CN1099894C - 引发抗ｎ－羟乙酰化神经节苷脂免疫反应的疫苗组合物及其应用 - Google Patents
引发抗ｎ－羟乙酰化神经节苷脂免疫反应的疫苗组合物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及肿瘤的活性特异性免疫治疗领域，其中提供了用于产生或增加抗N-羟乙酰化神经节苷脂，特别是抗N-羟乙酰GM3(NGcGM3)之抗体免疫反应的、可用于预防和治疗肿瘤的疫苗组合物。
Description
本发明涉及肿瘤的活性特异性免疫治疗领域，其中提供了用于产生或增加抗N-羟乙酰化神经节苷脂，特别是抗N-羟乙酰GM3(NGCGM3)之抗体免疫反应的、可用于预防和治疗肿瘤的疫苗组合物。
神经节苷脂是含有唾液酸并在所有哺乳动物细胞膜中表达的鞘糖脂。它们包含糖极性部分和疏水N-脂酰鞘氨醇(鞘氨醇和长链脂肪酸)。
这些化合物插入到脂质双层中，使留下寡糖链的外细胞膜暴露于外部环境。
神经节苷脂表达随着细胞分化阶段和生长方式的不同而变化。在致癌转化期间发生的分化和去分化与神经节苷脂分布的改变有关。
此外，哺乳动物组织中某些神经节苷脂的表达是受到种的限制的。这些神经节苷脂(称为嗜异物)含有N-羟乙酰神经氨酸，并存在于除人和鸡以外的大多数种中(小鼠、大鼠、狗、马、猪等)。
N-羟乙酰化神经节苷脂的这种“非自身”特征对于这些化合物在人体内的免疫原性具有很重要的影响。这一事实是在20年代由Hanganatziu和Deicher(H-D)间接地观察到的，当时曾普通使用马血清治疗某些疾病。
这些病人发生了称为血清病的疾病。显示他们的血清可与马抗血清的成分及不同种的红细胞发生反应。
后来作为马红细胞神经节苷脂提取了这些H-D抗原并将它们的主要抗原决定基限定为NGCNAd(2→3)Galβ(1→4)GlC(1→R)。
用培养的人肿瘤细胞和H-D抗血清进行的实验证明，在一组人肿瘤中存在这些抗原。因此，看来似乎已发现了肿瘤特异性抗原。
最近使用借助疏水或共价键与其他载体，如脑膜炎双球菌的OMPC(外膜蛋白质复合物)偶联的GD3进行的小鼠体内免疫原性实验，并没有成功地改善抗神经节苷脂之抗体反应的性质。
GD3的“自身”抗原特性，可能是以与T细胞依赖性抗原相似的特征阻碍免疫反应的主要原因(Livingston et al.，(1993)Vaccinell，1199-1204)。
了解了嗜异抗原之免疫原性的优点和其在乳腺肿瘤中的表达后，推测以N-羟乙酰化神经节苷脂为基础的治疗疫苗在人乳腺癌的治疗中可能是有效的。
鉴定适当的抗原来源对于疫苗开发是很重要的。尚未描述具有这种特性的天然来源的N-羟乙酰化神经节苷脂。
另一方面，已报导了N-羟乙酰化神经节苷脂衍生物的总体合成(Ogawa et al.，美国专利4,950,750号)。但这种代用品作为疫苗的抗原来源使用是有问题的，即所得到的抗神经节苷脂衍生物的抗体一般都不识别原有的神经节苷脂。
然而，本发明提供了一种适用的天然抗原来源。GN3和NGCGM3是用于工业化生产mAbs的杂交瘤细胞中的主要神经节苷脂，这对于治疗疫苗的可行性是一个重要事实。
在结合的疫苗中使用单克隆抗体作为蛋白质载体在以前几乎是没有的，而且在肿瘤治疗疫苗中也未曾使用，然而使用它们作载体却具有免疫定靶和激活宿主免疫系统的优点。
本发明提供了刺激或增强抗N-羟乙酰化神经节苷脂免疫抗体反应的疫苗组合物。
因此，本发明的目的是提供一种预防或治疗肿瘤的疫苗组合物，其含有与适当的载体偶联的(通过疏水或共价键)，有效量的纯N-羟乙酰化神经节苷脂，主要是NGCGM3和/或其衍生物和/或其相应的寡糖，并含有例如可以是天然来源的佐剂或单克隆抗体(mAb)。
后来使用无牛血清培养基进行细胞培养实验，并借助气相色谱-质谱技术检测肿瘤活组织之神经节苷脂提取物中与脂质结合的NGCNA的存在，结果显示所研究的样品中N-羟乙酰化神经节苷脂的水平低于总唾液酸的0.05％(Furukawa et al.，(1988)J.Biol.Chem，263，18507)。
从上述结果可以看出，N-羟乙酰化神经节苷脂作为肿瘤免疫治疗的靶没有实际价值。
然而本发明中显示，乳腺癌似乎是一个例外。N-羟乙酰化神经节苷脂是以相对大的量存在的(古巴专利申请131/93号)。
已在肿瘤，主要神经外胚层衍生的肿瘤治疗探索中使用肿瘤相关神经节苷脂作为靶(Gangliosides and Cancer，Ed.H.F.Oettgen(1989).P.7)。
这些手段总地是基于两个原则：用特异性mAb进行被动免疫治疗和用所提到的神经节苷脂进行主动免疫治疗。
已用吸附到BCG上的GM2神经节苷脂对患黑素瘤病人进行了免疫接种。检测这些病人体内的IgM和IgG同型抗GM2抗体的存在。显示有较高滴度的病人更加延迟了肿瘤复发时间达15个月(Livingston.et al.，(1989)Cancer Res.49，7045-7050)。
此外，已在患黑素瘤病人身上进行了一期临床试验。用单独的或包裹在脂质体中的得自原发肿瘤细胞的神经节苷脂混合物免疫，显示有低抗体滴度的抗神经节苷脂GM3、GD3、GM2和9-O-乙酰GD3的IgG同型抗体。
该抗体反应持续时间短，而且不能通过重复免疫得以保持或增加。但有免疫反应的病人再次显示有显著意义的延迟复发(Por-toukalain et al.(1991)，Int.J.Cancer 49，893-899)。
为了改善抗神经节苷脂免疫反应，已开始使用蛋白质-GM2神经节苷脂结合物，特别是KLH-GM2对黑素瘤病人进行临床试用。
迄今所得到的结果表明产生了较高滴度的LgM抗体，并且存在有效应物性质的特异性IgG抗体，但该免疫反应不是典型的T细胞依赖性抗原次级反应(Livingston 1993，Proceedings of the Conference“Specific Immunotherapy of Cancer with Vaccines”，The N.Y.Acadenyof Science；abst.24)。
本发明的另一个目的是使用用于工业生产单克隆抗体的杂交瘤生物量作为神经节苷脂的适当生物学来源。
本发明的一个重要方面在于从工业化生产mAb的杂交瘤生物量得到羟乙酰化的神经节苷脂。特别是可按这种方法得到存在于乳腺癌中的抗原NGCGM3。借助疏水结合或共价结合载体蛋白质，特别是mAb将该神经节苷脂和/或其衍生物和/或其相应寡糖偶联到适当的载体上。
1.从杂交瘤生物量得到神经节苷脂
使用改动的Hakomori氏方法(HaKomori et al，(1974)Methodsin Enzymology，Vol.32，PartB，350)处理得自发酵罐中生产mAb的杂交瘤生物量。
加2-5升甲醇后匀浆处理经过滤培养基所得到的生物量(0.5-1kg)。再加2-5升甲醇后于回流下提取5至20小时。
加热过滤提取物，并在-20℃和-70℃之间的温度下将所得到的透明液放置48小时。
4℃下离心回收沉淀物，并进行中度碱处理(0.2NNaOH-MeO-H，37℃处理1至7小时)。
然后用HCl-MeOH 0.2N中和并在40℃以下的温度下浓缩至干。
于4℃对碳酸盐缓冲液(pH7)彻底透析脱盐，然后冻干。
在DEAE Sephadex A25(Pharmacia Sweden)中经离子交换层析得到单唾液酸神经节苷脂部分。用在MeOH中的0.02M NaAC洗脱Ac形式产物(基质体积/所用样品：1mL DEAE Sephadex/0.1-1μmolNANA)。
于4℃透析脱盐后，冻干该部分。
用装有硅胶60(230-400目，Merck，Germany)的吸附层析柱纯化神经节苷脂GM3和NGCGM3。
平衡含有10至40g硅胶的柱并用CCl3H∶MeOH∶NH3 2.5M(v/v)65∶25∶4洗脱。
混合单独含有GM3和NGCGM3的部分并干燥之。
使用10×20cm硅胶60平板(Merck，Germany)，以HPTLC法进行柱监测，其中使用的溶剂系统为在0.25％KCl中的CCl3H∶MeOH∶NH3 2.5M(50∶40∶10)，且使用间苯二酚试剂染色(Sven-nerholm L.；Biochem.Biophys.Acta 24(1957)，604-611)。
还使用间苯二酚法对神经节苷脂进行定量。所得GM3和NGCGM3的量在20-60mg之间。
2.疫苗免疫原的构成
作为免疫原制剂的抗原，可使用下列任何一种：存在于肿瘤中的N-羟乙酰化的神经节苷脂；用不同的间隔基在其还原末端进行了适当修饰，从而有利于它们接近免疫系统之不同成分的它们的寡糖；或者经在N-脂酰鞘氨醇中掺入功能性基团(氨基、羧基或醛基团)而进行修饰，从而使之与载体蛋白质共价结合的这些神经节苷脂的衍生物。
可使用任何生理上耐受的蛋白质作为载体蛋白质。它们应携带游离氨基和羧基基团，以允许使用任何常规结合方法(SPDP、碳化二亚胺、还原性胺化等)共价结合到上述抗原上。
鼠类单克隆抗体或不同细菌，如脑膜炎双球菌的外膜蛋白质可以是适当的载体蛋白质。
对于那些有已知一级氨基酸序列的蛋白质，可使用预测辅助T细胞抗原决定基的数学规则系统选择适当的结合方法。这样，即能避免因偶联抗原而产生的这些抗原决定基的可能换坏。在本申请中，发明人使用了Margalit等人(J.Immunol.138，2213-2219，1987)描述的规则系统。
使用天然神经节苷脂作为脑膜炎双球菌外膜蛋白质复合物所适合的蛋白脂质体的成分。制备这种类型的免疫原需要使用脱氧胆酸钠(0.1-1％)或十二烷基硫酸钠(0.1-1％)或Brij96(0.1-1％)预先分散脑膜炎双球菌的蛋白脂质体。
在超声浴中分散10-30分钟，然后加入含5至20倍过量神经节苷脂(或使之成为多价疫苗的神经节苷脂)的溶液。将所得分散液再次超声处理5-20分钟，并在室温下放置30分钟。最后进行透析直到没有去污剂。
本发明的免疫原制剂的最有效的配方中每个蛋白质质量单位含有2至5个神经节苷脂质量单位。最有效的神经节苷脂剂量单位含10-400μg神经节苷脂。
在构成结合的免疫原(共价结合到载体蛋白质上的抗原)时，可使用神经节苷脂寡糖或结构上修饰的神经节苷脂。
当使用神经节苷脂寡糖作为免疫原时，必须加入一个间隔臂以增大距离，从而避免折曲性并使之更易于接近免疫系统。
作为间隔基试剂，可使用在链的一端含有一个游离氨基，另一端含有羧基或氨基的脂族化合物(3至10个碳原子)。
最好使用氰基氢硼化钠作为还原剂，经还原性胺化反应进行糖与间隔基试剂的偶联(Stoll M.S.et al，Biochem.J.256，661-664，1988)。
典型的反应条件是：寡糖(5-25μmol)，间隔臂(250-1250μmol)，氰基氢硼化钠(5-25mg)，反应温度(40-70℃)，反应时间(24-72小时)。
然后以相对于寡糖量3-5倍的摩尔过量，在室温下反应6-10小时，使如此得到的胺化寡糖偶联到3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚氨酯(SPDP，Carlsson J.，Biochem.J.173，723-737，1978)上。
然后有必要使用相对于寡糖量的3-5摩尔过量在室温下反应4-12小时，将载体蛋白质偶联到SPDP上。
在室温下，用10-50mM二硫苏糖醇溶液将SPDP-蛋白质复合物还原1-5小时。最后进行胺化寡糖-SPDP和还原的蛋白质-SPDP复合物间的偶联，反应中使用的糖是相对于蛋白质中游离氨基数目2-5倍摩尔过量的。反应在室温下进行24-72小时。
在这些条件下，有10-100摩尔的寡糖(或其质量上的等同物)被偶联到载体蛋白质上。
构成将用于多价疫苗中之免疫原的另一个途径包括以前描述过的两种方法：形成其中一个或多个神经节苷脂被非共价结合的蛋白脂质体，以及共价结合一个其上面已偶联了间隔臂的来自神经节苷脂的寡糖。
下列实施例举例说明本发明：
实施例1：从杂交瘤生物量中分离GM3和NG
C
M3
使用改动的Hakomori氏方法(Hakomori et al.，(1974)，Methodsin Enzymology.Vol.32，PartB，350)加工从生产单克隆抗体ior t3的发酵罐得到的杂交瘤生物量(CIMAB S.A.，Cuba)。
作用匀浆器，与甲醇(2.5L)一起匀浆经过滤培养基得到的杂交瘤生物量(500g)。再次加入乙醇(2.5L)并在回流下提取10小时。加热过滤提取物并在-20℃下将所得透明液体放置2天。
4℃离心回收沉淀物并对其进行中度碱处理(0.2N NaOH/MeO-H，37℃，2小时)。用0.2N HCl中和后，在旋转蒸发器中干燥，并在4℃下对碳酸盐缓冲液(pH 7.0)广泛透析使固体物脱盐。将经过透析的产物冷冻干燥。
在DEAE Sephadex A-25(Ac-)中进行离子交换层析，用NaAcO.02M(在MeOH中)洗脱得到单唾液酸神经节苷脂部分。透析脱盐后冻干该部分，重新溶解在CCl3H∶MeOH∶NH3 2.5M(65∶25∶4)中并加于35克硅胶60柱上。
用CCl3H∶MeOH∶NH3 2.5M(65∶25∶4)的混合物洗柱，得到相应的神经节苷脂部分。
混合单独含GM3和NGCGM3的部分并使用旋转蒸发器干燥之。
在硅胶60平板上用高效薄层层析法(HPTLC)检测硅胶分离的不同部分中的神经节苷脂含量，其中使用CCl3H/MeOH/NH3(50∶40∶10；2.5M，在0.25％KCl中)溶剂系统并用间苯二酚染色。
GM3的产率为30mg，NGCGM3的产率为25mg。
实施例2：基于使神经节苷脂NG
C
GM3非共价偶联到脑膜炎双
球菌外膜蛋白质复合物(OMPC)上得到免疫原
使用由“Carlos J.Finlay”研究所提供的脑膜炎双球菌的OMPC(C.Campa et al.，EP 301992)。
在超声浴中，将10mg OMPC在0.3％脱氧胆酸钠的溶液中分散10分钟。然后，加入含20mg NGCGM3的溶液。再次将所得分散液超声幅射5分钟，并将其放置30分钟。
使用100KD膜透析5天，从去污剂中分离出可溶性复合物OM-PC-NGCGM3。
对蛋白质使用Bio-Rad试剂，对唾液酸使用间苯二酚，检测神经节苷脂掺入蛋白质中的程度。
结果测得每毫克OMPC中掺入2mg NGCGM3。
实施例3：基于将NG
C
GM3神经节苷脂的寡糖成分共价结合到
P3鼠类mAb上得到免疫原(新糖蛋白)
a)NGCGM3寡糖成分(NGCGM3OS)的分离。
借助超声波粉碎器将10mg NGCGM3溶解在4mL MeOH中并用臭氧处理(Wiegandt H.and Baschang G.Z.Natarforsch.，20b：164-166，1965)10分钟。
将此溶液蒸发至干并经过夜搅拌将残留物分散于10mL Na2CO3(0.1M)中，然后用DOWEX50W-X8中和并通过烧结的玻璃漏斗过滤。
用HCCl3提取所得溶液，用HPTLC分析水相以确定反应是否完成。
从应用角度，进一步根据阳性间苯二酚染色结果证实寡糖的存在。
最后在Sephadex G-25柱上纯化NGCGM3OS，并用HAc 0.1M洗脱。
根据H1核磁共振和质谱(FAB谱)分析结果确定NGCGM3OS的结构。
b)NGCGM3OS的反应性胺化。
将10μmol NGCGM3OS溶解在5mL含500μmol1，8-二胺3，6-二氧代辛烷的甲醇中，用氩气清洗并于50℃反应2小时，然后加入10mg NaBH3CN并于50℃继续反应40小时。
在氩气环境下干燥反应混合物并加入AcH以除掉过量的NaB-H3CH。
使修饰的寡糖在Biogel P-2柱上脱盐并在CM-纤维素柱上纯化之(Zopt et al.，Methods Enzymol.50：171-175，1978)。
使用硅胶60平板以HPTLC法鉴定胺化的衍生物，其中使用吡啶-乙酸乙酯-乙酸-水(6∶3∶1∶3)或氯仿-甲醇-0.2％氯化钙(60∶35∶8)作为溶剂并用苔黑酚或间苯二酚试剂进行检测。
c)胺化NGCGM3OS与偶联剂3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚氨酯(SPDP)的反应。
将10μmol寡糖溶解在磷酸盐缓冲溶液100mM、NaCl 0.1M(pH7.5)中，然后加入30-50μmol SPDP并在室温下反应6小时。
使用Biogel P2柱纯化所得到的衍生物。
使用步骤b中所述的同样平板、溶剂和检测系统，以HPTLC法鉴定所得到的衍生物。
d)单克隆抗体P3与SPDP的反应。
将10mg P3单克隆抗体-以高特异性识别结合到脂质上之N-羟乙酰神经氨酸的IgM mAb-在室温下溶解在磷酸盐缓冲溶液100mM，NaCl 0.1M(pH7.5)中。向该溶液中加入5mg SPDP并持续反应8小时。在Sephadex G-50柱上分离并用磷酸盐缓冲溶液0.1M(pH 6)5mM EDTA洗脱P3-SPDP。
混合含蛋白质的部分并用于下列步骤。
e)用二硫苏糖醇还原P3-SPDP衍生物。
为了还原新产生的二硫桥键，加入溶于磷酸盐缓冲溶液0.1M(pH6)、5mM EDTA中的25mM二硫苏糖醇，并在室温下反应2小时。
在使用上述同样溶液洗脱的Sephadex G-50柱上分离所得到的衍生物。
基于在分光光度计中检测343nm波长处的消光增加并应用朗伯-比尔定律(Lamberb-Beer Law)，计算偶联过程中所形成的游离硫代吡啶，以估计与P3偶联的SPDP的摩尔数。所用硫代吡啶的摩尔消光系数为7.06×10-9×M-1×cm-1。
f)与蛋白质偶联的糖。
使步骤C中得到的糖类衍生物与步骤e中得到的蛋白质反应48小时。
使用Sephadex G-50柱从反应产物中分离所得到的新糖蛋白。
使用针对糖的间苯二酚试剂和针对蛋白质的Bio-Rad试剂，经计算唾液酸含量估测与蛋白质偶联的糖的量。
在这些条件下每摩尔P3得到25摩尔NGCGM3OS。
还在非还原条件下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后进行Western印迹分析并与抗神经节苷脂特异性mAb反应，以研究与蛋白质偶联的糖。
实施例4：使用预先用神经节苷脂NG
C
GM3溶解，然后共价偶联
到NG
C
GM3OS上的脑膜炎双球菌OMPC得到免疫原(新糖蛋白)
a)溶解OMPC。
OMPC的溶解是按实施例2的方法完成的。
b)将NGCGM3OS偶联到OMPC-NGCGM3可溶性复合物上。
按实施例3的步骤a中所述方法得到寡糖NGCGM3OS，按实施例3的步骤b中所述方法进行还原性胺化，并按实施例3的步骤C中所述方法偶联到SPDP上。
同时，按实施例3的步骤d中所述方法将可溶性蛋白质复合物OMPC-NGCGM3偶联到SPDP试剂上，按实施例3的步骤e中所述方法用二硫苏糖醇还原，最后按实施例3的步骤e中所述方法偶联到适当的糖上。
各步骤中所用试剂的量和反应条件均与实施例3中所规定者相同。
用于鉴定不同NGCGM3衍生物之性质的分析方法，以及用于鉴定OMPC和其衍生物之性质的分析方法，均与实施例3中所述者相同。
所达到的掺入程度的每毫克OMPC蛋白脂质体掺入1mgNGCGM3OS。
实施例5：疫苗组合物的免疫学性质
免疫接种鸡
用上述不同形式的疫苗组合物免疫鸡并研究所获得的特异性体液免疫反应。
使用一组在一个月期间每周用1mg NGCGM3(在0.6mL PBS中，加完全弗氏佐剂)免疫的鸡作为参照。
第4次免疫接种后两周进行加强免疫并于4天后给动物放血。
用各疫苗制剂处理的各组鸡均使用同样的免疫程序。
使用神经节苷脂NGCGM3作为抗原，以ELISA法和TLC免疫染色法评估免疫反应。
就预免疫血清来说，所有用疫苗制剂免疫的各组鸡均可见抗NGCGM3神经节苷脂特异性抗体水平的增加。
对照组也显示出抗体反应增加，但是为IgM型抗体的增加；而疫苗制备则在大多数被免疫动物体内始终显示为特异性IgG反应。
实施例6：乳腺肿瘤中表达的神经节苷脂
手术期间得到10个乳腺肿瘤活体组织。对样品进行组织学分类并储存于-70℃下备用。
按照下述方法处理这些肿瘤：
向湿的并已称重的肿瘤中加入3倍体积的蒸馏水，然后在冷环境(4℃)下匀浆。
用Lowry方法检测匀浆样品中的总蛋白质含量。向剩余部分的各样品中加5倍体积CCl3H-CH3OH(2∶1)的混合物并于37℃下搅拌1小时。然后加入CH3OH将CCl3H∶CH3OH的比例调到1∶1并重复上述提取步骤。离心最后的混合物，分离上清液。
再次于37℃用CCl3H∶CH3OH∶H2O(1∶2∶0.8)的混合物将所得沉淀物搅拌提取2小时。再次离心分离上清液。
混合两部分上清液，并浓缩至干得到各肿瘤总脂质的混合物。
将溶解于5mL CCl3H∶CH3OH(9∶1)中的总脂质的混合物加于苯基Sepharose柱(2mL)上。用3倍体积的同一溶剂混合物洗柱，再用CCl3H∶CH3OH(85∶15)洗柱。
然后用5倍体积CCl3H∶CH3OH(1∶1)和5倍体积CH3OH洗脱神经节苷脂。
按Sonnino等人(Anal.Biochem.128(1983)，104-114)所述方法，用HPTLC和2d-HPTLC法研究肿瘤神经节苷脂混合物的各个样品。用密度检测法估计主要神经节苷脂的相对量。
所得结果表明乳腺肿瘤中主要神经节苷脂是GM3(平均值：356.4ng/mg蛋白质)和GD3(平均值：133.1ng/mg蛋白质)，其次是GD1a和GT1b。
正常乳腺组织中GM3和GD3的表达量平均值(分别为183.5和48.6ng/mg蛋白质)低于乳腺肿瘤组织中GM3和GD3的表达量。
为了鉴定小乳腺肿瘤神经节苷脂的性质，还对集中的总质量83克的肿瘤组织进行了研究。
按前述方法处理并提取该肿瘤块。
在DEAE Toyopearl柱中对神经节苷脂的总混合物进行离子交换层析，并再次对总酸性部分进行Q-Sepharose柱层析，从梯度洗脱系统得到9管洗脱物。以结合有FAB-MS的2d-HPTLC法进行层析分析，并用对O-乙酰化神经节苷脂特异的单克隆抗体进行TLC免疫染色分析，以检测所研究的样品中OAcGD3和OAcGT3的存在。
还有可能检测乳腺肿瘤的神经节苷脂混合物中与NGcGM3有相同Rf的带的存在。用可与H-D抗原反应的抗体进行的TLC免疫染色分析结果表明还存在另外2种羟乙酰化的神经节苷脂。
用H-D和抗OAc神经节苷脂对得自10个个体之肿瘤的神经节苷脂的混合物进行TLC免疫染色分析。结果示于表1中。
用4个肿瘤组织研究了乳腺肿瘤中不同类型脂结合之唾液酸的相对量。
为此目的，将各神经节苷脂的混合物置于0.5％HCl/MeOH，于100℃甲醇解2小时。
在N2气氛下干燥样品，并加入0.5μg苯基-α-N-乙酰氨基葡糖苷作为内部标准品。然后在乙酸酐∶吡啶混合物(1∶1)中100℃反应30分钟，使样品乙酰化。
加MeOH蒸发除去过量乙酸酐后，将样品溶解在CCl3H中并在配有OV-17柱(0.25mm×5m)的Jeol DX-304装置中使用电子冲击模型对样品进行GC/MS分析。
柱温度为228℃，喷射器温度为260℃。所用载体气体是流速为0.5mL/分的He。结果示于表II中。
表I.在从人乳腺肿瘤中分离的总神经节苷脂部分中存在的H-D抗原
| 方法 样品 | |||||||||||
| 3705(b) | 3735 | 3782 | 3820 | 3931 | 3464 | 3806 | 3849 | 3523 | 3734 | ||
| GM3(NGNA)(C) | 免疫染色 | + | + | + | + | ++++ | + | - | +++ | - | + |
| U1(NGNA) (d) | 免疫染色 | - | + | ++ | - | ++ | ++ | - | ++ | - | ++ |
| U2(NGNA)(d) | 免疫染色 | - | - | - | - | + | - | - | - | - | - |
注：(a)用H-D抗体进行TLC免疫染色。
(b)7305、3735、3782等是个别的人乳腺肿瘤样品。
(c)NGNA：N-羟乙酰神经氨酸(N-羟乙酰的)。
(d)U1和U2：未知的N-羟乙酰化的神经节苷脂(N-羟乙酰化的)。
(e)+，低活性；+++，中活性；++++，高活性；-，无活性。
表I1.唾液酸种类(组分)的分析
注：(a)3849、3464、3931、3806为个别肿瘤样品(见表1)。
| 样品序号.(a) | NANA(b) | NGNA(b) | O-Ac NANA(b) | |
| 3849 | GC/MS | 75.11％(c) | 16.60％ | 8.20％ |
| 3464 | GC/MS | 89.20％ | 5.82％ | 4.89％ |
| 3931 | GC/MS | 76.55％ | 11.55％ | 11.89％ |
| 3806 | GC/MS | 88.56％ | 11.44％ |
(b)NANA：N-乙酰神经氨酸。
NGNA：N-羟乙酰神经氨酸。
O-Ac NANA：O-乙酰N-乙酰神经氨酸。
(c)数值为总脂结合的唾液酸的百分数。
Claims (17)
1.刺激或增强抗含有免疫原和佐剂的N-羟乙酰化神经节苷脂之抗体免疫反应的疫苗组合物，其中所说的免疫原包含偶联到载体蛋白质上的N-羟乙酰化神经节苷脂N-羟乙酰GM3(NGcGM3)，它的寡糖或二者。
2.根据权利要求1的疫苗组合物，其中所说的NGcGM3在所说的疫苗组合物中以10至400μg的量存在。
3.根据权利要求1的疫苗组合物，其中载体蛋白质包含脑膜炎双球菌的外膜蛋白质复合物(OMPC)。
4.根据权利要求3的疫苗组合物，其中免疫原包含NGcGM3的可溶性复合物和脑膜炎双球菌的OMPC并且其中所说的免疫原通过间隔臂以共价键偶联到N-羟乙酰化神经节苷脂寡糖上。
5.根据权利要求4的疫苗组合物，其中间隔臂是含3-10个碳原子的饱和或不饱和二胺。
6.根据权利要求1的疫苗组合物，其中载体蛋白质包括单克隆抗体。
7.根据权利要求6的疫苗组合物，其中所说的单克隆抗体是鼠抗神经节苷脂单克隆抗体。
8.根据权利要求6或7的疫苗组合物，其中单克隆抗体通过间隔臂以共价键偶联到N-羟乙酰化神经节苷脂寡糖上。
9.根据权利要求8的疫苗组合物，其中间隔臂是含3-10个碳原子的饱和或不饱和二胺。
10.根据权利要求1的疫苗组合物，其中佐剂是天然来源的或是单克隆抗体。
11.根据权利要求1的疫苗组合物，其中佐剂是鼠抗神经节苷脂单克隆抗体。
12.根据权利要求1的疫苗组合物，其中疫苗组合物另外还含有选自GM3神经节苷脂，它的寡糖或二者的免疫原。
13.根据权利要求1的疫苗组合物，其中疫苗组合物还另外含有选自GD3神经节苷脂，它的寡糖或二者的免疫原。
14.根据权利要求1的疫苗组合物，其中神经节苷脂是从用于工业生产单克隆抗体的杂交瘤生物量纯化的。
15.根据权利要求1-13中任一项的疫苗组合物在制备用于预防和治疗乳腺癌或乳腺肿瘤的药物中的应用。
16.根据权利要求12的疫苗组合物在制备用于刺激或增强抗GM3神经节苷脂的免疫反应的药物中的应用。
17.根据权利要求13的疫苗组合物在制备用于刺激或增强抗GD3神经节苷脂的免疫反应的药物中的应用。
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