CN1218962C - 生长抑素卵黄抗体及其制备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生长抑素卵黄抗体及其制备方法。本发明合成了生长抑素(SomatostatinSS)与牛血清白蛋白(BSA)的人工抗原(SS-BSA)，作为免疫原，并将该人工抗原用于免疫SPF产蛋鸡，获取了可促进动物生长的生长抑素卵黄抗体。使用本发明的卵黄抗体免疫鸡只，试验组动物的平均体重比对照组高14%，试验组动物的料肉比也极显著高于对照组，试验组饲料消耗亦显著低于对照组。说明生长抑素卵黄抗体不仅具有明显的促生长作用，且能够节约饲料。
Description
本发明涉及生长抑素的一种抗体及其制备方法。
生长抑素(Somatostatin，以下简称为SS)是一种广泛存在于动物机体各组织器官的重要激素，它具有多种生物功能，如抑制生长激素(GH)，促甲状腺素，胃肠胰岛激素等的分泌；抑制神经垂体激素的释放；抑制胃的分泌及调整胃肠循环和运动和营养物质的吸收等。
由于SS在动物体内可抑制生长激素的释放，因此，消除或减低SS的抑制作用，可提高生长激素在体内的释放水平，促进动物生长发育。国内外均有人运用SS免疫中和技术进行过此方面的研究。
如用SS主动免疫牛、羊，猪等动物，使动物体内的SS水平下降，GH水平提高，增加动物体重(SpencerG.S.G.et al.，1983，LivestockProd.Sci.，10：469-473；黄先夺，姚连生等，1991，江苏农业科学，(4)：53-54)；黄先夺，姚连生等，1991，江苏农业学报，7(4)：37-40)。这种免疫方式的缺点是产生的免疫反应低下，尤其在免疫后最初1-2月内，增重效果不明显，甚至体重有所下降，这就限制了主动免疫的应用。
还有人用SS制备的抗血清和单克隆抗体经处理后被动免疫大鼠，以提高体重(Maccicchini M.L.，1986，US Patent.4,599,299 Jul.8)。被动免疫虽能克服免疫反应低下的问题，但是抗血清的来源受限，还有可能存在过敏反应等问题。
有人用基因工程方法研制了可表达SS的基因工程亚单位苗，用来免疫大鼠，促进生长。但此方法的主要缺点仍为免疫原性较差(徐文忠，杜念兴等，1993，中国科学，23(12)：1272-1278)
本发明的目的是研制一种SS抗体，该抗体促进动物生长的效果好，不易发生过敏，该抗体的制备具有来源丰富、产量高、对环境无害等优点。
由于生长抑素的分子量很小，本身不具有免疫原性，属半抗原。需要与大的载体蛋白通过化学方法进行联接，构成新的具有SS免疫原性的人工抗原。生长抑素卵黄抗体制备技术的关键在于载体蛋白及免疫程序的筛选。两者的选择决定了抗体的效价水平。
本发明合成了生长抑素(Somatostatin SS)与牛血清白蛋白(Bovine Serum AlbuminBSA)的人工抗原(SS-BSA)，作为免疫原，并将该人工抗原用于免疫SPF产蛋鸡，获取了可促进动物生长的生长抑素卵黄抗体。
一.人工抗原的制备：
1.反应原理：
N-乙基，N′-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(N-ethyl-N′-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，简称为EDC)作为缩合剂，可使氨基和羧基间脱水缩合而形成酰胺键。在一定的反应条件下，载体蛋白质或半抗原分子上的羧基先与碳化二亚胺反应，生成中间产物，再与另一个载体蛋白或半抗原分子的氨基反应，形成偶联物，即人工抗原。
2.制备方法
化学联接：
根据SS与BSA的分子结构、两者的氨基和羧基的比例及其分子量之比，计算出在同一联接体系中，SS与载体蛋白BSA的投放比例。将SS溶于PBS缓冲剂中，溶解后加入BSA，再加入缩合剂EDC；反应结束后，通过透析法去除系统中未联接上载体蛋白的半抗原，交联剂等小分子，(透析虽不能除去BSA等大分子，但由于检测抗原选用其他载体蛋白可避免BSA对抗体检测的干扰，故无需对反应体系中的BSA做处理)，即得到所需的人工抗原—SS-BSA。
3.抗原的检测
使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法检测联接反应产物人工抗原的联接效果。取载体蛋白BSA作为对照，进行电泳，由于SS-BSA比BSA分子量略大，结果显示样品的条带比BSA的位置略有后移。
二.卵黄抗体的制备：
1.动物免疫：
(1)免疫准备：取上述联接反应产物SS-BSA人工抗原，加入福氏完全佐剂，充分乳化备用；或取上述SS人工抗原，加入福氏不完全佐剂，充分乳化备用。
(2)免疫：
取产蛋鸡数只，用SS-BSA人工抗原进行免疫，另设不进行免疫的空白对照组，常规饲养。
免疫程序为：
初次免疫时每只鸡胸肌多点注射抗原，两周后进行二免(与初免注射量相同)，相隔两周进行加强免疫(注射量加倍)，再隔两周后进行第四次免疫(注射量再加倍)。
2.卵黄液制备
四免后一周开始收集各实验组鸡所产的鸡蛋，制备成卵黄液以进行下步测定抗体效价。
3.抗体检测
在SS-BSA人工抗原中SS相当于一个抗原决定簇，检测抗原SS-CWS除SS部分与SS-BSA相同外，其余皆不同。这表明若本次试验所得卵黄液和SS-CWS产生抗原抗体反应即说明卵黄液中含有针对于SS的抗体，其抗体效价为针对SS的抗体效价。
相对于SS-BSA免疫组：分别用SS-BSA，SS-CWS，BSA，CWS(chicken whole serum鸡全血清 简称CWS)，EDC作为检测抗原。结果见表1：
表1 不同抗原检测结果
卵黄液和SS-BSA及SS-CWS反应皆呈阳性结果，而SS-BSA和SS-CWS两者相同抗原成分为SS，这说明是卵黄液中具有SS的特异性抗体结构。
由于纯化人工抗原时未去除BSA，故卵黄液中含有BSA的抗体。
4.抗体效价检测
用琼脂扩散法进行抗体效价的检测。
方法：使用常规方法制备琼脂凝胶，使用鸡全血清(CWS Chicken Whole Serum无菌采取SPF鸡全血后10000rpm离心3分钟去血细胞，由中国兽医药品监察所实验动物室提供。0.2μm滤膜除菌及杂质)作为载体蛋白，用前述与连接SS和BSA相同的方法制成检测抗原SS-CWS。将卵黄抗体等量梯度稀释和SS-CWS反应，有反应的抗体最大稀释度即为抗体效价。本方法检测生长抑素卵黄抗体的效价为1∶32。
三.SS卵黄抗体促生长试验及结果：
使用SS-BSA卵黄抗体免疫鸡只，7日龄首次免疫，每只鸡颈部皮下注射1ml，以后每10天免疫一次，药量相同，共免疫6次，结果两次免疫后，试验组的平均体重即极显著地高于对照组，试验结束时试验组的平均体重比对照组高14％；另外试验组的料肉比也极显著高于对照组，并保持显著差异至试验结束。
这说明SS卵黄抗体具有明显的促生长作用。
实施例1 生长抑素与牛血清白蛋白人工抗原(SS-BSA)的制备
材料与方法：
1.生长抑素：Somatostatin-14(SS)，其氨基酸序列为：
丙-甘-半胱-赖-天冬-苯丙-苯丙-色-赖-苏-苯丙-苏-苯丙-苏-丝-半胱
N端 Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe----Phe----Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Phe--Thr-
Ser-Cys C端
｜--------------------------------------------｜
分子量：1637.9
分子式：C76H104N18O19S2
纯度：≥98％
购自晶美生物工程有限公司。
2.牛血清白蛋白组分V(BSA Bovine Serum Albumin Fraction V)，进口分装，分子量：≥60000
购自北方同正生物有限公司。
3.N-乙基，N′-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)。
分子式：[H5C2-N＝C＝N-CH2CH2CH2-NH+(CH3)2]Cl-
购自北京华美生物有限公司。
4.缓冲液PBS：
在800ml蒸馏水中溶解8gNaCl，0.2g KCl，1.44gNaHPO4和0.24g KH2PO4，用HCl调节PH值至7.2，加水定容至1L，15 Ibf/in2高压灭菌20分钟，室温保存。
5.化学联接
SS与BSA按1∶10(M∶M)的比例投放，即取1.5mg溶于5ml PBS中(PH7.2)，至完全溶解后，加入15mg牛血清白蛋白组分五(BSA Fraction V)，溶液缓慢振荡边加入3mg EDC，缓慢搅拌，室温反应2小时后，再边搅拌边缓慢补加1mg EDC，4℃下缓慢搅拌，反应24小时；反应结束后，在多量PBS(PH7.2)中，4℃下透析48小时，去除系统中未联接上载体蛋白的半抗原，交联剂等小分子。
分装1ml/份(每份含SS 0.3mg)，-40℃保存。
6.抗原检测
制备聚丙烯酰胺凝胶，取2μl上述化学联接反应产物进行检测，2μl载体蛋白BSA作为对照，进行电泳，由于SS-BSA比BSA分子量略大，结果显示样品的条带比BSA的位置略有后移。
实施例2 动物免疫
(1)免疫准备：常温无菌条件下取5ml福氏完全佐剂于小烧杯中，边用小号磁棒搅拌边逐滴加入至等量的实施例1制备的免疫原SS-BSA；充分搅拌至混合物为乳白色的乳剂。4℃保存备用；
同法制备使用福氏不完全佐剂的免疫原。
(2)免疫：
SPF鸡：取白来杭种SPF210日龄蛋鸡6只(与以下用词一致)(购自中国兽药监察所)，采用隔离器饲养；随机抽取2只作为对照组，其余4只作为免疫组，免疫SS-BSA人工抗原，对照组常规饲养。
初次免疫前5天采血后每只鸡(是否包括对照组？)胸肌多点注射0.5ml百白破疫苗，初次免疫时每只鸡胸肌多点注射0.5ml抗原(相当于每只鸡免疫SS 75μg，)，两周后进行二免(相同注射量)，相隔两周进行加强免疫(注射量加倍)，再隔两周后进行第四次免疫(注射量再加倍)。四免后一周开始收集鸡蛋，每只蛋标明组别及日期，一个月后收集免疫组所产鸡蛋制备成卵黄液。
表2 SPF鸡人工抗原免疫剂量(mg/只)
初免使用福氏完全佐剂，其他几次免疫使用福氏不完全佐剂。
实施例3 抗体的提取与检测(琼脂扩散法)：
(1)琼脂板的准备：
100ml 8％NaCl溶液加1.2克琼脂粉(分析纯，进口分装)，加热融化，加入0.2ml苯酚混匀，倒入玻璃平皿，制成2-3mm厚的琼脂板，室温凝固后，4℃倒置保存待用。(2)卵黄液的保存及卵黄抗体的提取：无菌条件下分离出卵黄，每个卵黄加20ml PBS，0.02％硫柳汞，高速匀质后密封，4℃保存。
(2)卵黄抗体的提取(氯仿盐析法)：
取100ml卵黄液加入100ml PBS缓冲液，使用组织破碎机进行高速匀质后，再加入400ml(2倍体积)氯仿，再次高速匀质；将处理物用离心机以4000rpm的速度离心15分钟；取上清液即为所得卵黄抗体。经琼脂扩散法测定抗体效价(1∶32)后，冷冻-10℃保存。
(3)抗体的稀释：
用二倍连续稀释法连续稀释抗体，取2×，4×，8×，16×，32×，64×及更高稀释倍数。
(4)琼脂扩散反应：
使用前，用打孔器将琼脂板打成七孔梅花型孔，酒精灯加热封底。测样时，每孔加入20μl样品，倒置平皿37℃密闭湿盒24小时至72小时，直至沉淀线产生。
测效价时，在中央孔加入抗原，外围孔按一定顺序分别加入不同稀释倍数的抗体，稀释液采用PBS，稀释倍数为2×，4×，8×，16×，32×，64×。
倒置平皿，37℃孵化沉淀线产生，观察抗体效价，若最大稀释度仍有沉淀线，以其为基础，连续稀释，重复反应，直至测出最终抗体稀释倍数，记录。
(5)卵黄抗体效价：使用鸡全血清(CWS Chicken Whole Serum无菌采取SPF鸡全血后10000rpm离心3分钟去血细胞，由中国兽医药品监察所实验动物室提供。0.2μm滤膜除菌及杂质)作为载体蛋白；取3mg溶于5ml PBS中(PH7.2)，至完全溶解后，加入5ml鸡全血清(CWS)，溶液缓慢振荡边加入6mg EDC，缓慢搅拌，室温反应2小时；边搅拌边缓慢加入1.5mg EDC，4℃反应24小时；
分装1ml/份(每份含SS 0.3mg)，-40℃保存。
取卵黄抗体，用SS-BSA，SS-CWS作为检测抗原，琼扩法检测抗体反应，结果如下：
表3 卵黄抗体效价
实施例4 SS卵黄抗体促生长试验及结果：
(一)试验材料及实验设计：
选择本所鸡场油鸡(1日龄)90只，公母各半，预饲一周，至7日龄。清晨饲喂前空腹称重，鸡只体重相近(59克±5.13克)。随机分为试验组60只，对照组30只，每组公母各半。饲料采用基础日粮，营养水平符合国家饲养标准，两组饲养管理条件完全相同。
从7日龄起，每7天(一周)每组清晨空腹秤重，记录每只鸡的体重变化，共计九周，观测其生长速度及增重效果。每组每日记录耗料量，耗料量/只＝设料量-剩料量/当日鸡只数。从7日龄起，试验组每10天颈部皮下注射1ml，共免疫6次，从17日龄起，每10天(免疫前)，试验组随机抽取10只鸡，对照组随机抽取5只鸡，屠宰记录体重，胴体重及胸肌及腿肌重，观察其胴体重，胸肌重，腿肌重及屠宰率等屠宰指标。
(二)试验结果
1.增重效果
试验组初始平均体重为59.42g，对照组为59.00g。初次免疫2周内，两组匀体重无差异。从第三周至(二免后4天)六周(4免后2天)，试验组体重显著高于对照组。七周后至九周，试验组平均体重仍高于对照组。见表4
表4 SS卵黄抗体免疫鸡的增重效果(克)
| 称重时间(实验动物周龄) | 试验组平均体重 | 对照组平均体重 | 体重比试验组/对照组 |
| 一周龄(始重)二周龄三周龄四周龄五周龄六周龄七周龄八周龄九周龄终重 | 59.49±5.13106.42±13.72175.6±74.4**251.53±38.16*381.15±52.19*512±73.51641.75±80779.5±101.09929.8±156.05997.5±171.19 | 59±5.8110.55±17.35147.42±42.92223.74±48.09339.74±80455.43±92.14590.11±124.73723.44±162.26803.25±301.93876.75±308.45 | 1.0080.961.191.121.121.121.081.081.161.14 |
**：P＜0.01
*：P＜0.05
2.屠宰指标分析
试验组与对照组之间，第一次屠宰时(17日龄，首免10天)，各项屠宰指标有显著差异。结果见表5
3.饲料消耗
试验开始四周至五周(二免至四免间)，试验组周平均耗料量显著低于对照组，此后持续低于对照组(表6)。
(三)结果分析：
从实验数据分析，二免后(三周龄至五周龄)实验组鸡的平均体重极显著地高于对照组，并保持显著差异三周，随后虽差异不明显，但一直保持高于对照组平均体重，将两组平均体重做T-检验，差异极显著。
试验开始一至三周，两组耗料情况无显著差异，四周(五周龄)起，试验组的耗料量显著低于对照组，并持续至试验结束。
分析认为，在试验前三周，由于由于只进行了两次免疫，SS抗体刚开始与鸡体内的SS中和，引起SS水平下降，由于SS为脑肠肽激素，通过抑制消化吸收的途径影响生长发育，试验组鸡体重显著上升而耗料量未发生变化，可能为体内SS被中和一部分后，改善了消化道对营养物质的吸收。GH等激素水平上升不明显，故增重不明显。
试验开始四周起(三免后)，体内SS进一步被中和，GH等激素的分泌增加，故试验组体重继续保持高水平增加，同时与对照组相比，耗料量的差距大幅度拉开。
试验中，两组各项屠宰指标除第一次外无显著差异，第一次屠宰在鸡只17日龄(首免后10天)，此时两组平均体重已有显著差异，说明SS抗体已开始起作用，和增重曲线相符。各屠宰指标无显著差异，和以前文献相符。就以上数据分析认为，SS抗体免疫鸡可对鸡生长发育有较明显的促进作用。
表5 不同日龄屠宰后各部分情况
| 体重(克) | 胴体重(克) | 胸肌重(克) | 腿肌重(克) | 屠宰率(胴体重/体重) | ||||||
| 试验组 | 对照组 | 试验组 | 对照组 | 试验组 | 对照组 | 试验组 | 对照组 | 试验组 | 对照组 | |
| 17日龄(首免10天) | 126.2*±16.36 | 102.6±7.37 | 121.27*±18.42 | 98.44±9.94 | 9.15*±2.67 | 5.064±1.41 | 11.72*±3.31 | 7.73±1.62 | 0.96 | 0.91 |
| 27日龄(二免10天) | 242.7±29.31 | 212.8±30.04 | 216.6±26.55 | 190±30.5 | 16.19±3.54 | 15.88±3.78 | 23.33±4.28 | 21.04±4.72 | 0.89 | 0.89 |
| 37日龄(三免10天) | 377.8±61.50 | 364±103.61 | 337.9±54.74 | 325.48±9.37 | 29.63±7.85 | 29.96±10.56 | 38.17±6.71 | 37.82±13.93 | 0.89 | 0.89 |
| 47日龄(四免10天) | 610.1±110.77 | 513.4±120.38 | 541±105.115 | 465.2±107.56 | 52±13.69 | 42.82±12.36 | 69.17±15.32 | 53.64±17.87 | 0.87 | 0.91 |
| 57日龄(五免10天) | 770.9±63.82 | 755.8±76.7 | 689.2±58.98 | 675.6±78.38 | 68.81±3.49 | 70.88±7.8 | 92.34±9.61 | 91.82±12.28 | 0.89 | 0.89 |
| 67日龄(六免10天) | 997.5±171.87 | 876.75±308.45 | 885.8±142.83 | 784.5±266.73 | 94.31±16.28 | 78.975±30.76 | 121.52±27.38 | 103.58±40.8 | 0.89 | 0.89 |
表6 鸡的耗料情况(克/周.只)
| 一周 | 二周 | 三周 | 四周 | 五周 | 六周 | 七周 | 八周 | 九周 | |
| 试验组对照组 | 15.07±2.4915.04±2.39 | 23.64±4.524.1±4.44 | 38.74±5.1140.68±8.03 | 49.38**±6.8153.83±7.97 | 64.46*±8.6570.54±7.55 | 77.01±10.5982.2±5.46 | 76.82±5.976.88±3.75 | 101.29±1098.34±9.61 | 102±7.35110±12.08 |
Claims (4)
1.一种人工抗原，其特征是该抗原是生长抑素与牛血清白蛋白在N-乙基，N′-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐的作用下，缩合而成的。
2.一种生长抑素抗体，其特征是该抗体是将权利要求1所述的人工抗原用于免疫SPF产蛋鸡，并收集所述被免疫的鸡所产的鸡蛋，从该鸡蛋黄中提取出的生长抑素卵黄抗体。
3.权利要求2所述的生长抑素抗体的制备方法，其特征是将权利要求1所述的人工抗原用于免疫SPF产蛋鸡，并收集所述被免疫的鸡所产的鸡蛋，从该鸡蛋黄中提取出的生长抑素卵黄抗体。
4.权利要求3所述的生长抑素抗体的制备方法，其特征是所述的免疫SPF产蛋鸡的免疫程序是：
初次免疫时每只鸡胸肌多点注射抗原，两周后进行二免，相隔两周进行加强免疫，再隔两周后进行第四次免疫。
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