用Ni Sepharose High Performance柱分离纯化即获得本发明所述的抗真菌多肽。
本发明所述抗真菌多肽可在制备治疗或预防真菌感染的药中应用。可以通过将本发明中的多肽添加药学上可接受的载体或赋形剂或可选的其它成分而制成适于临床使用的药物组合物。其机理是：多肽中可与靶真菌细胞表面受体结合的白色念珠菌信息素诱导大肠菌素离子通道结构域到达靶真菌细胞膜附近，然后大肠菌素离子通道结构域的疏水区段插入靶真菌细胞膜中，进而大肠菌素离子通道结构域在靶真菌细胞膜上形成离子通道，使靶真菌细胞内容物泄漏而致真菌细胞死亡，从而达到杀死真菌细胞的目的。
本发明所述的抗真菌多肽相较于传统抗真菌药物的优点在于，其具有特异的靶向性，因而在治疗过程中不会攻击人体细胞，其毒性和不良反应远低于传统抗真菌药物。再由于它是在真菌细胞膜上直接形成离子通道来杀伤真菌细胞，因此与传统抗真菌药物相较，真菌细胞对其产生耐药性的概率要低得多；在抗真菌多肽-离子通道造成泄漏而致真菌细胞死亡的这一较短时限内，真菌细胞较难利用突变基因-蛋白表达方式来修复抗真菌多肽-离子通道在真菌细胞膜上造成的几何缺损，所以真菌细胞对本发明的抗真菌多肽产生耐药性的概率较低。需要特别说明的是，在本发明的实施例中体内抗真菌多肽对抗白色念珠菌感染的治疗效果至少是两性霉素B治疗效果的6倍。这证明本发明所述抗真菌多肽具有良好的应用前景。
本发明所述方法可得到理想纯度的抗真菌多肽(大于95％)并最大程度的保存了它的生物活性，而一般CM柱分离纯化的抗真菌多肽纯度较低(约80-90％)。
附图说明
图1是含有白色念珠菌信息素基因和大肠菌素Ia离子通道结构域基因的重组质粒pCHCEBCH1的结构示意图。
图2是含有白色念珠菌信息素基因和大肠菌素Ia离子通道结构域基因的重组质粒pCHCEBCH2的结构示意图。
图3为本发明抗真菌多肽对生长于固体培养基白色念珠菌的抑制试验结果，表明白色念珠菌的生长只能被两性霉素B和抗真菌多肽抑制；图中A对照组，B两性霉素B，C氟康唑，D抗金葡菌多肽，E抗真菌多肽1。
图4为本发明抗真菌多肽对生长于液体培养基白色念珠菌的抑制试验结果，各烧瓶底中菌丝体的数量证实了白色念珠菌的生长只能被两性霉素B和抗真菌多肽抑制；图中A对照组，B两性霉素B，C氟康唑，D抗金葡菌多肽，E抗真菌多肽2，F抗真菌多肽1。
图5为本发明抗真菌多肽对生长于液体培养基白色念珠菌的抑制试验结果，各视野中菌丝体和孢子的数量证实了白色念珠菌的生长只能被两性霉素B和抗真菌多肽抑制；A对照组，B两性霉素B，C氟康唑，D抗金葡菌多肽，E抗真菌多肽2，F抗真菌多肽1。
图6为PI/FITC两重荧光染色图，证实了白色念珠菌已被抗真菌多肽杀死；A对照组，B抗真菌多肽1。
图7为本发明抗真菌多肽1对白色念珠菌感染鼠体内保护试验的鼠存活结果；A抗真菌多肽1，B两性霉素B，C对照组。
图8为经30日抗真菌多肽1处理后的鼠肝、肾、脾的组织切片图；A肝组织切片，B肾组织切片，C脾组织切片，HE染色，100x。
具体实施方式
实施例1表达抗真菌多肽的质粒的构建和重组抗真菌多肽的制备
原始质粒为装载了大肠菌素Ia离子通道结构域和Immunity蛋白基因的pET-15b商用质粒(质粒大小6.3kb，购自Novagen公司，上述基因由本实验室装载)，经双链寡聚核苷酸点突变技术(QuickChangeTM Kit，Strategene公司)将编码白色念珠菌信息素的基因(序列表中SEQ ID NO.2所述核苷酸序列)插入到大肠菌素Ia离子通道结构域基因的1626位点后，制备出了抗真菌多肽的一种重组质粒pCHCCACH1(如图1所示)。重组质粒转染入E.coli BL21(DE3)ply S工程菌里制备多肽，获得序列表中SEQ ID NO.5所述的抗真菌多肽，在继后的实施例中称为“抗真菌多肽1”，其分子量为28,000～30,000。
突变程序按Strategene QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(catalog#200518)药箱手册进行：
1、准备点突变反应物
5ul 10xbuffer
2ul(10ng)野生型大肠菌素Ia质粒
1ul(125ng)设计的5’-3’寡聚核苷酸引物
1ul(125ng)设计的3’-5’寡聚核苷酸引物
1ul dNTP
双蒸水50ul
1ul pfu
(除质粒，引物和双蒸水外，均为药箱所备试剂)
2、进行PCR扩增，扩增条件：变性95℃，35秒，退火53℃，70秒，延伸68℃，17分共20个循环；
3、加入Dpnl内切酶1ul消化母体DNA链后(37℃，1小时)，取1ul反应物与HMS174感受态细胞50ul冰孵30分钟，行热冲击42℃，45秒，再置入冰中2分钟；
4、加入NZY培基0.5ml后220rpm，37℃摇菌1小时后，取50-100ul反应物铺板(LB培基加1％琼脂加50ug/ml氨苄青霉素，37℃过夜)；
5、18小时后挑菌，循Qiagene，Gibco等公司的各种商用提取质粒药箱提取质粒均可，测序确定突变成功；
6、将质粒50ng与制备的E.coli BL21(DE3)ply工程菌感受态细胞50ul冰孵30分，42℃，90秒热冲击，取50-100ul反应物加入LB培基0.5ml，220rpm，37℃摇菌1小时后铺板(LB培基加1％琼脂加50ug/ml氨苄青霉素)37℃孵育，18小时后挑取菌落；
7、大量增菌，8-16升FB培基，250rpm，37℃，6-8小时；离心沉淀菌体，4℃，6000g，20分钟，取4℃，20mM sodium phosphate，0.5M NaCl，5mM imidazole，2mM EDTA，2mMDTT，pH 7.4)50-80ml悬浮菌体，加入0.2M PMSF 250微升后行超声破碎(4℃，400W，2分钟)，高速离心沉淀破碎菌体(4℃，75000g，1.5小时)，取上清加入硫酸链霉素500万单位沉淀DNA，高速离心后(4℃，30000g，10分钟)取上清装入分子量15,000的透析袋于4℃，50mM硼酸缓冲液4升透析过夜后，高速离心后(4℃，30000g，10分钟)将上清上样于HisTrap柱(Amersham Biosciences)，经20mM sodium phosphate，0.5M imidazole，pH7.4，4℃)线性梯度洗脱后即可得到重组抗肿瘤多肽，经10mM sodium phosphate，0.2M NaCl，2mM EDTA，pH 7.4透析后备用。
下面列出为制备pCHCCACH1质粒的白色念珠菌信息素基因所设计的具体双链寡聚核苷酸序列：
pCHCCACH1
1、5’-3’
gcg aat aag ttc tgg ggt att GGG TTT CGT CTC ACAAAC TTC taa ata aaa tat aag aca ggc
3’-5’
gcc tgt ctt ata ttt tat tta GAA GTT TGT GAG ACG AAA CCC aat acc cca gaa ctt att cgc
2、5’-3’
att ggg ttt cgt ctc aca aac ttc GGA TAC TTT GAG CCC GGC AAA taa ata aaa tat aag aca ggc
3’-5’
gcc tgt ctt ata ttt tat tta TTT GCC GGG CTC AAA GTA TCC gaa gtt tgt gag acg aaa ccc aat
实施例2表达抗真菌多肽的质粒的构建和重组抗真菌多肽的制备
原始质粒为装载了大肠菌素Ia通道结构域和Immunity蛋白基因的pET-15b商用质粒(质粒大小6.3kb，购自Novagen公司，上述基因由本实验室装载)，经双链寡聚核苷酸点突变技术(QuickChangeTM Kit，Strategcne公司)将编码白色念珠菌信息素的基因(序列表中SEQ ID NO.2所述核苷酸序列)插入到大肠菌素Ia离子通道结构域基因的D451位点前，制备出了抗真菌多肽的又一种重组质粒pCHCCACH2(如图2所示)。重组质粒转染入E.coli BL21(DE3)plyS工程菌里制备多肽，获得序列表中SEQ ID NO 7所述的抗真菌多肽，在继后的实施例中称为“抗真菌多肽2”，其分子量为28,000～30,000。
突变程序按Strategene QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(catalog#200518)药箱手册进行：
1、准备点突变反应物
5ul 10xbuffer
2ul(10ng)野生型大肠菌素Ia质粒
1ul(125ng)设计的5’-3’寡聚核苷酸引物
1ul(125ng)设计的3’-5’寡聚核苷酸引物
1ul dNTP
双蒸水50ul
1ul pfu
(除质粒，引物和双蒸水外，均为药箱所备试剂)
2、进行PCR扩增，扩增条件：变性95℃，35秒，退火53℃，70秒，延伸68℃，17分共20个循环；
3、加入Dpnl内切酶1ul消化母体DNA链后(37℃，1小时)，取1ul反应物与HMS174感受态细胞50ul冰孵30分钟，行热冲击42℃，45秒，再置入冰中2分钟；
4、加入NZY培基0.5ml后220rpm，37℃摇菌1小时后，取50-100ul反应物铺板(LB培基加1％琼脂加50ug/ml氨苄青霉素，37℃过夜)；
5、18小时后挑菌，循Qiagene，Gibco等公司的各种商用提取质粒药箱提取质粒均可，测序确定突变成功；
6、将质粒50ng与制备的E.coli BL21(DE3)ply工程菌感受态细胞50ul冰孵30分，42℃，90秒热冲击，取50-100ul反应物加入LB培基0.5ml，220rpm，37℃摇菌1小时后铺板(LB培基加1％琼脂加50ug/ml氨苄青霉素)37℃孵育，18小时后挑取菌落；
7、大量增菌，8-16升FB培基，250rpm，37℃，6-8小时；离心沉淀菌体，4℃，6000g，20分钟，取4℃，20mM sodium phosphate，0.5M NaCl，5mM imidazole，2mM EDTA，2mMDTT，pH 7.4)50-80ml悬浮菌体，加入0.2M PMSF 250微升后行超声破碎(4℃，400W，2分钟)，高速离心沉淀破碎菌体(4℃，75000g，1.5小时)，取上清加入硫酸链霉素500万单位沉淀DNA，高速离心后(4℃，30000g，10分钟)取上清装入分子量15,000的透析袋子4℃，50mM硼酸缓冲液4升透析过夜后，高速离心后(4℃，30000g，10分钟)将上清上样于HisTrap柱(Amersham Biosciences)，经20mM sodium phosphate，0.5M imidazole，pH7.4，4℃)线性梯度洗脱后即可得到重组抗肿瘤多肽，经10mM sodium phosphate，0.2M NaCl，2mM EDTA，pH 7.4透析后备用。
制备pCHCCACH2质粒的白色念珠菌信息素基因的双链寡聚核苷酸序列按实施例1的方法设计。
实施例3抗真菌多肽对白色念珠菌的体外抑制试验结果
真菌为美国标准菌株，ATCC10231白色念珠菌(Candida albicans)，取菌液5微升(108CFU/ml级菌量)均匀涂布于沙博氏固体培基(杭州微生物试剂厂)表面，再放置吸取50μl各处理液的纸片于培基表面，分别为对照组，0.2M NaCl+50mM硼酸缓冲液，抗真菌多肽1组，5μg/ml，两性霉素B组，1μg/ml，氟康唑组，3μg/ml，抗金葡菌多肽组，5μg/ml，置于35℃培养两日，结果如图3所示。结果显示只有抗真菌多肽1组纸片周围出现了完整的溶菌环，因此在该试验中，所试白色念珠菌的生长只能被抗真菌多肽1抑制。两性霉素B组纸片7-9点钟方向似乎也有一些溶菌区域。
真菌为美国标准菌株，ATCC10231白色念珠菌(Candida albicans)，菌液5微升(108CFU/ml级菌量)加入MH肉汤培养液(MH肉汤，上海伯奥生物科技有限公司)10ml中，共准备6组，第一组加入0.2M NaCl+50mM硼酸缓冲液(量与实验组中加入的各药物量相同)作为对照，第二组加入10μg/ml抗真菌多肽1，第三组加入10μg/ml抗真菌多肽2，第四组加入2μg/ml两性霉素B，第五组加入6μg/ml氟康唑，第六组加入10μg/ml抗金葡菌多肽。上述各组液体置于100ml三角烧瓶中，200rpm，35℃生长，每小时采样100μl加入96孔酶标板中经分光广度计(A 595nm)比色测试真菌生长速度，画出真菌生长曲线来比较各组的抑菌效力；真菌生长36小时后，烧瓶底部开始沉淀大量菌丝体，其量的多少与菌的生长速度和量是完全一致的。因此只需比较各处理组烧瓶底部的菌丝体量，就可以非常简便有效的观察各处理组的抑菌效果。抑菌效果请见图4。抗真菌多肽1组和两性霉素B菌液中菌丝体数量最少，氟康唑和抗真菌多肽2组菌液中菌丝体数量次之，对照组和抗金葡菌多肽组菌液中菌丝体数量多出上述各组数倍。
取上述生长于液体培养基白色念珠菌的抑制试验所获得的各处理组菌液(生长12小时后)2μl放置于玻片上，光镜400x观察。对照组和抗金葡菌多肽组菌液中存在大量真菌孢子及菌丝体，氟康唑和抗真菌多肽2组菌液中真菌孢子及菌丝体数量比上两组大为减少；而两性霉素B和抗真菌多肽1处理组菌液中仅见极少量真菌孢子，无菌丝体，如图5所示。
取上述生长于液体培养基白色念珠菌的抑制试验所获得的对照组和抗真菌多肽1组菌液(生长24小时后)2μl放置于玻片上，经PI/FITC两重荧光染色后，荧光显微镜400x观察。观察结果如图6所示。真菌细胞被抗真菌多肽杀伤后膜通透性变大，PI染料进入真菌细胞内，与胞内DNA结合发出红色荧光。因此，正常真菌细胞被FITC染为绿色，而被抗真菌多肽杀伤后被PI染为红色。该结果显示与抗真菌多肽一起孵育24小时后，绝大部分真菌细胞已被杀伤。
上述结果证明，抗真菌多肽1具有优于现用抗真菌药物的效力，抗真菌多肽2具有与现用抗真菌药物大致相当的效力。
实施例4抗真菌多肽对白色念珠菌感染兔体内保护试验
1、实验材料
(1)药物
抗真菌多肽1(5mg/kg/日)，两性霉素B(1mg/kg/日)和磷酸缓冲液(对照)。
(2)真菌
ATCC10231白色念珠菌
2、实验方法
昆明小鼠30只，雌雄各半，体重18-22克，随机分组，腹腔注射ATCC10231白色念珠菌(108 CFU/ml级菌量)0.5ml，其中抗真菌多肽1和两性霉素B试验组分别为每组小鼠10只，对照组每组小鼠10只。腹腔注射致死剂量的真菌后，各药物试验组小鼠自腹腔每日注射药物一次，每24小时观察结果，连续14天，以小鼠死亡为阳性结果。
3、结果
结果显示，抗真菌多肽1组小鼠存活率在3个剂量组中与两性霉素B组小鼠存活率始终保持了恒定的差距，因此在体内试验中抗真菌多肽对抗白色念珠菌感染的治疗效果优于两性霉素B。附图7显示了试验鼠的存活情况。
抗真菌多肽的分子量(MW 30,000)是两性霉素B分子量(MW 920)的30倍左右，因此，若按相同药物分子数量进行比较，在本实施例中本发明的抗真菌多肽对抗白色念珠菌感染的治疗效果至少是两性霉素B治疗效果的6倍。对照组于6天内全部死亡。
实施例5抗真菌多肽体内毒性试验
昆明小鼠10只，雌雄各半，体重18-22克，腹腔每日注射10mg/kg抗真菌多肽共20日，所有小鼠均存活，体重增加，处死后取肝，肾，和脾等切片观察，未见形态学异常，详情请见附图8。该结果说明抗真菌多肽无现用抗真菌药物的毒副作用。
序列表
<110>四川大学
<120>抗真菌多肽及其制备方法
<160>7
<170>PatentIn Version 3.2
<210>1
<211>528
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<220>
<221>misc feature
<222>(1)......(528)
<223>大肠菌素Ia离子通道结构域基因
<400>1
gacgcaatta atttcacaac agagttcctg aaatcagttt cagaaaaata tggtgcaaaa   60
gctgagcagt tagccagaga gatggccggg caggctaaag ggaagaaaat acgtaatgtt   120
gaagaggcat taaaaacgta tgaaaagtac cgggctgaca ttaacaaaaa aattaatgca   180
aaagatcgtg cagcgattgc cgcagccctt gagtctgtga agctgtctga tatatcgtct   240
aatctgaaca gattcagtcg gggactggga tatgcaggaa aatttacaag tcttgctgac   300
tggatcactg agtttggtaa ggctgtccgg acagagaact ggcgtcctct ttttgttaaa   360
acagaaacca tcatagcagg caatgccgca acggctcttg tggcactggt cttcagtatt   420
cttaccggaa gcgctttagg cattatcggg tatggtttac tgatggctgt caccggtgcg   480
ctgattgatg aatcgcttgt ggaaaaagcg aataagttct ggggtatt                528
<210>2
<211>42
<212>DNA
<213>
<220>
<222>(1)......(42)
<223>白色念珠菌信息素基因
<400>2
gggtttcgtc tcacaaactt  cggatacttt  gagcccggca  aa
<210>3
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<223>白色念珠菌信息素氨基酸序列
<400>3
Gly Phe Arg Leu Tyr Asn Phe Gly Tyr Phe Glu Pro Gly Lys
1                5                   10
<210>4
<211>570
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)......(570)
<223>编码抗真菌多肽1核苷酸序列
<400>4
gacgcaatta atttcacaac agagttcctg aaatcagttt cagaaaaata tggtgcaaaa  60
gctgagcagt tagccagaga gatggccggg caggctaaag ggaagaaaat acgtaatgtt  120
gaagaggcat taaaaacgta tgaaaagtac cgggctgaca ttaacaaaaa aattaatgca  180
aaagatcgtg cagcgattgc cgcagccctt gagtctgtga agctgtctga tatatcgtct  240
aatctgaaca gattcagtcg gggactggga tatgcaggaa aatttacaag tcttgctgac  300
tggatcactg agtttggtaa ggctgtccgg acagagaact ggcgtcctct ttttgttaaa  360
acagaaacca tcatagcagg caatgccgca acggctcttg tggcactggt cttcagtatt  420
cttaccggaa gcgctttagg cattatcggg tatggtttac tgatggctgt caccggtgcg  480
ctgattgatg aatcgcttgt ggaaaaagcg aataagttct ggggtattgg gtttcgtctc  540
acaaacttcg gatactttga gcccggcaaa                                   570
<210>5
<211>190
<212>PRT
<213>人工序列
<223>编码抗真菌多肽1氨基酸序列
<400>5
Asp Ala Ile Asn Phe Thr Thr Glu Phe Leu Lys Ser Val Ser Glu
1                5                  10                  15
Lys Tyr Gly Ala Lys Ala Glu Gln Leu Ala Arg Glu Met Ala Gly
                 20                 25                 30
Gln Ala Lys Gly Lys Lys Ile Arg Asn Val Glu Glu Ala Leu Lys
                 35                 40                  45
Thr Tyr Glu Lys Tyr Arg Ala Asp Ile Asn Lys Lys Ile Asn Ala
                 50                 55                  60
Lys Asp Ala Ala Ala Ile Ala Ala Ala Leu Glu Ser Val Lys Leu
                65                  70                  75
Ser Asp Ile Ser Ser Asn Leu Asn Arg Phe Ser Arg Gly Leu Gly
                80                 85                  90
Tyr Ala Gly Lys Phe Thr Ser Leu Ala Asp Trp Ile Thr Glu Phe
                 95                 100                 105
Gly Lys Ala Val Arg Thr Glu Asn Trp Arg Pro Leu Phe Val Lys
                110                 115                120
Thr Glu Thr Ile Ile Ala Gly Asn Ala Ala Thr Ala Lue Val Ala
                125                130                 135
Leu Val Phe Ser Ile Leu Thr Gly Ser Ala Leu Gly Ile Ile Gly
                140                145                  150
Tyr Gly Leu Leu Met Ala Val Thr Gly Ala Leu Ile Asp Glu Ser
                155                160                  165
Leu Val Glu Lys Ala Asn Lys Phe Trp Gly Ile Gly Phe Arg Leu
                170                 175                 180
Tyr Asn Phe Gly Tyr Phe Glu Pro Gly Lys
                185                 190
<210>6
<211>570
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1).....(570)
<223>编码抗真菌多肽2核苷酸序列
<400>6
gggtttcgtc tcacaaactt cggatacttt gagcccggca aagacgcaat taatttcaca    60
acagagttcc tgaaatcagt ttcagaaaaa tatggtgcaa aagctgagca gttagccaga    120
gagatggccg ggcaggctaa agggaagaaa atacgtaatg ttgaagaggc attaaaaacg    180
tatgaaaagt accgggctga cattaacaaa aaaattaatg caaaagatcg tgcagcgatt    240
gccgcagccc ttgagtctgt gaagctgtct gatatatcgt ctaatctgaa cagattcagt    300
cggggactgg gatatgcagg aaaatttaca agtcttgctg actggatcac tgagtttggt  360
aaggctgtcc ggacagagaa ctggcgtcct ctttttgtta aaacagaaac catcatagca  420
ggcaatgccg caacggctct tgtggcactg gtcttcagta ttcttaccgg aagcgcttta  480
ggcattatcg ggtatggttt actgatggct gtcaccggtg cgctgattga tgaatcgctt  540
gtggaaaaag cgaataagtt ctggggtatt                                   570
<210>7
<211>190
<212>PRT
<213>人工序列
<223>编码抗真菌多肽2氨基酸序列
<400>7
Gly Phe Arg Leu Tyr Asn Phe Gly Tyr Phe Glu Pro Gly Lys Asp
1               5                  10                  15
Ala Ile Asn Phe Thr Thr Glu Phe Leu Lys Ser Val Ser Glu Lys
                20                 25                  30
Tyr Gly Ala Lys Ala Glu Gln Leu Ala Arg Glu Met Ala Gly Gln
                35                  40                 45
Ala Lys Gly Lys Lys Ile Arg Asn Val Glu Glu Ala Leu Lys Thr
                50                 55                  60
Tyr Glu Lys Tyr Arg Ala Asp Ile Asn Lys Lys Ile Asn Ala Lys
                65                  70                 75
Asp Arg Ala Ala Ile Ala Ala Ala Leu Glu Ser Val Lys Leu Ser
                80                 85                  90
Asp Ile Ser Ser Asn Leu Asn Arg Phe Ser Arg Gly Leu Gly Tyr
                 95                100                 105
Ala Gly Lys Phe Thr Ser Leu Ala Asp Trp Ile Thr Glu Phe Gly
                110                115                  120
Lys Ala Val Arg Thr Glu Asn Trp Arg Pro Leu Phe Val Lys Thr
                125                130                 135
Glu Thr Ile Ile Ala Gly Asn Ala Ala Thr Ala Lue Val Ala Leu
                140                145                 150
Val Phe Ser Ile Leu Thr Gly Ser Ala Leu Gly Ile Ile Gly Tyr
                 155                160                165
Gly Leu Leu Met Ala Val Thr Gly Ala Leu Ile Asp Glu Ser Leu
                170                 175                 180
Val Glu Lys Ala Asn Lys Phe Trp Gly Ile
                185                190

Claims (9)

1、一种编码抗真菌多肽的基因，其特征在于该基因由编码白色念珠菌信息素的基因与编码大肠菌素离子通道结构域的基因连接而成，编码大肠菌素离子通道结构域的基因选自编码能形成离子通道的大肠菌素E1或Ia或Ib或A或B或N的基因。
2、根据权利要求1所述的抗真菌多肽的基因，其特征在于它具有序列表中SEQ IDNO.4所述的核苷酸序列。
3、根据权利要求1所述的抗真菌多肽的基因，其特征在于它具有序列表中SEQ IDNO.6所述的核苷酸序列。
4、一种抗真菌多肽的重组质粒，其特征在于它含有权利要求1或2或3所述的基因。
5、一种抗真菌多肽，其特征在于它由权利要求4所述的重组质粒表达而成。
6、根据权利要求5所述的抗真菌多肽，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.5所述的氨基酸序列，其分子量为28,000-30,000。
7、根据权利要求5所述的抗真菌多肽，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.7所述的氨基酸序列，其分子量为28,000-30,000。
8、权利要求5或6或7所述抗真菌多肽在制备治疗或预防真菌感染的药物中的应用。
9、一种权利要求5或6或7所述抗真菌多肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
将白色念珠菌信息素的基因与编码大肠菌素E1或Ia或Ib或A或B或N离子通道结构域的基因连接获得编码重组抗真菌多肽的基因，将获得的基因导入到表达系统中进行表达，分离表达的多肽而获得抗真菌多肽。
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