CN101899104B

CN101899104B - 一种鲨鱼软骨血管生成抑制因子小分子多肽及其生产纯化方法和应用

Info

Publication number: CN101899104B
Application number: CN2010101915090A
Authority: CN
Inventors: 谢秋玲; 陈小佳; 梁旭方; 洪岸
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University; University of Jinan
Priority date: 2010-05-28
Filing date: 2010-05-28
Publication date: 2012-04-18
Anticipated expiration: 2030-05-28
Also published as: CN101899104A

Abstract

本发明公开了一种鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽及其生产纯化方法和应用。本发明鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码该小分子多肽的DNA序列如SEQ ID NO：2所示。本发明鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽可以抑制血管和血管内皮细胞的生成或生长，还可抑制肿瘤细胞的增殖，可用于制备抑制血管生成或生长相关药物，或用于制备抗肿瘤药物。

Description

一种鲨鱼软骨血管生成抑制因子小分子多肽及其生产纯化方法和应用

技术领域

本发明涉及小分子肽领域，具体涉及一种鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽及其生产纯化方法和应用。

背景技术

鲨鱼是极少患恶性肿瘤的海洋动物之一，其发病率为百万分之一。美国科学家Luer将高剂量的强致癌剂黄曲霉素B1注射到鲨鱼体内，也不能诱发鲨鱼患癌症。给鲨鱼接种癌细胞也不能诱发癌症。这提示鲨鱼体内具有独特的抗肿瘤机制(贺丽虹1，黄建华2，沈颂东等，海洋科学/2005年/第29卷/第11期：63-66)。

多年来，世界各国的研究人员多是对鲨鱼软骨组织进行了研究，从中分离提取了多种具有肿瘤抑制作用，尤其是抑制肿瘤新生血管生长的多种物质，如Lee等(Lee A，Langer R.Shark cartilage contains inhibitors of tumor angiogenesis)首次从一条姥鲨的鳍和脊椎软骨中分离提取了一种强烈抑制实体瘤新生血管生成的活性蛋白质。

这类从鲨鱼软骨中提取的具有血管生成抑制活性的蛋白质称之为鲨鱼血管生成抑制因子(Shark Cartilage Angiogenesis Inhibiting Factor，SCAIF)。Sheu等(Sheu JR，FuCC，Tsai ML，et al.Effect of U-995，a patent shark cartilage-derived angiogenesis inhibitor，on anti-angiogenesis and antitumor activities[J].Anticancer Res，1998，18(6A)：4435)从蓝鲨软骨中分离纯化了由两条多肽组成的新血管生成抑制因子U-995，可显著抑制人脐静脉内皮细胞的增殖与迁移，并会引起新血管的中断和破裂，阻止破坏由肿瘤坏死因子TNF-α诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成，防止由胶原酶诱导的胶原溶解。

目前，从各种鲨鱼软骨中分离提取的物质纯度不等，相对分子量大小不一，理化性质和生物学活性不尽相同的蛋白质和多糖类物质。更有人直接将鲨鱼软骨粉作为口服药物，如1997年，加拿大批准鲨鱼软骨口服液AE2941/Neovastat进入III期临床试验，它是至今进入III期临床试验为数不多的抗血管生成药物之一。

发明内容

本发明的目的在于根据现有技术中，从鲨鱼组织中分离提取的物质纯度不等，分子量较大不容易被细胞吸收的问题，提供一种便于吸收的鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽。

本发明另一目的在于提供一种编码上述小分子多肽的DNA序列。

本发明另一目的在于提供一种含有编码小分子多肽的DNA序列的重组表达载体。

本发明另一目的在于提供一种表达上述小分子多肽的重组微生物。

本发明另一目的在于提供上述小分子多肽的生产纯化方法。

本发明还有一个目的在于提供上述小分子多肽的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

本发明从鲨鱼组织中克隆到一个183个氨基酸的蛋白基因，不同于目前发现的任何一种鲨鱼血管抑制因子。但因为分子量较小的小分子肽更容易被细胞吸收，因此克隆了该蛋白的活性区域，大小为33个氨基酸的小分子肽，该小分子肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

编码所述鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽的DNA序列，其核苷酸序列如 SEQ ID NO：2所示。

小分子多肽多需要进行融合表达，虽然有GST标签等表达体系，但是表达产物切割时多会留有多余氨基酸，因为小分子肽的分子量相对较小，多余的氨基酸可能会影响小分子肽的功能。因而本发明采用了SUMO表达系统，SUMO蛋白酶对SUMO融合表达系统表达的重组蛋白进行切割切除掉SUMO蛋白后，不会在小分子肽上有多余氨基酸残留，因此是融合表达小分子肽的最佳系统。因此本发明采用SUMO与鲨鱼血管抑制因子活性段融合表达，表达后利用SUMO蛋白酶切除SUMO蛋白，获得非融合的小分子肽。

本发明鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽的生产纯化方法，包括如下步骤：

(1)分别以-SUMO和鲨鱼血管抑制因子全长基因序列为模板，设计引物，引物序列如SEQ ID NO：12～15所示；通过PCR扩增，得到两段基因序列，将两段基因连接在一起，经酶切后与表达载体pET3C连接，得到重组表达载体；

(2)将重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，挑取单克隆接种到培养基中，IPTG诱导表达后做电泳，选取表达量高的作为发酵种子；

(3)将表达量高的克隆接种到培养基中发酵，离心所得发酵菌体，收集细胞、破碎、离心后得到上清，用Ni-NTA柱进行纯化，得到含有SUMO标签的鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽；

(4)将表达量高的克隆接种到培养基中发酵，离心所得发酵菌体，收集细胞、破碎、离心后得到上清，用Ni-NTA柱进行纯化，得到含有SUMO标签的鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽；在含有SUMO标签的鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽加入SUMO酶，SUMO酶与小分子多肽的体积比为1∶100，得到鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽。

体外细胞学实验证明：本发明的鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽具有抑制血管内皮细胞和两种肿瘤细胞生殖的作用，同时该小分子肽还可以抑制鸡胚尿囊膜血管的生长。

体内实验证明：本发明的鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽可以抑制小鼠肿瘤的生长。

因此本发明的鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽可用于制备抑制血管内皮细胞的相关药物，或者用于制备抗肿瘤药物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供一种鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽，该小分子肽只含有33个氨基酸，因此体积小，易于细胞吸收，有利于融合蛋白表达，而且利于人工合成，成本低；

(2)本发明的鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽经体外和在体实验证明，具有抑制血管内皮细胞和两种肿瘤细胞生殖的作用，还可以抑制鸡胚尿囊膜血管的生长，以及抑制小鼠肿瘤的生长，因此可制备成相关药物，具有广阔的药用价值；

(3)本发明采用将待表达基因与SUMO基因相结合，从而获得可溶性蛋白的高效表达，而且SUMO片断连接了6个His，也便于纯化，纯化后的蛋白通过SUMO酶的酶切，可以获得目的蛋白。

附图说明

图1为鲨鱼血管生成抑制因子全长cDNA全序列的PCR电泳图；其中，1为PCR扩增产物，M为DNA Marker；通过PCR获得了鲨鱼血管生成抑制因子SAIFcDNA，为692bp。

图2为利用PCR获得融合蛋白SUMO-SAIF基因；其中，M为DNAMarker；1为融合蛋白基因，经PCR，获得了一条约430bp的条带，与融合蛋白SUMO-SAIF基因的大小相符。

图3为重组质粒pET3C/SUMO-aSAIF酶切鉴定电泳图；其中，1，2为DNAMarker；3，4，5分别为挑选克隆。经BamH I、Nde I双酶切后，三个克隆中有两个获得了430bp大小的条带，证明其为阳性克隆。

图4融合蛋白表达SDS-PAGE电泳图；其中1和2为诱导组，3为对照组，未诱导，4为上清，即菌体破碎离心后上清；5为沉淀，即菌体破碎离心后沉淀；电泳显示，与为诱导组相比，工程菌经诱导后在20kDa处有一条明显的蛋白条带，说明，重组融合蛋白获得表达。经破碎离心后，在上清中有同样大小的条带，而沉淀中则含量极小，说明该融合蛋白是以可溶性蛋白的形式存在的。

图5为含有SUMO标签的重组融合蛋白的纯化电泳图；其中，M为蛋白Marker；1为纯化后的融合蛋白；融合蛋白经Ni柱亲和层析后，收集洗脱峰进行电泳，获得纯度大于90％的融合蛋白。

图6为SUMO蛋白酶酶切含有SUMO标签的重组融合蛋白的电泳图；其中，1为SUMO酶切后的蛋白；M为蛋白Marker；约20kDa大小的融合蛋白经SUMO酶切后获得了16kDa大小的SUMO蛋白和4kDa大小的非融合鲨鱼血管抑制因子小分子肽；

图7为非融合蛋白纯化电泳图；其中，1为非融合蛋白；M为蛋白质Marker；酶切液经过Ni柱二次纯化，带有His标签的SUMO蛋白与Ni柱结合，而小分子肽则随透过峰流出，收集透过峰进行电泳，显示获得纯度约90％的非融合小分子肽aSAIF；

图8为本发明小分子肽抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成结果图；分设对照组(1～3)和用药组(4～6)，每组各3个平行样；与对照组相比较，给药组的鸡胚尿囊膜的血管密度明显降低。

图9为本发明小分子肽抑制肿瘤体积生长结果曲线图；1)阴性对照组(生理盐水组)：8只，给0.9％的Nacl溶液，每只每天加0.1ml；2)阳性对照组(环磷酰胺)：8只，按文献给药浓度为20mg/kg，每只每天加0.1ml。3)给药组：8只，按文献给药浓度为5mg/kg，每只每天加0.1ml；结果显示，用药组的肿瘤体积明显低于对照组，其结果与阳性对照组没有明显差异；

图10为本发明小分子肽抑制肿瘤重量增加结果曲线图；1)阴性对照组(生理盐水组)：8只，给0.9％的Nacl溶液，每只每天加0.1ml；2)阳性对照组(环磷酰胺)：8只，按文献给药浓度为20mg/kg，每只每天加0.1ml；3)给药组：8只，按文献给药浓度为5mg/kg，每只每天加0.1ml；结果显示，用药组的肿瘤重量明显低于对照组，其结果与阳性对照组没有明显差异。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。

本发明首先通过基因克隆技术，从条纹斑竹鲨软骨组织中制备得到鲨鱼血管生成抑制因子的全长cDNA序列，及其编码氨基酸序列，然后通过对该氨基酸进行分析，并结合文献检索，从而确定氨基酸上第91～123区域的33个氨基酸所构成的小分子多肽，可能为蛋白的活性区域。接着本发明将该33个氨基酸组成的小分子肽进行融合蛋白表达，并对表达蛋白进行活性鉴定，最后证实该小分子肽确实具有很好的抑制血管内皮细胞和肿瘤细胞生殖的作用，具体试验过程如各实施例所示。

实施例1鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽的获得

1.1总RNA提取和cDNA第一链的合成

从条纹斑竹鲨软骨组织中提取总RNA：提取与纯化按照Promega公司的SVTotal RNA Isolation System试剂盒的说明书操作进行。

cDNA第一链的合成使用TaKaRa RNA LA PCR TM Kit(AMV)试剂盒，以上述条纹斑竹鲨软骨组织总RNA为模板，oligo(dT)18为反转录引物，操作按试剂盒推荐方法进行。-20℃保存备用。

1.1.1.引物设计

根据现有已知的SCAIF序列，通过分析判断SCAIF序列的保守区域，设计引物，序列如SEQ ID NO：4～9所示。

1.1.2PCR扩增

PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min，94℃ 60s，40℃60s，72℃60s，共30个循环，最后72℃延伸5min。

PCR扩增体系为

PCR Buffer 4

dNTP 2

rTaq酶 0.2

质粒 2

F 2

R 2

ddH2O 7.8

20μl

PCR扩增结果如图1所示，从图中可以看出，PCR扩增得到大约700bp的产物(箭头所指位置)。

将PCR产物采用常规的切胶回收、纯化、T载体连接、转化感受态细胞、检测阳性克隆等本领域技术人员的常用技术，将所得阳性克隆送交测序。

测序结果显示PCR扩增得到一条长692bp的序列，通过对该序列进行分析以及生物学亲缘鉴定，发现其氨基酸序列与现有的SCAIF序列具有很高的同源性，其中与狗鲨中克隆到的基因有85.2％的同源性，与人和斑马鱼的相关基因的同源性分别为68.9％和62.3％。该基因序列不同于任何一种已知的SCAIF序列，由此证明本实施例得到一条新的鲨鱼血管生成抑制因子的全长序列，长度为692bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。

对上述SEQ ID NO：10所示核苷酸序列进行分析，结果表明该序列编码183个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。

1.2小分子肽的基因获得

对SEQ ID NO：11所示氨基酸序列进行分析，并结合相关文献检索，确定该氨基酸序列上第91～123区域的33个氨基酸所构成的小分子肽为蛋白的活性区域，编码该小分子肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，该小分子肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例2融合表达载体的构建、表达和纯化

1.含有SUMO标签的融合表达载体的构建

本实施例构建含有SUMO基因以及SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的融合表达载体，具体操作如下所示：

以pET3C-SUMO以及实例1所获得的鲨鱼血管抑制因子全长基因SEQ ID NO：10为模板，采用引物F1、R1、F2、R2，通过PCR扩增得到432bp的目的片段。

引物F1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；

引物R1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；

引物F2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示；

引物R2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示；

PCR扩增反应条件为：94℃预变性3min，94℃ 60s，40℃60s，72℃60s，共30个循环，最后72℃延伸5min。

PCR扩增体系为

PCR Buffer 4

dNTP 2

rTaq酶 0.2

质粒 2

Fw 2

Rv 2

ddH2O 7.8

20μl

以F1、R1和F2、R2为引物，以SUMO基因和鲨鱼血管抑制因子全长基因为模板分别进行PCR，然后再以F1和R2为引物进行第三次PCR，PCR扩增结果如图2所示，从图中可以看出，PCR扩增得到大约432bp的产物(箭头所指位置)。

将上述PCR扩增产物和大肠杆菌表达载体pET3C分别进行BamH I、Nde I 酶切后连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布平板后，挑取阳性克隆，进行酶切鉴定，酶切鉴定结果图3所示，从图中可以看出，在挑取的三个克隆中，其中两个(3和5)经双酶切后有一个大约430bp的条带，证明是阳性克隆。

将酶切鉴定的阳性克隆送交测序，测序结果证实本实施例已经成功构建融合表达载体pET3C/SUMO-aSCAIF。

2.含有SUMO标签的工程菌的构建与表达

将上述构建成功的融合表达载体pET3C/SUMO-aSCAIF转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，涂布LB(Amp+)平板，挑取单克隆接种到LB培养基中，当OD＝0.6时，加入IPTG诱导表达，诱导3h后收取菌体，进行SDS-PAGE电泳。

SDS-PAGE电泳结果如图4所示，从图中可以看到经诱导后，在20kDa处有一条明显条带，由此说明本实施例成功获得含有SUMO的重组融合蛋白。

挑取表达量高的克隆作为菌种在摇瓶中扩大培养，同样条件下诱导表达，诱导3h后离心收取菌体，经超声波破碎，离心后分别制备上清和沉淀的样品，进行常规SDS-PAGE电泳，电泳鉴定发现该含有SUMO标签的融合蛋白存在于破碎上清中，因此该融合蛋白是以可溶性形式表达的。

3.含有SUMO标签的重组融合蛋白的发酵：

在22L发酵罐中加入10L培养基，培养基中含蛋白胨2％，酵母粉2％，糖蜜0.5％及磷酸缓冲液(Na₂HPO₄ 0.2％，NaH₂PO₄ 0.1％，pH7.0)；37℃培养，接种量10％；溶氧控制在发酵前期低速，中期高速，后期低速；连续流加葡萄糖250g，同时通过流加NaOH或HCl，控制pH变化；IPTG在发酵进行到3hr时加入，同时温度设置在32℃，诱导5hr后放罐。获得菌体32g/L。

4.SUMO标签的去除及纯化

将上述所得发酵菌体进行离心处理，收集细胞，按照1∶8的比例将细胞重悬在破碎缓冲液中(50mM Tris+300mM NaCl PH 7.5)，超声波破碎细胞后离心，取上清，因该融合蛋白含有一个His纯化标签，因此使用Ni-NTA柱进行纯化，纯化的具体操作参照Ni-NTA柱说明书即可。

首先用缓冲液A(20mM磷酸缓冲液+500mM Nacl+30mM咪唑PH7.5)平衡Ni-NTA柱，然后加入样品，再用缓冲液B(20mM磷酸缓冲液+500mM Nacl+30mM咪唑PH7.5)进行清洗，之后用缓冲液C(20mM磷酸缓冲液+500mMNacl+500mM咪唑PH7.5)洗脱，分步收取洗脱液，进行电泳，从图5可以看出，经Ni柱一步纯化后，可以得到纯度约90％的含有SUMO标签的重组融合蛋白。

将纯化后的含有SUMO标签的重组融合蛋白，按照SUMO酶∶重组融合蛋白＝1∶100的比例混合(v/v)，37℃恒温酶切12h后，电泳结果如图6所示，从图中可以看出，分子量为20kDa的重组融合蛋白被酶切为16kDa的SUMO蛋白条带以及4kDa的目的蛋白条带(本发明的鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽其分子量约4kDa左右)，经过二次Ni柱纯化，，连有His的SUMO蛋白可以和柱结合，而非融合的aSCAIF随着透过峰流出，从而和SUMO蛋白分离。电泳图中可以看到透过峰中有分子量大小约为4kDa的蛋白条带，纯度可达90％以上。收集透过峰，做蛋白电泳显示可以获得大约90％纯度的4kDa非融合的小分子肽(见图7)。

由此说明本实施例成功获得融合表达的鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽。

实施例3 鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽活性检测

1.采用MTT实验检测实施例2制备所得鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽抑制血管内皮细胞HUVEC、乳腺癌细胞MCF-7和人前列腺癌细胞DU145的生长情况(抑制率＝(实验组-对照组)/对照组)，MTT操作采用本领域技术人员的常规操作，检测结果如表1所示。

表1 小分子肽抑制血管内皮细胞和肿瘤细胞增殖的抑制率

抑制率(％)/浓度 (mg/mL)	0.05	0.025	0.0125	0.006
					HUVEC	53.20％	28.70％	15.90％	9％
MCF-7	34.80％	16.80％	8.20％	0.80％
					DU145	16.50％	12.60％	4.90％	2.10％

从表1可看出，本发明鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽能够抑制血管内皮细胞HUVEC、乳腺癌细胞MCF-7和人前列腺癌细胞DU145的生长，尤其是血管内皮细胞的生长，在浓度为0.05ug/ul时，抑制率可以达到53.20％。

2.对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的抑制

买回孵化第6天的鸡胚，放在实验室的恒温箱内适应1d，第二天，打开鸡胚尿囊膜一端，将滤膜剪成直径1mm的正方形，并将实施例2制备所得鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽0.3ug/ul加在滤膜上，空白对照为生理盐水，加样量为20ul，等滤膜吸收了样品后，将其放在尿囊膜上，并用透明胶布封严，7d以后，打开透明胶布，用固定液(甲醇∶丙酮＝1∶1，体积比)固定3min后，用剪刀剪下滤膜周围的尿囊膜，平铺于培养皿上，用相机拍摄。

实验结果如图8所示，从图中可以看出，实验组加入了鲨鱼血管抑制因子小分子肽的样本中血管密度明显低于对照组，说明鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽可以抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成。

3.对小鼠肿瘤的抑制作用

小鼠乳垫接种鼠源乳腺癌4T1肿瘤细胞，设置三个组别：

1)阴性对照组(生理盐水组)：8只，给0.9％的Nacl溶液，每只每天加0.1ml。

2)阳性对照组(环磷酰胺)：8只，按文献给药浓度为20mg/kg，每只每天加0.1ml。

3)给药组：8只，给药浓度为5mg/kg，每只每天加0.1ml。

给药组和对照组均每天腹腔注射0.1mL，每天给药1次。

观察各组的肿瘤体积和重量变化情况，结果如图9和图10所示，从图中的各曲线对比可以看出，无论是瘤体积还是瘤重量，阴性对照组都明显高于阳性对照组和实验组。而且实验组的作用结果接近或好于阳性对照组。本发明鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽对小鼠乳腺癌4T1肿瘤细胞的生长是有明显的抑制作用的。

一种鲨鱼软骨血管生成抑制因子小分子多肽及其生产纯化方法和应用序列表.txtSEQUENCE LISTING

<110>暨南大学

<120>一种鲨鱼软骨血管生成抑制因子小分子多肽及其生产纯化方法和应用

<130>

<160>15

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

Lys Glu Ile Asp Asp Leu Asn Leu Lys Val Phe Asp Leu Lys Gly Lys

1 5 10 15

Phe Lys Arg Pro Pro Leu Lys Arg Val Arg Met Ser Ala Asp Ala Met

20 25 30

Leu

<210>2

<211>99

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(99)

<400>2

aaa gag att gat gat ctg aac ttg aaa gtc ttt gac ctg aaa ggc aaa 48

Lys Glu Ile Asp Asp Leu Asn Leu Lys Val Phe Asp Leu Lys Gly Lys

1 5 10 15

ttc aag agg cca cca ctc aag aga gtc cgt atg tct gct gat gcc atg 96

Phe Lys Arg Pro Pro Leu Lys Arg Val Arg Met Ser Ala Asp Ala Met

20 25 30

tta 99

Leu

<210>3

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<400>3

Lys Glu Ile Asp Asp Leu Asn Leu Lys Val Phe Asp Leu Lys Gly Lys

1 5 10 15

Phe Lys Arg Pro Pro Leu Lys Arg Val Arg Met Ser Ala Asp Ala Met

20 25 30

Leu

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gtgcgtatgt ctrctratg 19

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

attcttacgc cagtcycc 18

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

acacaactat caaratgg 18

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

gcagatcctt ctccttct 18

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

tggacttgag agctaacctg aa 22

<210>9

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

agaaggagaa ggatctgc 18

<210>10

<211>692

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

atacaactat caagatggga gatgatgaga aaaaatccaa gatgacttct tctcgcaaaa 60

tgcatctgaa gagtttactg ctctctcttg ctaaagctgc acttgagaag gaagaagcag 120

atcggatagc agagaaggag aggtatatgg aagaacattg tggacatctg cagactggtg 180

ggctttcaat ggccgagtta caggacttgt gcaagaaact tcatgcaaag atagatgttg 240

ttgatgagga gagatatgac atagaatcga gagttaataa gagcaccaaa gagattgatg 300

atctgaactt gaaagtcttt gacctgaaag gcaaattcaa gaggccacca ctcaagagag 360

tccgtatgtc tgctgatgcc atgttacgtg ctctactggg ctctaaacac aaggtgtcca 420

tggacttgag agctaacctg aaacaggtga agaaagagga cactgagaag gagaaggatc 480

tgcgtgatgt tggagactgg cgtaagaaca ttgaagagaa ggctggaatg gaaggcagaa 540

agaagatgtt tgagggcgct gaataaaatt gtcaccatgt aaccaaatac tgtattgcat 600

ttagtatttg taataaaata tatgtaggtc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660

aaaaaaaaaa aaaaaaac ca aaaaaaaaaa aa 692

<210>11

<211>183

<212>PRT

<213>人工序列

<400>11

Met Gly Asp Asp Glu Lys Lys Ser Lys Met Thr Ser Ser Arg Lys Met

1 5 10 15

His Leu Lys Ser Leu Leu Leu Ser Leu Ala Lys Ala Ala Leu Glu Lys

20 25 30

Glu Glu Ala Asp Arg Ile Ala Glu Lys Glu Arg Tyr Met Glu Glu His

35 40 45

Cys Gly His Leu Gln Thr Gly Gly Leu Ser Met Ala Glu Leu Gln Asp

50 55 60

Leu Cys Lys Lys Leu His Ala Lys Ile Asp Val Val Asp Glu Glu Arg

65 70 75 80

Tyr Asp Ile Glu Ser Arg Val Asn Lys Ser Thr Lys Glu Ile Asp Asp

85 90 95

Leu Asn Leu Lys Val Phe Asp Leu Lys Gly Lys Phe Lys Arg Pro Pro

100 105 110

Leu Lys Arg Val Arg Met Ser Ala Asp Ala Met Leu Arg Ala Leu Leu

115 120 125

Gly Ser Lys His Lys Val Ser Met Asp Leu Arg Ala Asn Leu Lys Gln

130 135 140

Val Lys Lys Glu Asp Thr Glu Lys Glu Lys Asp Leu Arg Asp Val Gly

145 150 155 160

Asp Trp Arg Lys Asn Ile Glu Glu Lys Ala Gly Met Glu Gly Arg Lys

165 170 175

Lys Met Phe Glu Gly Ala Glu

180

<210>12

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

ggaattccat atgcatcatc atcatcatca c 31

<210>13

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

accaccaatc tgttctctgt gagcctc 27

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

aaagagattg atgatctgaa 20

<210>15

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

ctacgcggat ccctattata acatggcatc agcagaca 38

Claims

1.一种鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽，含有33个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.编码权利要求1所述鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽的DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体含有权利要求2所述的DNA序列。

4.一种重组微生物，其特征在于所述重组微生物是权利要求3所述重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞制备得到。

5.权利要求1所述鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽的生产纯化方法，其特征在于包括如下步骤：

(3)将表达量高的克隆接种到培养基中发酵，离心所得发酵菌体，收集细胞、破碎、离心后得到上清，用Ni-NTA柱进行纯化，得到含有SUMO标签的鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽；在含有SUMO标签的鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽加入SUMO酶，SUMO酶与小分子多肽的体积比为1∶100，得到鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽。

6.权利要求1所述鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽在制备抑制血管生成或生长的药物中的应用。

7.权利要求1所述鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽在制备抑制血管内皮细胞生成或生长的药物中的应用。

8.权利要求1所述鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。