CN86104525A

CN86104525A - 人类白细胞介素-2的分析方法和试剂

Info

Publication number: CN86104525A
Application number: CN198686104525A
Authority: CN
Inventors: 守谷教彦; 加藤光一; 西村纪
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1985-07-31
Filing date: 1986-07-22
Publication date: 1987-02-25
Also published as: JPH07111426B2; KR870001470A; JPS62135770A; EP0210839A1

Abstract

一种免疫酶标夹心方法测定人类白细胞介素-2，要比生物测定的灵敏度明显提高。所述的夹心方法中，抗重组人白细胞介素-2的抗体是来源于温血动物的抗体或其片段。

Description

本发明涉及人类白细胞介素-2的分析方法和试剂。

白细胞介素-2（以下简称为IL-2）是经植物凝集素或抗原刺激后由T细胞产生的一种淋巴细胞活素。一些报导表明IL-2具有以下生物活性，如胞毒T-细胞的诱导;脾脏B细胞抗体产生的诱导;天然杀伤细胞的激活以及在体外刺激T细胞的长期生长。这些生物活性的具备使得IL-2在治疗免疫缺乏疾病和癌症的临床应用方面引起了人们的关注。然而，由于通过细胞培养的方法所产生的IL-2极少，使得在高剂量时它的临床效果的检验进展很慢。而重组DNA技术的迅速发展，使大规模生产重组IL-2（以下简称r L-2）在最近成为可能，这样IL-2效果的检验便开始了。

传统的IL-2生物活性的测定方法是用生物测定法〔Biochemical Biophysical Research Communications 109，363（1982）〕，用该方法测定血液中IL-2的浓度极限是1至10μg/ml。然而，由于IL-2在极微量时即可表现出其生物活性。因此急需一种比上述方法准确度更高的生物测定方法。

发明者致力于发展一种高灵敏度高准确度的测量人类IL-2的方法，并发现可以用免疫酶标的分析方法（EIA）达到此目的。该方法所用抗IL-2的抗体是通过重组人类IL-2免疫动物而得到的，其测量的灵敏度要比过去的生物测定法有很明显的提高，在这一发现基础上的进一步研究即导致了本发明。

本发明的内容是：

（1）一种测量人类白细胞介素-2的分析方法。该方法是将样品用夹心免疫酶标测定法进行分析。所用试剂包括固定在载体上的抗体、抗原及用标记物标记的抗体，其中固定在载体上的抗体及标记抗体或其片段是来源于温血动物的抗重组人类白细胞介素-2的抗体。

（2）一种通过夹心方法的人类白细胞介素-2的免疫化学分析法测定药盒，其中包括：（a）一种由温血动物产生的抗重组的人白细胞介素-2的抗体或其片段。

（b）一种由温血动物产生的抗重组人类白细胞介素-2的抗体或其片段与标记试剂的连接。

（3）一种由温血动物产生的抗重组的人白细胞介素-2的抗体或其片段。

（4）一种由温血动物产生的抗重组的人白细胞介素-2的抗体或其片段与标记试剂的连接。

该夹心方法所用的温血动物产生的抗重组的人白细胞介素-2的抗体是通过以重组的人白细胞介素-2为抗原免疫温血动物产生的。

在本发明说明书中，固定在载体上的抗体称为第一抗体，而用标记物标记的抗体称为第二抗体。

用重组的人白细胞介素-2作为抗原时应考虑到用基因工程技术生产的一些肽类具有与天然白细胞介素-2相似的生物活性或免疫活性，或具有与IL-2受体或抗IL-2抗体的结合活性。

就重组的人IL-2来讲，与其有关的一些肽类有：多肽（Ⅰ）〔PCT/JP84/00460说明书的例1。（申请日：1984年9月26日）相应于1986年4月2日公开的EPC专利第176299号〕该多肽是用基因工程技术生产的，其氨基酸顺序如图1所示，其中对其生物和免疫活性必需的氨基酸序列的片段也可应用。

作为重组的人白细胞介素-2，包括在氨基端缺少一个氨基酸的多肽（Ⅰ）片段（EPC专利公开第91539号）;在氨基端缺少4个氨基酸的多肽（Ⅰ）片段（日本专利公开第126088/1985号）;及在羧基端缺少几个氨基酸的多肽（Ⅰ）片段。

进一步，作为重组的人IL-2，所提到的多肽还有的是通过去除或替换其它氨基酸，如上述提到的多肽（Ⅰ）中的一些组成氨基酸而得到的。例如，将多肽（Ⅰ）中第125位的半胱氨酸残基换成丝氨酸残基（日本专利第93093/1984号，相应于美国专利第4518584号）。

所述的多肽在其氨基端可以有一个甲硫氨酸，而所述多肽及在氨基端含有一个甲硫氨酸的多肽的混合物均可以使用。

作为温血动物，建议不要用人，已提到的动物有：兔子、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、豚鼠、牛、马和猪等，鸟类有：鸡、鸽子、鸭、鹅、及鹌鹑等。

重组的人IL-2作为抗原其剂量是根据所用动物抗体产生的有效范围来确定。建议用0.1至10mg的重组的人IL-2，例如兔子用1mg，山羊用4mg，与Freund氏完全佐剂混合，通过背部或后足底部的皮下注射或肌肉内注射等方法给药，每2周给1至10次。产生的抗人IL-2抗体，可从处理动物的血液经离心后所得到的血清中获得。（若用兔子作材料，一般是在免疫7至12天后从其耳静脉中收集血液）例如，得到的血清先用硫酸铵盐析，产生的沉淀通过离心收集后溶于硼酸缓冲液或其它溶液中。得到的溶液再经过一个接有r L-2载体的亲和析层柱分离〔日本专利申请176306/1984号说明书（申请日1984年8月23日），相应于1986年3月17日公开日本专利第53300/1986号〕，即可得到纯化的抗体。

通过上述步骤可得到第一抗体及第二抗体。最好用两种不同的动物免疫以产生第一抗体或第二抗体。山羊等可产生相对大量的抗体，建议用来产生第一抗体。而兔子等建议用来产生第二抗体。

这样获得的抗体其抗体效价为10⁴至10⁶或更多（EIA方法），这样获得的抗体也可识别天然的人白细胞介素-2。

作为标记抗体的第二抗体最好首先用以下方法处理：抗体首先通过传统方法用胃蛋白酶局部消化除去其不变区，产生抗体片段F（ab′）2′，后者通过还原产生抗体片段Fab′。

作为抗体片段，提到的有F（ab′）2及Fab′。片段F（ab′）2是通过传统的胃蛋白酶降解抗体得到的。片段Fab′是通过传统方法还原片段F（ab′）2得到的。胃蛋白酶降解及还原方法是根据已述的方法，例如在应用生物化学学报（Journal of Applied Biochemistry，4，41-57（1982）上的方法进行的。在此处所用的夹心方法中，抗体与标记试剂的连接是通过将抗体与标记试剂在pH6到8的缓冲液中于10℃～55℃条件下反应10分钟到24小时产生的。

作为标记试剂，应提到的是标记酶，例如过氧化物酶〔如辣根过氧化物酶（以下简称为HRP）〕，苹果酸脱氧酶及β-半乳糖苷酶，以上所提到的标记酶中以辣根过氧化物酶为最好。

所用酶可以做成顺丁烯二酰亚胺的形式以使反应能温和地进行。（日本专利公开第90054/1984号，相应于EPC专利公开第1098078号）。

连接反应按如下方法进行。首先，标记试剂如反应式：

其中n为0至5的整数，R为一个化学键或二价的6元碳氢环，（如1，2-，1，3-和1，4-环己烯，1，2-，1，3-和1，4-亚苯基）。

所示的化合物在pH6～8的缓冲液中于10℃～55℃反应10分钟到24小时。缓冲液是如0.1M磷酸缓冲液（pH7.0）或0.05M的磷酸缓冲液（pH6.3）。

这样获得的顺丁烯二酰亚胺化的标记试剂可通过如凝胶层析的方法纯化。适合于所述凝胶层析用的填充物有Sephadex G-25（Pharmacia Fine Chemical瑞典）或Biogel P-2（Bio- Rad Laboratories，美国）等等。

顺丁烯二酰亚胺化的标记试剂与第二抗体进行反应的范例如下所述：第二抗体或其片段在巯基乙醇胺的存在下被还原，未参与反应的物质通过凝胶过滤除去。得到的抗体或其片段再与顺丁烯二酰亚胺化的标记试剂反应。

所述的反应可通过将二种反应物在0℃至40℃的缓冲液中互相接触1至48小时而完成。所述的缓冲液如含有5mM的乙二胺四乙酸钠的0.1M的磷酸缓冲液（pH6.0）。

这样产生的标记抗体可通过如凝胶层析的方法纯化。作为凝胶层析所用的填充物除其它以外需要提到的如Ultrogel ACA44（LKB，瑞典）或Sephacryl S-200（Pharmacia Fine Chemical，瑞典）。

特别提到，当过氧化物敏作为标记敏时，反应按如下方法进行：

过氧化物酶（如辣根过氧化物酶）按约2∶20∶1的重量比加到抗体中，混合物在缓冲液中，于0至40℃反应1至48小时。可用的缓冲液包括含有5mM乙二胺四乙酸钠的0.1M的磷酸缓冲液（pH6.0）。产生的过氧化物酶标记的抗体，经凝胶过滤纯化后，作为第二抗体。

目前测定人类IL-2的方法是根据传统的免疫酶标夹心方法的原理及过程而发展的。

夹心法的操作过程在酶学方法（Methods in Enzymology 84，26（1982）〕;免疫方法学报〔Journcl of Innunological Methods，8，223（1975）〕，及EPC专利公开〔EPC Patent Publicatioys No49898，No88368及No109078〕中都有叙述。

根据本发明的夹心法可举例如下：

首先将抗体吸附于免疫盘中，并用牛血清白蛋白处理。样品液（如血液、血清、血浆、尿、胸膜液、骨髓液及各种器官提取液等）加入后再加入第二抗体和标记酶以使反应进行。然后加入一种标记酶的底物（如含有过氧化氢的邻苯二胺水溶液）于反应产物中测量产物的吸收值。根据与事先制作的标准物吸收曲线（见图2）相比较计算产品溶液中IL-2的含量。本方法最小可测到10至40pg/ml的IL-2。

下面，以测定cynomolgus猴静脉血中的IL-2为例更详细地叙述测定人IL-2的本方法。

将r L-2通过静脉给药的方法，以0.2至100μg/0.5ml/Kg的剂量处理每一个cynomolgus猴（雌性，2.5至4公斤，每组三个猴）。在注射5，15，30分钟及1，2，4，6，24小时后收集动物血液1至5毫升。每个血样品在室温放置3至5小时后，3000转/分离心10分钟，分离血清，并将每个样品按1/5，1/10，1/50，1/100，1/300及1/1000的比例用小牛血清稀释。每个稀释样品按如下方法测量其IL-2的含量：将100μl抗r L-2的山羊Ig G溶液（蛋白含量为15μg/ml）放到免疫盘（Nunc Inc）的小池中，4℃放置16至20小时。吸走溶液后小池用300μl PBS洗3次，然后加入200μl 1%的牛血清白蛋白溶液，置4℃16到20小时后，小池再用PBS洗涤。然后加入100μl r L-2溶液或稀释的样品液，4℃放置16至20小时后用PBS洗涤小池5次。然后加入100μl抗r L-2的兔Fab′-HRP溶液，室温放置4小时，小池再用PBS洗后加入100μl底物溶液室温下置黑暗中保温20至40分钟以使反应进行。反应通过加入100μl 2M的硫酸溶液而终止，然后用Titertek MultiskanMc测量产物在492nm处的吸收值。每一样品中r L-2的浓度通过其与图2所示标准曲线吸收值的比较而计算得到。给药的结果如图4所示。（r L-2剂量为100μg/0.5ml/kg）。

该结果表明本方法可以以高于生物测定100倍或更多的灵敏度来测量血液中r L-2的浓度。因此可以肯定本方法提供了一个有用的测定临床样品（如血液、血清、血浆、尿、胸膜液骨髓液等）中的IL-2的含量及检验IL-2在组织及器官中分布的方法。

特别是当使用以r L-2为抗原而制备的抗体时，更准确的IL-2测定由于抗体特性的准确度而成为可能。

测定人IL-2的夹心法分析药盒及分析程序举例如下：

1.测定试剂

（1）稀释缓冲液

新生小牛血清（在56℃处理30分钟）……100ml

乙基汞硫代水杨酸钠……0.01g

用0.02M磷酸缓冲液-盐pH7.0（PBS）

稀释至1升，于4℃贮存。

（2）牛血清白蛋白（BSA）溶液

牛血清白蛋白……10g

乙基汞硫代水杨酸钠……0.01g

溶于1升PBS中，56℃处理30分钟，于4℃贮存。

（3）抗r L-2山羊Ig G（第一抗体）

使用前将贮液用稀释缓冲液稀释至15μg Ig G/ml。

（4）连接过氧化物敏的抗r L-2的兔Fab′（第二抗体）

使用前用稀释缓冲液将贮液稀释到3.5μg蛋白/ml

（5）底物缓冲液

向含有0.01%乙基汞硫代水扬酸钠的100ml

0.1M草酸缓冲液pH5.5中加入66μl

30%的H₂O₂溶液，并贮存于4℃。

使用时先用100ml该溶液溶解44mg邻苯二胺即制成底物溶液。

（6）r L-2标准溶液

将r L-2贮液用稀释缓冲液稀释成

0.04单位/毫升。稀释液按1ml/每瓶分装于-20℃保存。

2.测定程序

（1）取100μl按1∶25用PBS稀释的抗r L-2山羊Ig G溶液（15μg/ml）置Nunc免疫盘的每一个小池中，置4℃放置16～24小时。

（2）弃去溶液并用PBS（每个池用300μl）洗3次。

（3）每个池中加入200μl BSA溶液，置4℃放置16～24小时。

（4）弃去溶液并用PBS（300μl）洗盘3次。

（5）加入100μl待测血清或r L-2标准溶液（0.001，0.002，0.004，0.008，0.012，0.016或0.02单位/毫升）：置4℃放置16～24小时。用稀释缓冲液稀释待测血清及r L-2。

（6）弃去溶液，用PBS（300μl）洗盘5次。

（7）加入100μl连接有过氧化物酶的抗r L-2兔Fab′（与稀释缓冲液之比为1∶50），室温放置4小时。

（8）弃去溶液，用PBS（300μl）洗盘5次。

（9）加入100μl底物溶液，在黑暗中室温作用30分钟。

（10）加入100μl 2MH₂SO₄终止酶反应。

（11）在Titertek Multisken上测量样品在492nm处的光密度。

（12）通过标准曲线计算r L-2浓度。

本测定方法提供了一个比生物测定法灵敏度更高的方法。该方法比生物测定法的灵敏度高出约100倍。此外该方法的测量值与生物测定法测量值之间的相关系数也很高，达0.999，因此，可以认为该方法准确反应了真实的样品生物活性。（图3）

在观察人白细胞介素-2加到血清中之后的回收实验中，检验该方法中样品血清含量的影响。结果表明，当血清浓度为40%或较少时，不会对测定数据产生有害影响。

本法也可以测定天然的人白细胞介素-2。

以超过传统方法的灵敏度，本法所测定人IL-2可以准确地将人IL-2作为蛋白而识别，从而进行准确测定。因此该方法对测定临床样品等其它样品中极少量的IL-2特别有用。

图示的简要说明：

图1表示重组人IL-2的氨基酸序列的一例。

图2表示在实施例4中测量重组IL-2及天然IL-2的结果。

图3表示在参比实施例2中获得的本测定方法与生物测定法相关性。

图4表示实施例5中获得的cynomolgus猴血中r L-2浓度的测量结果。

图5表示通过参比实施例3中获得的经过灭活处理的重组IL-2的测定结果。

在图1中氨基酸的简写是根据IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的或有关领域常用的写法。其中氨基酸都是L-型。

本发明通过以下参比实施例及实施例对之进行更详细的叙述。应记住本发明并不局限于这些。

以下材料在下述参比实施例和实施例中要用到：

r L-2：根据实施例6中描述的方法产生的。实施例6见日本专利公开第115528/1985号，相当于EPC专利公开第145390号。三种蛋白浓度0.75，1.195，及1.25mg/ml（5mM醋酸铵pH5.0）被用到。

牛白蛋白溶液：牛白蛋白（Cohn第5组分，由日本Daiichi Kagaku提供）溶解在含有0.145M氯化钠的0.02M磷酸缓冲液（pH6.8以下简称PBS）中，至浓度为1%，然后于56℃加热30分钟。加入乙基汞硫代水杨酸钠（Sigma Ina）至浓度为0.001%，配好的溶液贮存于4℃。

小牛血清溶液：新生小牛血清（M.A.Bioprochuct Inc）于56℃加热30分钟立即通过滤纸（Toyo Filter No 5C）过滤。滤出液溶于0.02M PBS中至浓度为10%。然后加入乙基汞硫代水杨酸钠至0.001%，配得的溶液贮存于4℃。

辣根过氧化物酶结合的抗兔Ig G（简称为抗兔Ig G-HRP（Miles-Yeda Inc.）在用小牛血清液稀释1/40000倍后再应用。

辣根过氧化物酶结合的抗山羊Ig G（简称为抗山羊Ig G-HRP）：抗山羊Ig G-HRP（Cappel Inc.）在用牛血清液稀释1/40000的浓度后再用。

蛋白含量测定：蛋白浓度用蛋白分析药盆（Bio-Rad Laboratories Ltd）及牛血清白蛋白（Sigma Inc.）作为标准测定。

底物溶液：30%的过氧化氢水溶液加到含0.01%乙基汞硫代水杨酸钠，pH5.5的0.1M草酸缓冲液中，然后贮存于冰箱中。在即将试验前，将邻苯二胺溶于上述溶液中至40mM。

参比实施例1（固相r L-2的生产）

1克用溴化氰活化的Sepharose 4B（Pharmacia AB）置于玻璃滤器中用20ml0.001N的盐酸充分溶胀，然后用200毫升0.001N的盐酸液充分洗涤。此外，向10mlr L-2溶液（蛋白含量为1.25mg/ml）中加入1ml 1M的硼酸钠溶液，用1N的氢氧化钠调至pH8.4。得到的溶液加入上述处理的溴化氰激活的Sepharose 4B，混合物置4℃16小时以使反应进行。反应完成后得到的凝胶置于玻璃滤器中用100ml 0.1M的硼酸钠溶液洗涤。洗好的凝胶加到10ml含有1M乙醇胺的0.1M硼酸钠溶液中，4℃放置2小时并慢慢搅拌以使封闭余下的活性基团进行反应。然后依次用100ml 0.1M硼酸钠，100ml其中含有1M氯化钠的0.1M醋酸钠溶液（pH4.0）及100ml含有1M氯化钠的硼酸缓冲液（pH8.0）、来洗涤凝胶。洗好的凝胶悬浮于0.02M硼酸缓冲液中状柱并置4℃保存。该柱的r L-2的吸附量约11mg。

实施例1（抗-r L-2山羊Ig G的生产）

（a）抗-r L-2山羊血清的生产

4ml r L-2溶液（蛋白含量0.75mg/ml）与4ml Freund氏完全佐剂（Difco Laboratories Inc.）一起混合。得到的溶液通过肌肉给药处理山羊，两周的时间内处理7次，然后收集山羊血液。该血液在室温放置5小时、4℃放置16小时后于3000转/分离心10分钟，得到的上清即抗-r L-2山羊血清。

（b）抗-r L-2山羊Ig G的生产：

将20毫升通过程序（a）获得的抗r L-2山羊血清置于烧杯中，在搅拌中加入硫酸铵至饱和浓度40%，置4℃放16小时，得到的溶液于10，000rpm离心10分钟，得到上清及各种沉淀，除去上清后的沉淀溶于35ml 0.02M硼酸缓冲液（pH8.0）中，然后在同样的缓冲液中用Spectropore膜（Spectrum Medical Inc.）于4℃透析16小时，然后于10，000rpm离心10分钟，从上清中除去沉淀，得到的50ml上清分为两份并通过一个装有通过参比实施例1中过程而得到的固相化r L-2的凝胶柱。然后用0.02M硼酸缓冲液（pH8.0）充分洗柱并用0.1M醋酸缓冲液（pH4.5）洗柱直至洗出液在280nm波段的吸收消失。洗好的柱用0.2M的甘氨酸盐酸缓冲液洗脱，得到的洗脱组分立即加入1/10体积的1M Na₂HPO₄，得到的溶液用1N氢氧化钠调至pH7后即在0.02M硼酸缓冲液（pH8.0）中于4℃透析16小时。然后于10，000rpm离心10分钟，得到的上清即抗-r L-2山羊Ig G，加入乙基汞硫代水杨酸钠至0.001%后，置4℃保存。

（c）抗-r L-2山羊Ig G特性

（1）蛋白含量为0.1至0.8mg/ml

（2）抗体效价为10⁴至10⁶或更高（EIA方法）

（3）纯度为80至90%或更高

实施例2（抗r L-2）兔Ig G的生产）

（a）抗r L-2兔血清的生产：

1ml r IL-2（蛋白浓度为1.195mg/ml）与1ml Freund氏完全佐剂混合。产生的混合物通过肌肉内给药方法注射到实验兔子（雄性，Rabbiton stock Farm）的背部及大腿，2周内处理三次，在最后一次注射的一周之后，从中央耳静脉收集血液，置4℃，16小时后，于3000rpm离心10分钟，得到的上清即抗-r L-2兔血清。

（b）抗-r L-2兔Ig G的生产：

抗-r L-2兔Ig G的生产与实施例1（b）中所述方法相同。

（c）抗-r L-2兔Ig G的特性：

（1）蛋白含量为0.1至0.8mg/ml

（2）抗体效价为10⁴至10⁶或更高（EIA方法）

（3）纯度为80%至90%或更高。

实施例3

（抗体与过氧化物酶连接物的生产）

（a）抗-r L-2兔Fab′片段的生产：

用火棉胶袋（Sartorius Inc.）将实施例2（b）中获得的28ml抗-r L-2兔Ig G浓缩至约1.5ml得到的浓缩液再在0.1M醋酸缓冲液（pH4.5）中于4℃透析16小时，再于10，000rpm离心10分钟，从上清中除去沉淀。上清中加入120μg胃蛋白酶后置37℃保温16小时以便反应进行。向反应液中加入200μl 0.2M的Na₂HPO₄后，用1N氢氧化钠溶液调pH至8.0，并通过Sephadex G-150柱（柱大小为，1.5×45cm）进行凝胶过滤，得到的溶液即含有抗体片段F（ab′）。该溶液用火棉胶袋在4℃浓缩至约1.5ml，浓缩液再于0.1M醋酸缓冲液（pH5.0）中，置4℃透析2小时。得到的透析液，加入0.4M的2-巯基乙醇胺至终浓度为20m M后，置37℃保温90分钟以使反应进行。反应液通过一个Sephadex G-25（Pharmacia AB）层析柱（1.0×80cm）后，用含有5mM乙二胺四乙酸钠的0.1M磷酸缓冲液（pH6.0）作为洗脱液进行段分离，得到的光吸收在280nm波长的抗-r L-2Fab′保存在4℃。

（b）顺丁烯二酰亚胺化辣根过氧化物酶的生产：

将10mg辣根过氧化物酶（简称HRP，可从Bochring Mannhein AG获得）溶解在1.4ml 0.1M的磷酸缓冲液（pH6.8）中，得到的溶液加入100μl含于4.18mg N-羟基琥珀酰亚胺N-环己基甲基顺丁烯二酰亚胺碳酸的N-二甲基-甲酰胺溶液，室温放置1小时使反应进行。反应液于2500rpm离心10分钟得到上清。上清经过Sephadex G-25层析（1.0×80cm），用0.1M磷酸缓冲液（pH6.8）作为洗脱液，得到主要成分即顺丁烯二酰亚胺化辣根过氧化物酶。

（c）抗-r L-2兔Fab′辣根过氧化物酶连接物

（抗-r L-2兔Fab′-HRP）的生产：

将（a）和（b）中分别获得的抗-r L-2兔Fab′和顺丁烯二酰亚胺辣根过氧化物酶混合在一起，用火棉胶袋在4℃将其浓缩至约1ml。得到的浓缩液置4℃20小时以使反应进行。反应液经过Ultrogel Ac A44（LKB Inc）层析柱（1.0×80cm）并用0.1M磷酸缓冲液作为洗脱液进行洗脱，得到的活性组分加入牛白蛋白至0.1%，乙基汞硫代水杨酸钠至0.001%于4℃贮存。

实施例4

（血清r L-2浓度的测定）

首先将从实施例1（b）中获得的100μl抗-r L-2山羊Ig G溶液（蛋白含量：15μg/ml）放在免疫盘（Nunc.Inc.）的小池中，置4℃16到20小时。除去溶液后将小池用300μl PBS洗三次，然后加入200μl 1%牛血清白蛋白溶液，于4℃放置16至20小时，再用PBS洗小池后加入100μl r L-2溶液或用小牛血清稀释的样品溶液，置4℃16至20小时，再用PBS洗小池后加入100μl从实施例3（c）中获得的抗-r L-2兔Fab′-HPR溶液，室温放置4小时后再用PBS洗小池，然后加入100μl底物溶液，于黑暗中在室温放置20至40分钟以使反应进行。加入100μl 2M的硫酸溶液终止反应后，用Titertek Multiskan Mc（Flow Laboratories Inc.）在492nm处测量每一个样品的吸收值。结果如图2中-O-所示。

天然IL-2浓度的测量与上述方法相同。所用的天然IL-2是根据Biochemical and Biophysical Research Communication vol.127，No1.page180-190（1985）中所述的方法生产的。

天然IL-2的测量结果如图2中-●-所示。

实施例5

（通过静脉注射r L-2后的cynomolgus猴血液中r L-2浓度的测定）

r L-2按100μg/0.5ml/kg的剂量通过静脉注射给cynomolgus猴（雌性，2.5至4公斤重，3只猴一组）注射5、15、30分钟，1，2，4，6和24小时后收集3ml猴血。每个血样品在室温放置3小时后于3000rpm离心10分钟，分离样品血清。r L-2的测定按实施例4中所述的方法进行。结果如图4所示。

参比实施例2

（生物测定法与本方法测量数据的相关性）

r L-2按浓度为3.75，7.5，15，30和60ng/ml加入到含有20%胎牛血清的RPM I-1640培养基中。培养基中r L-2的浓度分别按照实施例4中的方法和Biochemical and Biophysical Research Communications Vol.109，No2，pp363～369（1982）中所描述的生物测定方法进行测定，结果如图3所示。

结果在5次重复实验（n＝5）中，二种方法的相关系数（r）为0.999。相关性用线性方程Y＝1.02X+1.04表示。

参比实施例3

含有145至170μg/ml r L-2的样品在pH12，37℃处理5，15，30分钟及1，2，3小时，或同样的样品在75℃处理0.5，1，2和5小时。

这样得到的产物按实施例4中的夹心方法及参比实施例2中的生物测定法进行测量。

结果如图5所示。在22次实验（n＝22）中，二种方法之间的相关系数（r）为0.989，其相关关系用线性方程Y＝1.06X+3.74表示。

Claims

1、一种测定人白细胞介素-2的方法，其特征在于，对样品用酶标免疫法反应，所用材料包括一种固定于载体上的抗体，一种抗原及一种用标记试剂标记的抗体，其中固定于载体上的抗体及标记抗体是源于温血动物的抗重组人白细胞介素的抗体或其片段。

2、根据权项1所述的分析方法，其中重组人白细胞介素-2是一种如图1中所示氨基酸序列的多肽。

3、根据权项1所述的分析方法，其中的片段是抗体片段Fab′。

4、根据权项1所述的分析方法，其中抗体是经过亲合层析纯化的。

5、根据权项1所述的分析方法，其中标记试剂为辣根过氧化物酶。

6、一种用于夹心方法测量人白细胞介素-2的免疫化学分析药盒，它包括：

（a）来源于温血动物的抗重组人白细胞介素-2的抗体或其片段，

（b）一种来源于温血动物的抗重组人白细胞介素-2的抗体或其片段与标记试剂的连接物。

7、根据权项6所述的分析药盒，其中重组人白细胞介素-2是一种含如图1所示那样氨基酸序列的多肽。

8、根据权项6所述的分析药盒，其中片段为抗体Fab′片段。

9、根据权项6所述的分析药盒，其中抗体是通过亲和层析纯化的。

10、根据权项6所述的分析药盒，其中标记试剂为辣根过氧化物酶。

11、一种来源于温血动物的抗重组人白细胞介素-2的抗体或其片段。

12、根据权项11中所述的抗体，其中重组的人白细胞介素-2是含如图1所示氨基酸序列的多肽。

13、根据权项11所述的抗体，其中的片段为抗体片段Fab′。

14、根据权项11所述的抗体，其中抗体是通过亲和层析纯化。

15、一种来源于温血动物的抗重组人白细胞介素-2的抗体或其片段与标记试剂的连接物。

16、根据权项15所述的连接物，其中重组人白细胞介素-2是一种含图1所示那样氨基酸序列的多肽。

17、根据权项15所述的连接物，其中片段为抗体片段Fab′。

18、根据权项15所述的连接物，其中抗体通过亲和层析纯化。

19、根据权项15所述的连接物，其中标记试剂为辣根过氧化物酶。