CN1293097C - 甘草酸抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了甘草酸抗体及其制备方法与应用，涉及小分子抗体及其制备与应用领域。本发明的目的是提供甘草酸抗体及其制备方法，以及甘草酸抗体在鉴定中药材甘草酸真伪上的应用。本发明所提供的甘草酸抗体，是用甘草酸抗原免疫动物，然后从被免疫动物的血清中分离得到的；所述甘草酸抗原按如下过程制备：先将甘草酸溶解在N，N-二甲基甲酰胺、二氧六环或二甲基亚砜中，避光加入N-羟基琥珀酰亚胺，然后在0-10℃条件下与二环己基碳二亚胺反应2-5小时；接着与载体蛋白常温反应4-6小时，得到甘草酸抗原。应用甘草酸抗体采用ELISA方法检测中药材样品，可以鉴定甘草真伪。

Description

甘草酸抗体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及小分子物质抗体及其制备方法与应用，特别是涉及甘草酸抗体及其制备方法与应用。

背景技术

甘草是豆科甘草属药用植物，以根和根茎入药。《中华人民共和国国家药典(2000年版一部)》记载的入药甘草有乌拉尔甘草、胀果甘草和光果甘草三种(以下统称甘草)。甘草的药用成分主要是甘草酸(Gglycyrrhizic acid，GA)，分子式C₄₂H₆₂O₁₆，是从甘草中分离出来的三萜类化学物质。

目前，甘草酸的分析方法有重量法、比色法、高效液相色谱法(HPLC)、高效毛细管电泳法、薄层层析法、气相色谱法等。这些方法的主要局限是：样品前处理时间长，实验设备昂贵，同时要消耗的大量的甲醇、乙腈等有机溶剂；对于大量样品的测定有一定的困难，尤其是在快速鉴定甘草真伪时，这些方法都显得无能为力。免疫检测试剂盒和试纸条可以快速检测某一特定物质的含量，是中草药质量快速鉴定的最有前途的方法。但要把免疫检测方法应用到甘草酸，需要制备出甘草酸的抗体。

发明内容

本发明的目的是提供甘草酸抗体及其制备方法。

本发明所提供的甘草酸抗体，是用甘草酸抗原免疫动物，然后从被免疫动物的血清中分离得到的；所述甘草酸抗原按如下过程制备：先将甘草酸溶解在N，N-二甲基甲酰胺、二氧六环或二甲基亚砜，避光加入N-羟基琥珀酰亚胺，然后在0-10℃条件下与二环己基碳二亚胺反应2-5小时；接着与载体蛋白常温反应4-6小时，得到甘草酸抗原。

制备甘草酸抗体的方法，是用甘草酸抗原免疫动物，然后从被免疫动物的血清中分离得到甘草酸抗体，其特征在于：所述甘草酸抗原按如下过程制备：先将甘草酸溶解在N，N-二甲基甲酰胺、二氧六环或二甲基亚砜中，避光加入N-羟基琥珀酰亚胺，然后在0-10℃条件下与二环己基碳二亚胺反应2-5小时；接着与载体蛋白常温反应4-6小时，得到甘草酸抗原。

所述甘草酸溶解在N，N-二甲基甲酰胺、二氧六环或二甲基亚砜中后，其摩尔浓度在28.3mM-113.3mM；所述加入N-羟基琥珀酰亚胺的量为57.9mM-231.7mM；所述二环己基碳二亚胺的用量为121.2mM-484.7mM；所述载体蛋白的用量为0.09mM-0.37mM。

为了使效果更好，载体蛋白需先在0-10℃条件下溶解于pH9-10的碳酸盐缓冲液中，常用的载体蛋白有牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、兰素蛋白(KLH)、卵清白蛋白(OVA)等。

甘草酸抗原制备反应结束后，通常需要经过透析或过sephadex G-25柱以除去未联结的甘草酸及有机溶剂，然后冷冻干燥以浓缩制备得到甘草酸抗原。

应用所制备的甘草酸抗原对实验动物经过基础免疫和加强免疫后，取样测定效价，当效价达到要求时，可以开始采血，分离出抗血清，即可以得到甘草酸抗体。

本发明的另一个目的是提供甘草酸抗体在鉴定中药材甘草真伪上的应用。

在应用甘草酸抗体进行鉴定中药材甘草真伪时，其鉴定过程包括如下步骤：

1)甘草和待测药材40-50℃水浸泡，取上清液，得样品液；

2)应用甘草酸抗体采用ELISA方法检测样品液；

3)通过观察孔颜色，鉴别样品的真伪，颜色浅为真品，颜色深为假品。

步骤2)中的ELISA方法用常规的间接法和直接法，其中，间接法可以按如下步骤进行操作：

1)用甘草酸包被抗原包被酶联板；

2)向酶联板上同时加入甘草酸样品、甘草酸抗体，反应过后加入酶标二抗进行反应；

3)加入OPD-H₂O₂溶液底物后终止反应。也可以根据上述原理，利用本发明的甘草酸抗体制备各种检测甘草真伪的试剂盒，以便于现场快速检测。

甘草酸是小分子物质，不具备免疫原性，不能直接刺激动物产生抗体，要想制备甘草酸的抗体，就必须把甘草酸与相应大分子载体蛋白偶联构建人工抗原，并用合成的人工抗原免疫动物产生特异性抗体。利用本发明的方法可以方便快捷地获得甘草酸人工抗原，成本低，效果好，利用合成的甘草酸免疫抗原通过免疫动物，可以快速高效地获得甘草酸抗体。利用甘草酸抗体鉴定中药材甘草的真伪，具有快速、灵敏的优点。

附图说明

图1为甘草酸人工抗原GA-BSA的紫外扫描光谱照片

图2为甘草酸人工抗原GA-OVA的紫外扫描光谱照片

图3为甘草酸间接ELISA法标准曲线

图4为甘草酸样品检测照片，示不同样品检测颜色区别

具体实施方式

实施例1、甘草酸抗原的合成

1、甘草酸-牛血清蛋白(BSA)免疫抗原的合成(用于免疫动物)

(1)取甘草酸80mg，溶解在3ml的N，N-二甲基甲酰胺中，常温下磁力搅拌。

(2)再加入40mg的N-羟基琥珀酰亚胺，在避光下磁力搅拌，并加150mg二环己基碳二亚胺反应，4℃下搅拌4小时，离心，取上清液。

(3)将150mgBSA用12ml pH为9.5的碳酸钠缓冲液在4℃下搅拌溶解。

(4)将BSA溶液加入(2)所得上清液中，常温下反应5小时后，装入透析袋中，用PB透析液透析4天，每天换三次透析液。然后分装，经-40℃冷冻后，真空干燥，放-20℃冰箱中。

2、甘草酸-OVA包被抗原的合成

(1)取甘草酸80mg，溶解在3ml的二氧六环中，常温下磁力搅拌。

(2)再加入40mg的N-羟基琥珀酰亚胺，在避光下磁力搅拌，并加150mg二环己基碳二亚胺反应，4℃下搅拌4小时，离心，取上清液。

(3)将60mg卵清蛋白(OVA)用8ml pH为9.5的碳酸钠缓冲液在4℃下搅拌溶解。

(4)将OVA溶液加入(2)所得上清液中，常温下反应5小时后，装入透析袋中，用PB透析液透析4天，每天换三次透析液。然后分装，经-40℃冷冻后，真空干燥，放-20℃冰箱中。

3、甘草酸-BSA免疫抗原、甘草酸-OVA包被抗原的鉴定

将甘草酸(GA)的免疫抗原GA-BSA和包被抗原GA-OVA及GA进行紫外扫描，结果如图1和图2所示。从图可以看出，GA-BSA和GA-OVA的吸收峰，与GA、BSA和OVA的吸收峰相比，发生了明显的变化，表明人工抗原GA-BSA和GA-OVA的偶联是成功的。

实施例2、制备甘草酸抗体

(1)取8-10周龄的Balb/C小白鼠为实验动物。

(2)实验免疫剂量基础免疫为0.25-2.0mg/kg，加强免疫剂量为0.5-2.0mg/kg，用无菌水稀释实施例1中得到的甘草酸-BSA免疫抗原，无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏完全佐剂，充分乳化，直到滴入水中不扩散。

(3)用乳化好的免疫抗原采用背部皮下多点注射动物，注射0.2ml。

(4)基础免疫后，采用不完全弗氏佐剂乳化免疫抗原，方法同(2)，每隔3-4周进行加强免疫，腹腔与背部轮换注射。从第三次免疫开始，每次免疫后第8-10天，从小鼠眼眶采血，测效价，待效价大于1∶10000后，采血，分离出抗血清，即得抗体。

实施例3、抗体抑制试验

1)GL-OVA包被抗原溶液的配制

取GL-OVA包被抗原，完全解冻后取8μl，用包被液(1.5g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃，0.2g NaN₃，加1000ml蒸馏水，pH为9.6.)按1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000进行稀释。96孔酶联板用蒸馏水洗涤后，每孔加入所配的包被抗原液100μl，于37℃温箱中温育3h。

2)配制甘草酸的标样溶液

取甘草酸标样的溶液，用样品稀释液(8.0g NaCl，0.2g KH₂PO₄，2.96gNa₂HPO₄·12H₂O，1ml Tween-20，1g明胶，加1000ml蒸馏水，pH为7.5)配成2000ng/ml供试标样溶液，以样品稀释液作对照即0ng/ml。取出酶联板，弃去孔内液体，用洗涤液(8.0g NaCl，0.2g KH₂PO₄，2.96g Na₂HPO₄·12H₂O，1ml Tween-20，加1000ml蒸馏水)洗4次后甩干，每孔加入50μl。

3)甘草酸抗血清稀释液的配制

取实施例2的小白鼠抗血清，用样品稀释液依次按1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000进行稀释。每孔加入50μl抗血清稀释液，于37℃温箱中温育30min。弃去孔内液体，用洗涤液洗4次后甩干。

4)酶标二抗反应

每孔加入经1∶2000稀释的用常规方法制备的HRP-山羊抗小鼠IgG(H+L)样品稀释液溶液100μl，放入37℃温箱中温育30min。用洗涤液洗涤4次，甩干。

5)显色

每孔加入底物OPD-H₂O₂溶液100μl，37℃温箱中温育10min后用50μl 2M H₂SO₄终止反应。在酶联仪上测定490nm波长下的吸光度值，数据如表1所示。

表1、甘草酸抗体与甘草酸抑制实验结果

1∶16000

0.91

2.43

0.54

2.43

0.19

1.48

0.11

0.44

0.00

0.18

0.00

0.04

注：0^a无甘草酸

1^b2000ng/ml甘草酸

由表1可以看出，当包被抗原与抗血清浓度适宜时，就有抑制现象，即2000ng/ml孔与0ng/ml孔的吸光度度值有差别，2000ng/ml孔吸光度值小，0ng/ml孔吸光度值高：当包被抗原稀释度为1∶16000，抗血清稀释度为1∶2000时，零水平与标准品的吸收值之差最大，此时抑制为最好。

实施例4、建立甘草酸标准曲线

1)配制包被抗原稀释液

取GA-OVA包被抗原，完全解冻后取1μl，用包被液按1∶16000稀释。

2)配制甘草酸标准溶液

取甘草酸标样配制0.1mg/ml的标准溶液，从中取出40μl，加入1.96ml的样品稀释液中，即到2000ng/ml标准样溶液，再依次配成500ng/ml、100ng/ml、10ng/ml、5ng/ml及0.0ng/ml共6个浓度。

3)配制抗血清稀释液

取小鼠抗血清，用样品稀释液按1∶16000稀释。

4)点板

将96孔酶联板用蒸馏水洗涤后，每孔加入所配的包被抗原稀释液100μl，于37℃温箱中温育3h。取出酶联板，弃去孔内液体，用洗涤液洗4次后甩干，每孔加入经系列稀释的甘草酸各浓度标准液50μl，再加入抗血清稀释液50μl。放37℃温箱中温育30min。弃去孔内液体，用洗涤液洗4次后甩干。

5)加酶标二抗

每孔加入经1∶2000稀释的HRP-山羊抗小鼠IgG(H+L)样品稀释液溶液100μl，放入37℃温箱中温育30min。用洗涤液洗涤4次，甩干。

6)显色

每孔加入底物OPD-H₂O₂溶液100μl，37℃温箱中温育1Omin后用50μl 2M H₂SO₄终止反应。在酶联仪上测定490nm波长下的吸光度值。所得数据换算即得如图3所示的标准曲线，图中曲线的横坐标为甘草酸各浓度(ng/ml)的自然对数，纵坐标用甘草酸各浓度吸光度值的logit值表示。Logit值的计算方法如下：

$\mathrm{Logit}(B/B0)=\ln \frac{B/B0}{1-B/B0}=\ln \frac{B}{B0-B}$

其中B0是0ng/ml孔的吸光度值，B是其它浓度的吸光度值。)

实施例5、中药材甘草真伪的鉴定

1)将甘草和黄芪粉20mg于试管中，分别加5ml水，加热到45℃后，浸泡20min，取上清待测；

2)取甘草酸-OVA抗原，用包被液按1∶16000稀释，将96孔酶联板用蒸馏水洗涤后，每孔加入所配甘草酸-OVA抗原稀释液100μl，于37℃保温3h；

3)取小鼠抗血清，用样品稀释液1∶16000稀释，得抗血清稀释液；

4)取出酶联板，弃去孔内液体，用洗涤液洗4次后甩干，加入样品液50μl，再加入50μl抗血清稀释液，对照加入100μl水，放37℃保温箱中保温30min；

5)弃去孔内液体，用洗涤液洗4次后甩干后，每孔加入经1∶2000稀释的HRP-山羊抗小鼠IgG100μl，放入37℃保温箱中保温30min；

6)酶联板用洗涤液洗涤4次甩干后，每孔加入底物OPD-H₂O₂溶液100μl，37℃保温箱中保温10min后用50μl 2M H₂SO₄终止反应。

结果如图4所示，甘草粉提取液的孔与黄芪粉提取液的孔颜色有明显不同，由此可鉴定甘草的真伪，图中1、3号样品为甘草时的检测效果，2、4号样品为黄芪时的检测效果，5-12号样品分别为甘草酸标样浓度(5号浓度为2000ng/ml、6号浓度为1000ng/ml、7号浓度为500ng/ml、8号浓度为100ng/ml、9号浓度为50ng/ml、10号浓度为10ng/ml，11号浓度为5ng/ml、12号浓度为0.0ng/ml)时的检测效果。

Claims (8)

1、甘草酸抗体，是用甘草酸抗原免疫动物，然后从被免疫动物的血清中分离得到的；所述甘草酸抗原按如下过程制备：先将甘草酸溶解在N，N-二甲基甲酰胺、二氧六环或二甲基亚砜中，避光加入N-羟基琥珀酰亚胺，然后在0-10℃条件下与二环己基碳二亚胺反应2-5小时；接着与载体蛋白常温反应4-6小时，得到甘草酸抗原；在上述制备过程中，所述甘草酸溶解在N，N-二甲基甲酰胺、二氧六环或二甲基亚砜中后，其摩尔浓度在28.3mM-113.3mM；所述加入N-羟基琥珀酰亚胺的量为57.9mM-231.7mM；所述二环己基碳二亚胺的用量为121.2mM-484.7mM；所述载体蛋白的用量为0.09mM-0.37mM。

2、一种制备甘草酸抗体的方法，是用甘草酸抗原免疫动物，然后从被免疫动物的血清中分离得到甘草酸抗体，其特征在于：所述甘草酸抗原按如下过程制备：先将甘草酸溶解在N，N-二甲基甲酰胺、二氧六环或二甲基亚砜中，避光加入N-羟基琥珀酰亚胺，然后在0-10℃条件下与二环己基碳二亚胺反应2-5小时；接着与载体蛋白常温反应4-6小时，得到甘草酸抗原；在上述制备过程中，所述甘草酸溶解在N，N-二甲基甲酰胺、二氧六环或二甲基亚砜中后，其摩尔浓度在28.3mM-113.3mM；所述加入N-羟基琥珀酰亚胺的量为57.9mM-231.7mM；所述二环己基碳二亚胺的用量为121.2mM-484.7mM；所述载体蛋白的用量为0.09mM-0.37mM。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述载体蛋白需先在0-10℃条件下溶解于pH9-10的碳酸盐缓冲液中。

4、根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兰素蛋白或卵清白蛋白。

5、根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述得到甘草酸抗原后，对其进行透析或过sephadex G-25柱以除去未联结的甘草酸及有机溶剂，然后冷冻干燥以浓缩制备得到甘草酸抗原。

6、权利要求1所述的甘草酸抗体在鉴定中药材甘草真伪中的应用。

7、根据权利要求6所述的应用，其特征在于：鉴定过程包括如下步骤：

1)甘草和待测药材分别40-50℃水浸泡，取上清液作为标准液及样品液；

2)应用甘草酸抗体采用ELISA方法检测样品液；

3)通过观察样品液的颜色，鉴别样品的真伪。

8、根据权利要求7所述的应用，其特征在于：步骤2)所述应用甘草酸抗体采用ELISA方法检测样品液按如下步骤进行：

(1)用甘草酸包被抗原包被酶联板；

(2)向酶联板上同时加入甘草酸样品和甘草酸抗体，反应过后加入酶标二抗进行反应；

(3)加入OPD-H₂O₂溶液底物后终止反应。

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