DK164174B - Et i det vaesentlige rent, ikke-glykolyseret humant interleukin-2-protein, fremgangsmaade til fremstilling af dette protein og farmaceutisk produkt indeholdende dette protein - Google Patents

Description

DK 164174 B

Den foreliggende opfindelse angår et i det væsentlige rent, ikke-glykosyleret humant interleukin-2-protein med en specifik aktivitet på ikke under 104 U/mg. Det er ifølge opfindelsen ejendommeligt ved det i krav 1 's kendetegnende del angivne. Opfin-5 delsen angår tillige en fremgangsmåde til fremstilling af dette interleukin-2-protein, hvilken fremgangsmåde ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav 2's kendetegnende del angivne; samt det i krav 8's kendetegnende del angivne farmaceutiske præparat.

10 Interleukin-2 (der også benævnes T-celle-vækstfaktor eller TCGF, og i nærværende beskrivelse vil blive forkortet til IL-2) er et lymfokin der dannes af T-celler ved stimulering med fx et lectin eller alloantigen (Science, 193, 1007 (1976); Immunological Reviews 51, 257 (1980)). IL-2 muliggør 15 langtidsdyrkning af T-celler ved at sætte dem i stand til at vokse in vitro under opretholdelse af deres funktioner.

Det er desuden rapporteret at IL-2 fremmer den mitogene reaktion af thymusceller (costimulator), genopretter antistofproduktionen hos miltceller mod T-celle-afhængige antigener 20 hos nøgne mus (T-celleerstattende faktor) eller fremmer differentiering og formering af dræberceller (dræberhjælperfaktor) (The Journal· of Immunology 123, 2928 (1979); Immunological Reviews 51, 257 .(1980)).

Dræber-T-cellekloner, hjælper-T-cellekloner og desu-25 den naturlige dræbercellekloner er tidligere vundet i store antal ved udnyttelse af IL-2 (se fx Nature 268, 154 (1977) og The Journal og Immunology 130, 1981 (1983)). Foruden sådan direkte anvendelse i kloning af T-celler eller naturlige dræberceller kan IL-2 bruges til selektivt at dyrke dræber-T-cel-30 ler som er specifikke i forhold til specielle antigener, fx dræber-T-celler som genkender et tumor-antigen og ødelægger tumoren in vitro. Ved at injicere tumorspecifikke dræber-T-celler, dyrket på denne måde, i et dyr, er det muligt at in-hibere og forhindre svulstvæksten (The Journal of Immunology 35 125, 1904 (1980)). Det er også kendt at IL-2 inducerer dannelse af IFN-y (The Journal of Immunology 130, 1784 (1983)) og at IL-2 aktiverer naturlige dræberceller (The Journal of 2

DK 164174 B

Immunology 130, 1970 (1983)).

De ovennævnte eksperimentelle kendsgerninger tyder på at IL-2 muligvis kan være nyttigt som antitumormiddel. Det vides at IL-2 kan genetablere hjælper -T-cellefunktionen hos 5 nøgne mus som mangler thymusfunktion (European Journal of Immunology 10, 719 (1980)) eller genoprette induktion af dræber-T-celler mod homologe celler (Nature 284, 278 (1980)), og IL-2 derfor forventes at være nyttig til behandling af immu-nokompromitterede sygdomme.

10 Imidlertid har produktion i stor målestok af IL-2 hid til været vanskelig så at kliniske anvendelser deraf for tiden er umulig. Der har derfor været ventet på en teknik som gør det muligt at producere i høj grad renset IL-2 i store mængder på let og simpel måde og med lave omkostninger.

15 Taniguchi et al. klonede det humane IL-2 gen ved at anvende IL-2 mRNA isoleret fra den humane T-celleleukæmilinie Jurkat som udgangsmateriale og rapporterede den aminosyresekvens for humant IL-2 protein som kunne udledes deraf samt bragte genet til udfoldelse i COS-7 celler (Nature, 302, 305, 1983). Sene-20 re rapporterede Devos et al. at IL-2 genet fra humane miltceller der var blevet klonet og bragt til udfoldeide i Escherichia coli (Nucleic Acids Research, 11, 4307, 1983).

Ikke desto mindre er tilstedeværelse af en IL-2-agtig substans hidtil kun blevet antaget på basis af at der er blevet opdaget 25 TCGF aktivitet. Der er ingen rapport som angiver at et humant IL-2 protein, frembragt af en transformant som bærer et DNA der koder for humant IL-2, faktisk er blevet isoleret til frembringelse af en renset form.

Fra dansk patentansøgning nr. 5772/83, svarende til 30 europæisk offentliggørelsesskrift nr. 91.539 A1, kendes deret gen som er kodet for interleukin-polypeptid, et rekombinant DNA som bærer dette gen, en cellelinie indeholdende det rekom-binante og en fremgangsmåde til fremstilling af interleukin-2 ved anvendelse af cellelinien, der fx kan være til stede i 35 celler af Escherichia coli eller Saccharomyces cerevisiae, der dyrkes til fremstilling af interleukin-2-polypeptidet.

I forbindelse med fremstillingen af interleukin-2-proteinet

DK 164174B

3 fra den gensplejsede organisme angiver det nævnte skrift en rå ekstrakt af dyrkningssuppen fra transformanten. Skriftet angiver således ikke noget i det væsentlige rent ikke-glyko-syleret humant interleukin-2-protein.

5 Det fra skriftet kendte rå produkt af IL-2 fremkommet ved en gensplejsningsteknik under anvendelse af en Escherichia coli transformant indeholder endotoxiner og pyrogener. Produktet kan derfor ikke udnyttes til klinisk brug som det er. I modsætning hertil er det her omhandlede, i det væsentlige rene 10 ikke-glykosylerede humane IL-protein, skønt produceret ved hjælp af en Escherichia coli transformant, højrenset og indeholder ikke sådanne urenheder som endotoxiner og pyrogener, og produktet kan derfor bruges som det er.

Det DNA som koder for humant IL-2, der skal bruges ved 15 udøvelse af den foreliggende opfindelse, er fx et DNA (I) med en basesekvens defineret ved codonerne 1-133 i fig. 2.

Dette DNA (I) kan i sin 5'-ende eventuelt indeholde enten ATG eller en signalsekvens der i fig. 2 repræsenteres af codonerne S1-S20 og fortrinsvis indeholder TAA, TGA eller TAG 20 i 3'-enden, idet TGA foretrækkes i særlig grad.

DNA-molekylet (I) er fortrinsvis tilsluttet medstrøms i forhold til en promoter, fx tryptofan (trp) promotoren, rec A-promoteren eller xPL-promoteren, hensigtsmæssigt trp-eller xPL-promoteren.

25 Til udøvelse af den foreliggende fremgangsmåde iso leres det mRNA som koder for humant IL-2 fra en kultur af humane perifere leukocyter der er stimuleret af fx concanavalin A, hvorpå et enkeltstrenget cDNA syntetiseres ved hjælp af revers transkriptase og der yderligere syntetiseres et dobbelt-30 strenget DNA. DNA'et indsættes i et plasmid, rekombinant- plasmidet bruges til omdannelse af en stamme af fx Escherichia coli eller Bacillus subtilis, og det cDNA-indeholdende plasmid klones. på denne måde kan der fremstilles et dobbeltstrenget DNA som koder for humant IL-2.

35 Mere udførligt beskrevet kan det mRNA som indkoder for humant IL-2 og som skal bruges til udøvelse af den fore- 4

DK 164174 B

liggende opfindelse vindes ved den fremgangsmåde der er angivet af Hinuma et al. (Biochemical and Biophysical Research Communications, 109, 363, 1982). Med det på denne måde vundne humant IL-2 mRNA som "skabelon" syntetiseres der et cDNA på 5 den i og for sig kendte måde ved anvendelse af revers transkrip-tase og cDNA'et omdannes til et dobbeltstrenget DNA (T. Ma-niatis et al., Cell, £, 163 (1976); H. Land et al.. Nucleic Acids Research, 9_, 2251, 1981) . Dette DNA indsættes fx i plasmidet pBR322 på stedet for PstI restriktions-endonuklease 10 spaltning ved fx dG-dC-homopolymer-ligationsmetoden (T.S.

Nelson, Methods in Enzymology 68, 41, 1979). Desuden syntetiseres der kemisk et oligonukleotid med en basesekvens der svarer fx til aminosyresekvensen af en del af humant IL-2, og 32 det mærkes derefter med P. Under anvendelse af denne som sonde udvælges den ønskede klon blandttetracyklin- eller ampi-cillin-resistente transformanter ved den i og for sig kendte koloni-hybridiseringsmetode (M. Grunstein og D.S. Hogness,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3961, 1975; J.C. Alwine et al., Methods in Enzymology, 68, 220, 1979). Tilstedeværelsen 20 af humantIL-2 gen bekræftes ved bestemmelse af basesekvensen hos DNA stammende fra den klon som reagerer positivt i ovennævnte hybridiseringsmetode ved Maxam-Gilberts metode (A.M.

Maxam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560, 1977) eller den syntetiske dinukleotid-kædeafslutningsmetode under anven-25 delse af phag M13 (J. Messing et al., Nucleic Acids Research, 9_, 309, 1981). Derefter udtages hele det humane IL-2 gen eller en del deraf fra den vundne klon og indsættes i et plasmid nedenfor en passende promoter og SD (Shine and Dalgarno) basesekvensen med henblik på påfølgende indføring i en passende 30 vært.

Anvendelse af blandt andet trp-promoteren som promoter er fordelagtig. Som vært kan der med fordel blandt andet bruges en stamme af Escherichia coli, fx stamme 294, stamme DHl eller stamme N4830. Stammerne Escherichia coli 294 (Beckman 35 et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 13, 4174, 1976), E. coli DHl (Μ. E. Selson et al., Nature, 217, 1110, 1968) og E. coli

DK 164174B

5 N4830 (Cell, 25r 713, 1981) er kendte stammer.

Omdannelse af sådanne stammer med DNA kan udføres ved den kendte metode (S.N. Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, £9, 2110, 1972) . Den således vundne vært dyrkes i et i 5 og for sig kendt medium såsom det glukose- og casaminosyrehol-dige M9 medium (J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, side 431-433 (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972)).

I tilfælde hvor trp-promotoren bruges kan der tilsættes et middel såsom 3-6-indolylakrylsyre for at forøge effektivite-10 ten af denne promoter. Dyrkningen udføres alment ved 15-43°C i 3-24 timer under luftning og/eller omrøring efter behov.

I tilfælde hvor man bruger λPL-promotoren udføres dyrkningen fortrinsvis ved forholdsvis lav temperatur på omkring 30-36°C for at dyrke transformanterne og derpå ved ca. 37-42°C 15 for at inaktivere repressoren i transformanterne og effektivt bringe det DNA til udtryk, der koder for humant IL-2.

Det på denne måde dannede måde dannede humane IL-2 kan bestemmes ved hjælp af en IL-2-afhængig cellelinie. Eftersom humantIL-2 vides at fremme væksten af rotte-, muse- eller an-20 dre IL-2-afhængige celler såvel som humane IL-2-afhængige celler (Immunological Reviews, 53., 257, 1980), kan der ikke blot bruges IL-2 afhængige humane cellelinier men også rotteeller muse-IL-2-afhængige cellelinier (Journal of Immunology 130, 981 og 988,1983) .

25 Navnlig kan muse-IL-2-afhængige cellelinier holdes stabilt ved dyrkning i lang tid så at anvendelse deraf kan give i høj grad reproducerbare prøveresultater.

Ved ekstraktion af det humane IL-2 ifølge opfindelsen fra dyrkede celler indhøstes cellerne efter dyrkningen ved den 30 kendte metode, idet de suspenderes i en opløsning af et proteindenatureringsmiddel såsom et salt med en mineralsk syre af guanidin (fx hydrokloridet, nitratet eller sulfatet), og suspensionen omrøres i kulden og centrifugeres derpå, hvorved der opnås en IL-2-holdig ovenstående væske; eller de indhøste-35 de celler suspenderes i en puffer og brydes ved ultralydpåvirkning, behandling med lysozym og/eller frysning og optøning, 6

DK 164174 B

efterfulgt af centrifugering til frembringelse af en IL-2-holdig ovenstående væske. Der kan også anvendes en anden hensigtsmæssig metode.

Isolering af IL-2 fra nævnte ovenstående væske og den 5 påfølgende rensning deraf kan udføres ved en passende kombination af i og for sig kendte metoder til adskillelse og rensning. Sådanne kendte separations- og rensemetoder indbefatter blandt andet metoder under udnyttelse af opløselighedsforskelle såsom udsaltningsmetoden og opløsningsmiddel-udfældningsmeto-10 den, metoder der udnytter molekylvægtforskelle såsom dialyse, ultrafiltrering, gelfiltrering og SDS-polyakrylamidgel-elek-troforese, metoder der udnytter forskelle i ladning såsom ion-bytterkromatografering, metoder der udnytter specifikke affiniteter såsom affinitetskromatografering, metoder der udnytter 15 hydrofobicitetsforskelle såsom reversfase-højtydende væske-kromatografering og metoder der udnytter forskelle med hensyn til det isoelektriske punkt såsom isoelektrisk fokusering. Eftersom det humane IL-2 protein er i høj grad hydrofobt er hydrofob søjlekromatografering, navnlig højtydende væskekroma-20 tografering under anvendelse af en reversfasekolonne meget effektive med hensyn til at rense dette protein.

Således kan man fx suspendere de celler, der vindes ved dyrkning af en stamme af Escherichia coli indeholdende det gen som koder for humant IL-2, i en opløsning, fortrinsvis i 25 en puffer af et proteindenatureringsmiddel såsom guanidin-hydroklorid (i en koncentration på 2 M til 8 M, fortrinsvis 6 M - 8 M), og suspensionen omrøres derfor, fortrinsvis ved 0 - 5°C i 0,5-3 timer hvorpå den centrifugeres. Den herved op-samlede ovenstående væske underkastes derpå dialyse, enten som 30 den er eller efter koncentrering ved hjælp af et ultrafiltreringsmiddel eller lignende. Det resulterende bundfald fjernes ved centrifugering, den ovenstående væske underkastes anion-bytterkromatografi ved hjælp af diætylaminoætylcellulose (fx en kolonne af DE-52 cellulose fra Whatman i Storbritannien), 35 og der opsamles en aktiv fraktion.

Efter koncentrering ved hjælp af en ultrafiltreringsteknik underkastes den aktive fraktion derefter gelfiltrering 7

DK 164174 B

under anvendelse af en kolonne N,N'-metylen-bis-akrylamid-tværbundet allyldextran såsom "Sephacryl"® S-200 (fra Pharmacia i Sverige) eller lignende. Den opsamlede fraktion underkastes derefter den forannævnte højtydende væskekromatografe-5 ring. På denne måde kan man vinde det ikke-glykosylerede humane IL-2 ifølge opfindelsen.

Som reversfasesystem til anvendelse ved højtydende væ-skekromatografering kan man med fordel blandt andet bruge en harpiks overtrukket med alkylerede silaner. Som elue- 10 ringsmiddel kan der med fordel bruges en C^_g alkanol, fx ætanol eller propanol, eller acetonitril, og elueringsmidlet har en pH-værdi på 1,5-8, fortrinsvis 1,5-4. Elueringshastig-heden er fortrinsvis 0,1-100 ml/min.

Det på denne måde vunden humane IL-2 protein kan efter 15 behov omdannes til et pulver ved frysetørring. I tilfælde af frysetørring kan der tilsættes en stabilisator såsom sorbitol, mannitol, dextrose, maltose, glykose eller humant serumalbumin (HSA).

Ved afprøvning for IL-2-aktivitet hvor der som indika-20 tor bruges optagelsen af radioaktivt thymidin i IL-2-afhængi-ge museceller udviser det i henhold til den foreliggende opfindelse vundne humane IL-2 protein en specifik aktivitet på 4 ikke under 1 x 10 U/mg. I henhold til opfindelsen kan der vindes et højrent,ikke-glykosyleret human IL-2 protein med 25 en specifik aktivitet på ikke under 2 x 104 U/mg og op til 4 x 104 U/mg.

Som nævnt blev IL-2-aktiviteten i enheder (U) beregnet på følgende måde.

En IL-2-holdig prøve sattes til et medium indeholdende 30 celler af en musecellelinie som vokser i afhængighed af koncentrationen af IL-2, og hele blandingen inkuberedes ved 37°C natten over i nærværelse af 5% C02, og væksten af denne cellelinie bestemtes ved hjælp af tritieret thymidin. Til beregning af aktiviteten i enheder (U) i den pågældende prøve brugtes 35 der stedse et standard IL-2 (1 u/ml) til sammenligning, og aktiviteten i enheder beregnedes ud fra aktivitetesforholdet 8

DK 164174 B

mellem prøven og standarden.

Nærmere beskrevet vaskedes celler af en IL-2-afhængig musecellelinie (NKC3; Hinuma et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 109, 363, 1983), der var opretholdt ved subkultur i 5 et med 20% FCS tilsat RPMI 1640 medium suppleret med et Iltholdigt konditioneret medium ved 37°C i nærværelse af 5% CC^, to gange med et serumfrit RPMI 1640 medium og gensuspenderes i RPMI 1640 medium med 20% FCS tilsat til en celletæthed på 6 x 10^ celler/ml.

10 En IL-2-holdig prøve fordeles i portioner på 50 μΐ i afsnittene i den første række af en fladbundet mikrotiter- (S) plade med 96 afsnit ("Nunc"^ , Danmark). Under anvendelse af 50 μΐ store portioner af RPMI 1640 medium med 20% tilsat FCS frembringes der en dobbelt seriefortyndingsserie indtil 15 tolvte række. Derefter fordeles ovennævnte NKC3 cellesuspension i portioner på 50 μΐ i alle afsnittene efterfulgt af in-kubering ved 37°C i nærværelse af 5% CO2 i 24 timer. Efter 20 timers inkubering sættes der til hvert afsnit 1 μ^ tri-tieret thymidin (fra Amersham i Storbrittanien) . Efter fortsat 20 inkubering i 4 timer udvandtes celler på et glasfilter under anvendelse af en celleindhøster ("Flow”, USA) og måltes med hensyn til optagelse af tritieret thymidin under anvendelse af en væskescintillationstæller. Ved udførelse af denne prøve underkastes en standardprøve af IL-2 den samme behandling som 25 den til bestemmelse værende prøve, og optagelsen af tritieret thymidin bestemmes.

Beregning af aktiviteten i enheder (U) udføres ved pro-bitmetoden ifølge Journal of Immunology 120, 2027 (1978). Således anses den maksimale optagelse i standard IL-2 prøvefor-30 tyndingsserien som 100% og procenten (%) for optagelsen for hvert fortyndingstrins vedkommende beregnes. De herved vundne værdier opstilles på et normalt sandsynlighedspapir og den fortyndingsfaktor ved hvilken optagelsen er 50% bestemmes grafisk. For den IL-2-holdige prøves vedkommende bestemmes 35 på samme måde den fortyndingsfaktor ved hvilken optagelsen er 50%. Den mængde IL-2-aktivitet, der indeholdes i den ovenstående væ- 9

DK 164174 B

ske fra kulturen' efter 48 timers inkubering ved 3 7°C i nærværelse af 5% CC>2 for en suspension af humane perifere blodlym-focyter (5 x 10® celler/ml) i det med 10% FCS tilsatte RPMI 1640 medium suppleret med 40 μ9/πι1 concanavalin A og 15 ng/ml 5 12-0-tetradekanoylphorbol-13-acetat, defineres som 1 U/ml.

IL-2-koncentrationen i U/ml af prøven beregnes ved formlen:

Den fortyndingsfaktor ved prøven ved hvilken 50% optagelse opnås 1 g Fortyndingsfaktor for en standard IL-2 prøve ved hvilken 50% optagelse opnås

Det naturlige IL-2 der vindes fra det humane perifere blod havde en specifik aktivitet på 20000-70000 U/mg, bestemt for ^ den foran beskrevne prøvemetode. Denne aktivitet er næsten den samme som aktiviteten af det ikke-glykosylerede humane IL-2 protein ifølge den foreliggende opfindelse.

Det ikke-glykosylerede humane IL-2 protein ifølge den foreliggende opfindelse indeholder fortrinsvis et polypeptid (II) med den aminosyresekvens som er vist i fig. 3 og hvor X betegner Met eller hydrogen.

Det humane IL-2 protein som er fremstillet ifølge opfindelsen har følgende karakteristiske egenskaber: 1) Det er homogent ved SDS-polyakrylamid-gelelektroforese og har en molekylvægt på 15000 + 1000 dalton, bestemt ved en sådan elektroforese, 2) det indeholder alanin eller methionin som aminotermi-nal aminosyre, 3) det indeholder threonin som karboxyterminal aminosyre, 4) det har en aktivitet af voksende T- eller naturlige 30 dræberceller under opretholdelse af deres funktioner.

Det humane IL-2 protein som er fremstillet ifølge opfindelsen reagerer negativt ved limulus-lysatprøven (Haemostatis, 7, 183 , 1978) og har meget lavt indhold af urenheder af proteinnatur og pyrogene substanser således at det kan bruges sikkert 35 som stamsubstans til fremstilling af injektionspræparater med videre.

Det ikke-glykosylerede IL-2 protein fremstillet i over- 10

DK 164174 B

enssteirunelse med opfindelsen har aktivitet med hensyn til at fremme væksten af normale T-celler eller naturlige dræberceller under opretholdelse af deres funktioner. Derfor kan IL-2 proteinet ifølge opfindelsen bruges ved dyrkning og i subkultur af 5 T-celler eller naturlige dræberceller in vitro i lang tid eller til kloning af sådanne celler. Desuden kan denne egenskab udnyttes ved måling af human IL-2-aktivitet.

Desuden gør det humane IL-2 protein ifølge opfindelsen det muligt selektivt in vitro at dyrke antigen-specifikke dræ-10 ber-T-celler som genkender og ødelægger tumor-antigner, eller naturlige dræberceller som har evne til at dræbe tumorceller uanset om de har "erfaring" med hensyn til antigenisk sensitivering eller ej. Når det incudes i en levende organisme samtidig, med indføring af disse dræberceller i den levende organisme forø-15 ger det humane IL-2 ifølge opfindelsen antitumorvirkningen af dræber-T-celler. Det kan derfor bruges til forebyggelse eller behandling af svulster eller behandling af immundeficienssyg-domme hos varmblodede dyr som fx mus, rotter, kaniner, hunde, katte, grise, heste, får, kvæg og mennesker.

20 Det humane IL-2 protein ifølge opfindelsen er et høj- renset produkt som har ringe antigenicitet overfor mennesker og har lav toxicitet.

Som middel til forebyggelse og behandling af svulster kan det humane IL-2 protein ifølge opfindelsen indgives enten 25 parenteralt eller oralt i form af fx injektionspræparater eller kapsler fremstillet véd hensigtsmæssig blanding eller fortynding med i og for sig kendte bærestoffer. Det kan bruges alene eller i kombination med dræber-T-celler eller naturlige dræberceller dyrket in vitro som nævnt foran.

30 Det humane IL-2 protein ifølge opfindelsen har i det væsentlig samme biologiske aktivitet som det naturlige humane IL-2 og kan følgelig bruges på samme måde som det naturlige IL-2. Dets dissociationskonstant i forhold til IL-2-receptoren i de responderende celler er meget lav så at en meget lille 35 dosis er tilstrækkelig i de fleste tilfælde.

Med henblik på dyrkning af T-celler in vitro kan det

DK 164174 B

1 1 humane IL-2 ifølge opfindelsen sættes til mediet i en koncentration på omkring 0,01-1 U/ml, fortrinsvis 0,1-0,5 U/ml.

Ved et eksempel på anvendelse med henblik på at dyrke T-celler in vitro sættes IL-2 proteinet ifølge opfindelsen, 5 op til en koncentration på 0,1-0,5 enheder/ml, til en cellesuspension der fx indeholder alloantigen-sensitiverede T-celler vundet ved en 3 dages blandet lymfocytkultur af T-celler stammende fra humant perifert blod (1 x 10^ celler/ml)med tilsatte B-celletransformanter (1 x 10° celler/ml) stammende fra rønt-10 genbestråling (1500 rad), i RPMI 1640 medium indeholdende 20% føtalt okseserum. Dyrkningen udføres i ca. 1 måned med gentagen mediumudskiftning med mellemrum på ca. 1 uge.

Den transformant som er angivet i følgende eksempler, nemlig Escherichia coli DHl/pTF4, er blevet deponeret i In-15 stitute for Fermentation, Osaka (IFO) under deponeringsnummeret IFO-14299 og er ligeledes deponeret hos Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan (FRI) under accessionsnummeret FERM BP-628 for en deponering 20 under budapesttraktaten.

I nærværende beskrivelse med tilhørende tegninger er baser og aminosyrer, når angivet ved forkortelser, forkortet i overensstemmelse med reglerne i IUPAC-IUB Commision on

Biochemical Nomenclature, eller i overensstemmelse med praksis 25 på det pågældende område. Eksempler herpå er givet i nedenstående tabel 1. I de tilfælde hvor optisk isomeri er involveret er de nævnte aminosyrer alle i L-form med mindre andet udtrykkeligt er angivet.

30 35 12

DK 164174 B

Tabel 1 DNA: Desoxyribonukleinsyre cDNA: Komplementær desoxyribonukleinsyre A: Adenin 5 T: Thymin G: Guanin C: Cytosin RNA: Ribonukleinsyre mRNA: Budbringer-ribonukleinsyre (messenger - RNA) 10 dATP: Desoxyadenosin-trifosfat dTTP: Desoxythymidin-trifosfat dGTP: Desoxyguanosin-trifosfat dCTP: Desoxycytidin-trifosfat ATP: Adenosintrifosfat 15 EDTA: Ætylendiamintetraeddikesyre SDS: Natriumdodecylsulfat

Gly: Glycin

Ala: Alanin

Val: Valin 20 Leu: Leucin

Ile: Isoleucin

Ser: Serin

Thr: Threonin

Cys: Cystein 25 1/2 Cys: Halv-cystin

Met: Methionin

Glu: Glutaminsyre

Asp: Asparaginsyre

Lys: Lysin

Arg: Arginin

His: Histidin

Phe: Fenylalanin

Tyr: Tyrosin

Trp: Tryptofan 35 Pro: Prolin

Asn: Asparagin

Gin: Glutamin

DK 164174B

13 På tegningen viser fig. 1 et restriktionsenzymkort over plasmidet pILOT135-8 vundet i referenceeksempel 1 (vii), idet det fra venstre skråt ned mod højre skraverede viser den portion som koder for sig-5 nalpeptidet og det fra højre nedad mod ventstre skraverede den portion som koder for IL-2, fig. 2 den primære struktur (basesekvens) for dette plasmid, fig. 3 aminosyresekvensen for det ikke-glykosylerede 1Q humane IL-2 protein ifølge opfindelsen, idet X betegner Met eller et hydrogenatom, fig. 4 et skema over konstruktion af ekspressionsplas-midet pTF4 som beskrevet i referenceeksempel 2, fig. 5 resultaterne af SDS-polyakrylamid-pladegelelek-15 troforeser udført i eksempel 1 (v) (1) og (2), fig. 6 det i eksempel 1 (v) (6) nævnte tryptiske peptid- kort, fig. 7 virkningerne af det humane IL-2 protein ifølge opfindelsen på NKC3 celleliniens optagelse af tritieret thymidin, 20 fig. 8 virkningerne af det humane IL-2 protein ifølge opfindelsen på en human cellelinies optagelse af tritieret thymidin, som angivet i eksempel 1 (v) (7) og fig. 9 resultaterne af langtids-subkultur af NKC3-celle-linien som udført i henhold til eksempel 1 (v) (7).

25

Referenceeksempel 1 (i)_Isolering af mRNA cer koder for humart IL-2

Lymfocyter fremstillet ud fra humant perifert blod inkuberedes i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt ok-30 seserum, 15 ng/nl 12-O-tetradekanoylphorbol-13-acetat (CTPA) og 4 0 pg/ml concanavålin A ved 37°C for herved at inducere IL-2.

Efter 24 timers inkubering blev 1 x 10^ humane lymfocyter induceret på denne måde brudt og denatureret i en opløsning indeholdende 5 M guanidin tiocyanat, 5% merkaptoætanol, 50 mmol tris.HCl (pH 7,6) og 10 mmol EDTA under anvendelse af en homo-genisator af "Teflon" ® , og derpå tilsattes der natrium-N-lauroylsarkosinat til en koncentration på 4%; efter homoge- 14

DK 164174B

nisering anbragtes blandingen som lag på 6 ml 5,7 M cæsium-kloridopløsning (5,7 M cæsiumklorid, 1 M EDTA) og centrifugeredes ved hjælp af en Beckman SW28 rotor med 24000 opm og 15° C i 48 timer til frembringelse af et RNA-bundfaid. Dette RNA-5 bundfald opløstes i 0,25%s natrium-N-lauroylsarcosinat og udfældedes med ætanol til frembringelse af 10 mg RNA. I en højkoncentreret saltopløsning (0,5 M NaCl, 10 mmol tris-HCl pH 7,6, 1 mmol EDTA, 0,3% SDS) absorberedes dette RNA på en oligo(dT)cellulosekolonne. Eluering med en lavkoncentreret 10 saltopløsning (10 mmol Tris-HCl pH 7,6, 1 mmol EDTA, 0,3% SDS) gav 300 pg poly(A)-indeholdende mRNA. Dette mRNA underkastedes yderligere udfældning med ætanol og opløstes derpå i 0,2 ml af en opløsning (10 mmol tris-HCl pH 7,6, 2 mmol EDTA, 0,3% SDS), behandlet ved 65°C i 2 minutter og fraktio-15 neret ved 10-35%s sakkarose-densitetsgradient-centrifugering (ved 20°C og ved 25000 opm i 21 timer under anvendelse af en Beckman SW28 rotor) i 22 fraktioner. En prøve af hver fraktion blev injiceret i oocytter af Xenopus laevis og IL-2 aktiviteten i således syntetiserede proteiner måltes. Fraktionerne 20 nr. 11-15 (sedimentationskoefficient 8S-15S) viste sig at have IL-2 aktivitet. Der var ca. 25 μg IL-2 mRNA til stede i disse fraktioner.

(ii) Syntese af enkeltstrenget DNA

25 Under anvendelse af det som ovenfor beskrevet vundne mRNA og revers transkriptase udførtes inkubering i 100 μΐ reaktionsopløsning (5 μg mRNA, 50 pg oligo(dT), 100 enheder revers transkriptase, 1 mmol dATP, 1 mmol dCTP, 1 mmol dGTP, 1 mmol dTTP, 8 mmol MgC^, 50 mmol KCl, 10 mmol dithiothreitol, 30 50 mmol tris-HCl pH 8,3) ved 42°C i 1 time efterfulgt af de- proteinering med fenol og behandling med 0,1 N NaOH ved 70°C i 20 minutter til fjernelse af RNA ved sønderdeling. 1

Syntese af dobbeltstrenget DNA

35 Et dobbeltstrenget DNA syntetiseredes ved behandling af det på den ovenfor beskrevne måde syntetiserede enkeltstrengede komplementære DNA i 50 μΐ af en reaktionsopløsning 15

DK 164174 B

(samme som ovennævnte reaktionsopløsning, dog med den forskel at mRNA og oligo(dT) ikke var til stede) ved 42°C.

(iv) Tilsætning af dC-hale 5 Det dobbeltstrengede DNA behandledes med nuklease Si i 50 μΐ af en reaktionsopløsning (dobbeltstrenget DNA, 0,1 M natriumacetat pH 4,5, 0,25 M NaCl, 1,5 mmol ZnSO^, 60 enheder Si nuklease) ved stuetemperatur i 30 minutter, efterfulgt af deproteinisering med fenol og DNA-udfældning med ætanol. DNA'et 10 behandledes med terminal transferase i 50 μΐ af en reaktionsopløsning (dobbeltstrenget DNA, 0,14 M natriumcacodylat, 0,3 M tris (base) pH 7,6, i 2 mmol dithiothreitol, 1 mmol CoC^, 0,15 mmol dCTP, 30 enheder terminal transferase) ved 37°C i 3 minutter for derved at bevirke udvidelse af det dobbelt-^ strengede DNA ved ca. 15 desoxycytidiner ved begge 3'-enderne. Denne reaktionsserie gav ca. 300 ng af et desoxycytidinkæde-indeholdende dobbeltstrenget DNA.

(v) Spaltning af Escherichia coli plasmid og tilføjelse af 20 _dG-hale_ Særskilt behandledes 10 μg Escherichia coli plasmid pBR322 DNA med restriktionsenzymet PstI i 50 μΐ af en reaktionsopløsning (10 pg DNA, 50 mmol NaCl, 6 mmol tris.HCL pH 7,4 6 mmol MgC^, 6 mmol 2-merkaptoætanol, 100 μg/ml okseserum-25 albumin, 20 enheder PstI) ved 37°C i 3 timer for derved at spalte det eneste PstI genkendelsessted som forekommer i pBR322 DNA, efterfulgt af deproteinisering med fenol. Det spaltede plasmid pBR322 DNA udvidedes med ca. 17 desoxyguani-ner i begge 3'-enderne ved behandling med terminal transferase Λ i 50 μΐ af en reaktionsopløsning (10 μg DNA, 0,14 M kalium-cacodylat, 0,3 M tris-base pH 7,6, 2 mmol dithiothreitol, 1 mmol CoC^, 0,15 mmol GTP, 30 enheder terminal transferase) ved 37°C i 3 minutter.

ae (vt) Hærdning af cDNA og omdannelse af Escherichia coli Det på den ovenfor beskrevne måde vundne syntetiske 16

DK 164174B

dobbeltstrengede DNA (0,1 pg) og 0,5 μg af ovennævnte plasmid pBR322 blev hærdet (annealed) ved opvarmning i en opløsning indeholdende 0,1 M NaCl, 50 mmol tris-HCl pH 7,6 og 1 mmol EDTA ved 65°C i 2 minutter og derpå ved 45°C i 2 timer efterfulgt 5 af gradvis afkøling, hvorpå produktet brugtes til omdannelse af Escherichia coli MM294 i overensstemmelse med den af Enea et al. angivne metode (J. Mol. Biol., 9jj, 495, 1975).

(vii) Isolering af cDNA-indeholdende plasmid 1Q På denne måde isoleredes der ca. 20000 tetracyklin- resistente transformanter. DNA'er i hver af dem blev fikseret på et nitrocellulosefilter. Baseret på den aminosyresekvens for IL-2, der er angivet af Taniguchi et al. (Nature, 302, 305, 1983) blev de komplementære oligonukleotider af basesekvenser 15 (5 AAA CAT CTT CAG TGT 3' og 5*ACA TTC ATG TGT GAA 3') svaren de til aminosyrerne henholdsvis nr. 74-78 (Lys-His-Leu-Gln-Cys) og nr. 122-126 (Thr-Phe-Met-Cys-Glu) kemisk syntetiseret ved fosfotriestermetoden (R. Crea et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 75, 5765, 1978).

32 20 Disse oligonukleotider mærket med -P i 5'-enden ved behandling med T4-polynukleotid-kinase i 50 μΐ af en reaktionsopløsning (0,20 μg oligonukleotid, 50 mmol tris-HCl pH 8,0, 32 10 mmol MgC^, 10 mmol 2-merkaptoætanol, 50 μCi γ- P ATP, 3 enheder T4 polynykleotid-kinase) ved 37°C i 1 time. Disse 25 mærkede oligonukleotider blev som sonder (probes) hærdet med de ovenfor beskrevne DNA*er fikseret på et nitrocellulosefilter ved den af Lawn et al angivne metode (Nucleic Acids Res., 9^, 6103, 1981). Der opdagedes ved autoradiografi fire transformanter som var reaktive over for de ovennævnte to oligo-30 nukleotid-sonder. Plasmid-DNA'et isoleredes fra celler fra hver af disse transformanter ved Birnboim-Dolys alkalimetode (H.C. Birnboin og J. Doly, Nucleic Acids Res., 7, 1513, 1979). Derefter blev det i plasmid-DNA'et indsatte udskåret ved hjælp af restriktionsenzymet PstI. Blandt de isolerede plasmider 35 udvalgtes det som indeholdt det længste indføjede fragment og det betegnedes pILOT 135-8. Restriktionsenzym-kortet over

DK 164174 B

17 dette plasmid er vist i fig. 1.

Den primære struktur (basesekvens) af det cDNA som var indført i dette pILOT 135-8 bestemtes ved didesoxynukleotidme-toden og Maxam-Gilberts metode. Den således bestemte primære 5 struktur er vist i fig. 2. Det peptid som er defineret af denne basesekvens består af 153 aminosyrer, begyndende med syntese-startsignalet (nr. 64-66 ATG). Blandt disse anses de 20 aminosyrer fra N-terminalen for at udgøre et signalpeptid.

Den ovennævnte primære struktur har vist at dette plasmid har 10 hele den basesekvens som koder for det humane IL-2 protein.

Denne kendsgerning tyder på at indføjning af det i nævnte plasmid indførte gen i et passende ekspressionsplasmid kan føre til produktion af en vilkårlig polypeptiddel af IL-2 proteinet.

15

Referenceeksempel 2

Plasmidet pILOT135-8, vundet i referenceeksempel 1, spaltedes med restriktionsenzymet HgiAl. Det således vundne

9 A

1294 bp DNA-fragment indeholdende IL-2-genet behandledes med T4 DNA-polymerase, forenet med Clal kobler (linker) CGATA ATG GCA, der indeholdt codonet GCA for alanin og codonet ATG for methionin, og produktet behandledes med Clal og PstI, efterfulgt af indføjning i ptrp771 på Clal- Pstl-stedet. Det der-25 ved vundne ekspressionsplasmid fik betegnelsen pTF4 (fig. 4).

Referenceeksempel 3

Escherichia coli DH1 omdannedes med det i referenceek-30 sempel 2 vundne plasmid pTF4 i overensstemmelse med den af Cohen et al. angivne metode (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110, 1972) til frembringelse af en transformant (Escherichia coli DHl/pTF4) indeholdende dette plasmid.

35 18

DK 164174 B

Eksempel 1 (i) Escherichia coli DHl/pTF4 (vundet som beskrevet i referenceeksempel 3 podedes i 50 ml af et flydende medium (pH 7,0) indeholdende 1% "Bacto"® trypton ("Difco Laboratories", USA), ^ 0,5% "Bacto" ® gærekstrakt ("Difco Laboratories", USA, 0,5% natriumklorid og 7 μg/ml tetracyklin anbragt i en 250 ml stor erlenmeyerkolbe. Efter inkubering ved 37°C natten over på en svingrotor overførtes kulturen til en 5 liter stor krukke ^ fermentor indeholdende 2,5 1 M9 medium indeholdende 0,5% casa-minosyrer, 0,5% glukose og 7 μ9/πι1 tetracyklin. Der gennemførtes derefter inkubering under luftning og omrøring ved 37°C i 4 timer, og efter tilsætning af 25 μς/πιΐ 3-6-indolylakrylsyre i yderligere 4 timer. Celler høstedes fra den herved vundne 2,5 liter store dyrkningssuppe ved centrifugering, blev fros-set ved -80°C og opbevaret.

(ii) 12,1 g af de i eksempel 1 (i) vundne, fryse-opbevarede celler suspenderedes i 100 ml af et ekstraktionsmiddel (7,0) indeholdende 7 M guanidinklorid og 0,1 M tris-HCl, suspensionen omrørtes ved 4°C i 1 time og lysatet centrifugeredes ved 28000 x g i 20 minutter til opnåelse af 93 ml ovenstående væske.

25 (iii) Særskilt gennemførtes der forskellige behandlinger for at ekstrahere IL-2 fra Escherichia coli DHl/pTF4 transfor-mantcellerne vundet ved den i eksempel 1 (i) beskrevne metode for at sammenligne effektiviteten af de respektive ekstraktioner.

3q Ved lysozym-EDTA-metoden blandedes 2 g E. coli DHl/pTF4 celler vundet i eksempel 1 (i) med 16 ml af en opløsning (pH 7,0) indeholdende 0,1 M tris-HCl, 10 mmol EDTA og 250 mg/1 lysozym, blandingen omrørtes ved 4°C i 1 time og derefter ved 37°C i 5 minutter og lysatet centrifugeredes ved 28000 x g i 20 minut-

Ved ultralydsmetoden suspenderedes 2 g af de ovennævnte celler i 16 ml af en opløsning (pH 7,0) indeholdende 0,1 M

35 ter·

DK 164174 B

19 tris-HCl, suspensionen underkastedes ultralydbehandling ved 0°C i 5 minutter og lysatet centrifugeredes ved 28000 x g i 20 minutter.

Ved guanidin-HCl-metoden blandedes 2 g af de ovennævnte 5 celler med 16 ml af opløsninger (pH 7,0) indeholdende 0,1 M tris-HCl og 2M, 4m eller 7M guanidin-HCl, blandingerne omrør-tes ved 4°C i 1 time og lysaterne centrifugeredes ved 28000x g i 20 minutter. De på denne måde vundne ovenstående væsker brugtes ved måling af proteinkoncentration og IL-2 aktivitet.

10 Resultaterne er vist summarisk i tabel 2.

Tabel 2

Ekstraktion af IL-2 15 Ekstrakti- Proteinkon- IL-2 aktivitet Relativt onsmetode centration, i ekstrakten, forhold, mg/ml U/ml %

Lysozym-EDTA 5,40 3,3 0,02

Ultralydbehandling 6,54 2,2 0,01 20 2M Gu-HCl 2,60 46 0,2 4M Gu-HCl 4,12 144 0,8 7M Gu-HCl 7,22 19100 100

Gu-HCl: guanidin-hydroklorid 25 (iv) Den i eksempel 1 (ii) vundne ovenstående væske dialyseredes med 0,01 M tris-Hcl puffer (pH 8,5) og centrifugeredes 30 derefter ved 19000 x g i 10 minutter til frembringelse af 94 ml af en dialyseret ovenstående væske. Denne påførtes på en DE 52-kolonne (DEAE-cellulose fra Whatman i Storbrittanien) med et rumfang på 50 ml og ækvilibreret med 0,01 M tris-HCl puffer (pH 8,5)til proteinadsorption. Proteiner elueredes med en line-35 aer NaCl-koncentrationsgradient (0-0,15 M NaCl, 1 liter). De 20

DK 164174 B

aktive fraktioner, 53 ml, koncentreredes til 5,8 ml under anvendelse af en YM-5 membran ("Amicon" USA) og underkastedes gelfiltrering under anvendelse af en kolonne med et rumfang på 500 ml af "Sephacryl" ® S-200 (Pharmacia, Sverige), ækvilibre- 5 ret med 0,1 M tris-HCl (pH 8,0)-1 M NaCl puffer. De vundne aktive fraktioner (28 ml) koncentreredes til 2,5 ml under anvendelse af en YM-5 membran. Koncentratet påførtes en "Ultra-pore RPSC" (Altex, USA) kolonne til adsorption og der udførtes højtydende væskekromatografering under anvendelse af et tri-10 fluoreddikesyre-acetonitril-system som mobil. fase.

De anvendte betingelser var: kolonne: "Ultrapore RPSC"

(4,6 x 75 mm); kolonnetemperatur 30°C; opløsningsmiddel A 0,1% trifluoreddikesyre-99,9% vand; opløsningsmiddel B, 0,1% trifluoreddikesyre-99,9% acetonitril; elueringsprogram, minut 15 0 (68% A + 32% B) - minut 25 (55% A + 45% B) - minut 35 (45% A

+ 55% B)- minut 45 (30% A + 70% B) - minut 48 (100% B); elue-ringshastighed 0,8 ml/min; detektions-bølgelængde 230 nra. Der opsamledes en aktiv fraktion ved en retentionstid på ca. 39 minutter. Der vandtes på denne måde 10 ml af en opløsning inde-20 holdende 0,53 mg ikke-glykosyleret humantIL-2 protein (specifik aktivitet 30000 U/mg; aktivitetsudvinding fra udgangsmaterialet 30,6%; proteinets renhed 99%, bestemt ved densitometri på et SDS-polyakrylamidgel-elektroforetogram).

Frysetørring af den ovenfor beskrevne opløsning gav et 25 hvidt pulver. Pulveret havde en specifik aktivitet på 26000 U/mg.

(v) Det i eksempel 1 (iv) vundne humane IL-protein undersøgtes med hensyn til følgende egenskaber: 30 (1) Homogenitet:

Farvning med Coomassie brilliantblåt efter SDS-polyakryl-amid gel-elektroforese i henhold til Laemmli et al (Nature, 227, 680, 1970) viste kun et enkelt bånd af nævnte humane IL-2 25 protein (se fig. 5). Lokaliseringen af båndet holdt sig uændret under reducerende betingelser såvel som under ikke-redu-cerende betingelser.

21 (2) Molekylvægt:

Molekylvægten af det humane IL-2 protein beregnedes til at være ca. 15000 dalton, baseret på resultatet af SDS-poly-akrylamidgel-elektroforese, se fig. 5.

5 (3) Aminosyresammensætning:

En portion på 20 μg af dette humane IL-2 protein anbragtes i et reagensglas af glas til hydrolyse, der tilsattes konstant kogende saltsyre indeholdende 4% tioglykolsyre, glasset lukkedes derefter hermetisk i vakuum og der gennemførtes hydrolyse 10 ved 110°C i 24, 48 eller 72 timer. Efter hydrolysen åbnedes glasset, saltsyren fjernedes under nedsat tryk og remanensen opløstes i 0,02 N saltsyre og underkastedes aminosyreanalyse under anvendelse af en aminosyreanalysator Hitachi model 835.

Til bestemmelse af cystin og cystein oxyderedes det humane 15 IL-2 protein med permyresyre ved den metode der er angivet af Hirs (Methods in Enzymol., ljL, 197, 1967) efterfulgt af hydrolyse i konstant kogende saltsyre under nedsat tryk i 24 timer. Hydrolysatet underkastedes cysteinsyrebestemmelse ved hjælp af en aminosyreanalysator. De ved de forannævnte aminosyreanalyser 20 opnåede resultater er vist i tabel 3. Værdierne er alle gennemsnittet af tre værdier opnået efter henholdsvis 24, 48 og 72 timers hydrolyse undtagen for så vidt angår værdierne for serin og threonin, der bestemtes ved ekstrapolation til tid nul af hydrolysen.

25

Tabel 3

Aminosyre Mol, %

Asp/Asn 8,8 30 Thr 9,3

Ser 5,7 35 22

DK 164174 B

Tabel 3 (fortsat)

Glu/Gln 13/7

Pro 3,4 5 Gly 1,7

Ala 3,8 1/2 Cys 2,3

Val 3,1

Met 3,7 10 Ile 6,3

Leu 16,3

Tyr 2,3

Phe 4,5

Lys 8,3 15 His 2,5

Arg 3,1

Trp 1,1 1 (4) N-Terminal aminosyresekvens:

En portion på 34 μ9 af det humane IL-2 protein analyseredes med hensyn til den N-terminale aminosyresekvens ved at den underkastedes den automatiske Edman-nedbrydningsmetode under anvendelse af en gasfaseprotein-sekvenator (model 47OA,

£ J

Applied Biosystems, USA). Fenyltiohydantoin-aminosyrer (PHT-aminosyrer) identificeredes ved højtydende væskekromatografe-ring under anvendelse af en "Micropak"^ -SP kolonne (Varian, USA). Den eller de PTH-aminosyrer der opdagedes i hvert trin 30 fremgår af tabel 4.

Tabel 4

Trin Opdaget PTH-aminosyrer 1 Ala 35 Met 2 Pro

Ala 3 Thr

Pro 23

Tabel 4 (fortsat) 4 Ser

Thr 5 5 Ser 6 Ser 7 Thr 8 Lys 9 Lys 10 10 Thr 11 Gin 12 Leu 13 Gin 14 Leu 15 15 Glu 16 Y1 17 Leu 18 Leu 19 Leu 20 20 Asp endnu ikke identificeret (5) C-Terminal aminosyre: 25 En portion på 33pg af det humane IL-2 protein anbragtes i et reagensglas af glas til hydrazin-nedbrydning, der tilsattes 0,05 ml vandfrit hydrazin og glasset lukkedes hermetisk i vakuum og opvarmedes til 100°C i 6 timer. Det vundne hydrazin-nedbrydningsprodukt frysetørredes og opløstes i destille-20 ret vand. Der sattes benzaldehyd til opløsningen, blandingen omrørtes ved stuetemperatur i 1 time og derefter centrifugeredes den. Det på denne måde vundne vandige lag frysetørredes og underkastedes aminosyreanalyse ved hjælp .af en aminosyre analysator Hitachi model 835. Der konstateredes alene threonin. 25 (6) Tryptisk peptid-kortlægning:

En portion på 15μg af IL-2-prøven fordøjedes ved hjælp af 0,4 μg trypsin (Washington, USA) i 120 μΐ 0,02 M natrium- 24

DK 164174 B

hydrogenkarbonat ved 37°C i 18 timer. Derefter tilsattes der 5 μΐ 2-mercaptoætanol og reaktionen fortsattes ved 37°C i yderligere 2 timer. Derpå afsluttedes reaktionen ved tilsætning af 75 μΐ l%s trifluoreddikesyre. Højtydende væskekromato-5 grafering af reaktionsblandingen, der gennemførtes under de nedenfor anførte betingelser, førte til det kort der er vist i fig. 6. Kolonne: "Ultrasphere-Octyl" (5 μπι, 4,6 x 250 mm,

Altex, USA); Kolonnetemperatur 30°C: Mobil fase: Opløsningsmiddel A, 0,02% trifluoreddikesyre-99,98% vand, opløsnings-0 middel B, 0,02% trif luoreddikesyre-99,98% acetonitril; minut 0 (95% opløsningsmiddel A + 5% opløsningsmiddel B) - minut 40 (30% opløsningsmiddel A + 70% opløsningsmiddel B); strømningshastighed 1,0 ml/minutj opdagelse: fluorescensmetoden (Analytical Biochem, 6j7, 438, 1975) under anførsel af flures-^5 camin (Roche, USA).

(7) Aktivitet mod IL-2-afhængige cellelinier:

Bestemmelse af det ikke-glykosylerede humane IL-2 protein ifølge opfindelsen skete i overensstemmelse med den metode der er beskrevet i Biochem. Biophys. Res. Commun., 109, 20 363 (1982) viste at dette IL-2 protein havde en aktivitet så det fremmede optagelse af tritieret thymidin i en IL-2-afhængig musecellelinie (NKC3; jvf. fig. 7) såvel som i en IL-2-afhængig human cellelinie (se fig. 8).

Endvidere blev dette IL-2 protein opløst i et RPMI-1640 25 medium med 20% tilsat FCS til en koncentration på 0,5 U/ml, og der suspenderedes 2 x 10~* celler/ml af NKC3-cellelinien i mediet. Subkultur fortsattes på en "Linbro Multi dish" (Flow, USA) ved 37°C i nærværelse af 5% CO 2 mens tælling af de levedygtige celler gentoges og kulturen gensuspenderedes i et nyt, 30 frisk medium med mellemrum på 2 eller 3 dage. Som resultat heraf viste dette IL-2 protein sig at have en aktivitet der kunne opretholde væksten af NKC3-cellelinien i lang tid som det fremgår af fig. 9.

IC

Eksempel 2

Injektionspræparat

De.t i eksempel 1 (iv) vundne ikke-glykosyleret humant 25 IL-2 protein-indeholdende opløsning anbringes på en kolonne af "CM Toyopearl" (Toyo Soda, Japan) ækvilibreret med 0,025 M ammoniumacetatpuffer pH 5,0 under aseptiske betingelser til adsorption, efterfulgt af eluering med ovennævnte puffer in-5 deholdende 0,015 M NaCl. Eluatet fortyndedes ved tilsætning af en passende mængde 0,15 M NaCl hvorpå der tilsattes HSA til en koncentration på 0,5% og blandingen filtredes gennem et membranfilter med en porediameter på 0,22 pm. Filtratet fordeles aseptisk i portioner på 1 ml i ampuller efterfulgt af frysetørring. Det humane IL-2-præparat til injektion i hver ampul opløses i 1 ml destilleret vand til injektion forud for brugen.

15 20 25 30 35

Claims (8)

1. Et i det væsentlige rent, ikke-glykosyleret humant 5 interleukin-2-protein med en specifik aktivitet på ikke under 104 U/mg, kendetegnet ved, at det har en renhed på ikke under 99%, udviser et enkelt bånd ved SDS-polyakrylamidgel-elektroforese-analyse under både reducerende og ikke-reduce-10 rende betingelser og er i det væsentlige frit for endotoxin og i det væsentlige frit for pyrogen.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af det i krav 1 angivne, i det væsentlige rene, ikke-glykosylerede humane inter-leukin-2-protein med en specifik aktivitet på ikke under 104

15 U/mg, kendetegnet ved, at man dyrker en transformant af Escherichia coli, som bærer et DNA med. en basesekvens, der koder for humant interleukin-2 til bevirkning af produktion og akkumulering af humant interleukin-2 i dyrkningssuppen, 20 hvorpå man underkaster den derved vundne humant interleukin- 2-indeholdende væske en rensningsproces som udnytter HPL-kromatografering under anvendelse af en reversfase kolonne.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at kromatograferingen udføres 25 under anvendelse af en eluent med pH 1,5 til 8.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at kromatograferingen udføres under en strømningshastighed på 0,1 til 100 ml/min.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 2, 30 kendetegnet ved, at det humane interleukin-2 frembringes og akkumuleres i de dyrkede transformant-celler, hvorpå det humane interleukin-2 ekstraheres fra cellerne til frembringelse af en humant interleukin-2-indeholdende væske.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, 35 kendetegnet ved, at det humane interleukin ekstraheres med en opløsning af et proteindenaturerende middel.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det humane interleukin-2 ekstraheres med en opløsning af et guanidinsalt i en koncentration på 2 til 8 M.

8. Farmaceutisk præparat, fortrinsvis i fom af et inji-cerbart præparat, 5 kendetegnet ved, at det indeholder et i det væsentlige rent, ikke-glykosyleret human interleukin-2- prote- . 4 in med en specifik aktivitet pa ikke under 10 U/mg som angivet i krav 1 sammen med en farmaceutisk acceptabel bærer, excipient eller fortyndingsmiddel derfor. 10