CN101059514A

CN101059514A - 一种蛇毒抗原－抗体反应定量测定方法

Info

Publication number: CN101059514A
Application number: CN 200710028017
Authority: CN
Inventors: 孔天翰; 董伟华; 刘四红; 祁俊华; 陈熹; 陈学文
Original assignee: GUANGZHOU MEDICAL COLLEGE
Current assignee: GUANGZHOU MEDICAL COLLEGE
Priority date: 2007-05-15
Filing date: 2007-05-15
Publication date: 2007-10-24

Abstract

本发明公开了一种蛇毒抗原－抗体反应定量测定的方法，它包括以下步骤：(1)制备蛇毒抗原和抗体；(2)将蛇毒抗原和抗体混合后置于全温振荡器中进行预孵育，整个预孵育过程分为先振荡后静置两个时段；(3)在经过预孵育的抗原－抗体溶液中加入上样缓冲液，在100℃反应5～15min；离心，得到的上清液即为样品液；(4)使用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法对样品液进行电泳及显色，然后根据泳道染色条带的密度、迁移及消失的变化来定量分析蛇毒抗原－抗体反应特性。该方法以定量分析未知蛇毒抗原或未知抗体的纯度、分子量及免疫特性；还可以测定抗原和抗体结合的最佳比例，作为制备蛇伤特效药物及临床用药的参考，可有效解决现有抗蛇毒血清临床应用所存在的使用抗体过多而造成浪费和过少而疗效差的问题。

Description

一种蛇毒抗原-抗体反应定量测定方法

技术领域

本发明涉及生化领域中一种抗原-抗体反应定量测定的方法，尤其是涉及一种蛇毒抗原-抗体反应定量测定的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法。

背景技术

毒蛇的毒素(蛇毒)是一个巨大的生物资源宝库。自1963年英国人Reid第一次发现马来西亚红口蝮中含有引起纤维蛋白原下降的类凝血酶以来，蛇毒的综合利用开发日益受到人们的重视。1968年英国人研制成功了蛇毒制剂ARIN并首先投放市场，以治疗血管闭塞性疾病。近年来，随着多达数十种蛇毒产品(药品)面世，并且取得了不俗的临床疗效和销售业绩，蛇毒的开发利用正在成为国际生物学家、药学家及制药企业争相追逐的新热点。

除了蛇毒及其制剂之外，在抗蛇毒血清及IgY的研发、制备过程中，抗原、抗体的质量检验无疑是关键步骤之一。利用已知蛇毒检测待测抗体的效价及交叉免疫活性，或以已知抗体检验待测蛇毒的组分及杂质含量的方法有多种，其中蛋白质印迹(Westernblotting)技术无疑是目前最常用的方法之一。蛋白质印迹技术是在SDS-PAGE与固相免疫测定技术(ELISA)结合的基础上发展起来的，其主要操作过程可分为电泳、转印、酶免疫测定三个阶段：抗原先经SDS-PAGE或非变性电泳(Native-PAGE)等分离后，通过转移电泳原位转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面，然后用抗体对膜表面的抗原进行特异性免疫识别，再加入第二抗体及生色底物反应后，即可根据抗原显示的位置及色度定量分析抗体的特异性和敏感性。Western blotting在蛇毒、抗蛇毒抗体的质量检验的实际应用中还存在一定不足，如在转印过程中不可避免地损失了部分抗原，而且酶免疫的显色剂DAB有强致癌的潜在可能；并且在抗原和抗体有杂质时，检验的分别率低。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简便、安全的蛇毒抗原-抗体反应定量测定的方法，该方法可避免因转膜而致抗原损失而影响实验结果；而且该方法不受检验样品的纯度影响，具有极高的分辨率。

本发明的目的是通过以下技术措施来实现的：一种蛇毒抗原-抗体反应定量测定的方法，它包括以下步骤：

(1)制备蛇毒抗原和抗体；

(2)将蛇毒抗原和抗体混合后置于全温振荡器中在35～45℃的温度下进行预孵育，整个预孵育过程分为先振荡后静置两个时段；

(3)在经过预孵育的抗原-抗体溶液中加入上样缓冲液，在100℃反应5～15min，离心，得到的上清液即为样品液；

(4)使用SDS-PAGE电泳法对样品液进行电泳及显色，然后根据泳道染色条带的密度、迁移及消失的变化来定量分析蛇毒抗原-抗体反应特性。

本发明步骤(2)中所述的预孵育温度为35～45℃，优选为38℃。

本发明步骤(2)中所述的振荡时段的振荡时间为10～20min，振荡速度为80～120rpm/min；静置时段的时间为20～40min。因为适宜振荡能促进抗原-抗体的结合率，但振荡时间不宜过长，过长时间的振荡会使抗原-抗体结合后再解离，影响实验的准确性。振荡后的溶液静置促进在振荡期形成的抗原-抗体复合物聚合为更大的团块，然后通过离心去除。

本发明步骤(2)中所述的抗原和抗体混合根据不同的检测目的，分为以下四种形式：

①测定抗原/抗体最佳结合比例：定量标准蛇毒抗原与变量标准蛇毒抗体混合；

②测定抗体的稳定性等特性：定量标准蛇毒抗原与定量标准蛇毒抗体混合；

③测定共同抗体及特异性抗体，反之则测定共同抗原及特异性抗原：不同种、属的标准蛇毒抗原与单一标准蛇毒抗体混合；

④测定非标准蛇毒的种、属及杂质含量，或者测定非标准蛇毒抗体的效价及其它免疫特性：定量标准蛇毒抗体与变量非标准蛇毒抗原混合。

为既能够提高分辨率，又不会超出电泳设备的最大负载影响实验结果的可靠性，在本发明所述的步骤(3)中上样缓冲液的组成为：100mmol/L Tris.HCL(pH 6.8)；4％SDS；0.2％溴酚蓝；20％甘油；加入上样缓冲液后，控制抗原-抗体溶液中抗原的终浓度为1～12ug/ul，抗体的终浓度为3～35ug/ul。

本发明步骤(3)中所述的离心速度为5～15min，优选为10min；离心速度为10000～14000g/min，优选为12000g/min。离心可将抗原-抗体聚合物及大分子的复合物去除，而保留了小分子的复合物及未形成复合物的抗原、抗体，便于后期的电泳分析。但是离心速度不宜过快，过快会过多去除小分子复合物反而影响结果的可靠性。

本发明步骤(4)中所述SDS-PAGE凝胶组成成分为：分离胶8～12％，优选为10％；浓缩胶为4～6％，优选为5％。进行电泳时内外槽均用常规电极缓冲液，先在90V的电压下电泳30min；当样品进入分离胶，电压升至110V，当染料前沿到达凝胶下边缘时停止电泳。然后凝胶按常规显色、脱色及进行光密度扫描。

本发明将蛇毒抗原与抗体预处理后再经SDS-PAGE，通过观测抗原、抗体及抗原-抗体复合物在电场作用下的迁移率变化或相关条带的消失，以定量分析未知蛇毒抗原或未知抗体的纯度、分子量及免疫特性；还可以测定抗原和抗体结合的最佳比例，作为制备蛇伤特效药物及临床用药的参考，可有效解决现有抗蛇毒血清临床应用所存在的使用抗体过多而造成浪费和过少而疗效差的问题。在蛇毒抗原-抗体反应定量测定方面较蛋白质印迹(Western blotting)操作更简便、更安全，不会造成抗原的损失而影响检测结果的准确性；而且该方法不受检验样品的纯度影响，具有极高的分辨率。其在免疫学、微生物学及其他生命科学的研究中将有较好的应用前景。

附图说明

图1是眼镜蛇蛇毒抗原/抗体结合最佳比例测定的电泳图；

泳道1：为眼镜蛇毒100ug/ul，主要有F～K6个特征性条带；泳道7：为抗眼镜蛇毒IgY(27.5ug/ul)，主要有D、E2个条带；泳道2-6：为眼镜蛇毒+抗眼镜蛇毒IgY，眼镜蛇毒均为(10ug/ul)，而抗眼镜蛇毒IgY分别为6.87ug、13.75ug、20.6ug、27.5ug及34.37ug；

图2是眼镜蛇蛇毒抗眼镜蛇毒IgY酸碱稳定性测定的电泳图；

泳道1.Mark：标准蛋白质标记；

泳道2.NaV：标准眼睛蛇毒(10ug/ul)；

泳道3.IgY：标准抗眼镜蛇毒IgY(27.5ug/ul)；

泳道4～15：不同pH条件下IgY(27.5ug/ul)+NaV(10ug/ul)；

图3是眼镜蛇蛇毒抗眼镜蛇毒IgY热稳定性测定的电泳图；

泳道1～7分别为经90℃～30℃处理后的抗眼镜蛇毒IgY(27.5ug/ul)+眼镜蛇毒(10ug/ul)。

图4是眼镜蛇蛇毒抗眼镜蛇毒IgY交叉免疫活性测定的电泳图；

泳道1：眼镜蛇毒(NaV)；泳道2：NaV+抗眼镜蛇毒IgY；

泳道3：圆斑蝰蛇毒(VrC)；泳道4：VrC+抗眼镜蛇毒IgY；

泳道5：尖吻蝮蛇毒(DaV)；泳道6：DaV+抗眼镜蛇毒IgY；

泳道7：银环蛇毒(BmV)；泳道8：BmV+抗眼镜蛇毒IgY；

图5是眼镜蛇蛇毒中掺入其他杂蛋白的定量检测的电泳图；

泳道1：抗眼镜蛇毒IgY(27.5ug/ul)+标准眼镜蛇毒(10ug/ul)，加样量：4ul；

泳道2：抗眼镜蛇毒IgY(27.5ug/ul)+标准眼镜蛇毒(10ug/ul)，加样量：10ul；

泳道3：抗眼镜蛇毒IgY(27.5ug/ul)+标准眼镜蛇毒(10ug/ul)+血清白蛋白(1ug/ul)，加样量：10ul；

泳道4：抗眼镜蛇毒IgY(27.5ug/ul)+标准眼镜蛇毒(10ug/ul)+血清白蛋白(1ug/ul)，加样量：4ul；箭头处为浓染的血清白蛋白条带。

具体实施方式

以下的实施例均以眼镜蛇的蛇毒及抗眼镜蛇毒IgY为例对本发明进行具体的阐述，但是本发明的保护范围并不局限于此，本技术领域的普通技术人员通过以上内容也能实现本发明的目的。

实施例一：抗原/抗体结合最佳比例测定

(1)用蛇毒取毒器(专利号：ZL200420046279.9)分别提取眼镜蛇的毒液，制备成标准眼镜蛇毒冻干粉，4℃贮藏、备用。

(2)将标准蛇毒抗原与福氏佐剂乳化后注入鸡体内，2周后收集抗蛇毒IgY鸡蛋，采用水稀释法提取及硫酸铵盐析-阴离子交换层析纯化等步骤(参考专利申请号：200610035761.6的公开文本)，以制备眼镜蛇的单价抗蛇毒鸡卵黄抗体(IgY)。

(3)取标准眼镜蛇毒冻干粉和抗眼镜蛇毒IgY分别配制成标准眼镜蛇毒溶液和标准抗眼镜蛇毒IgY溶液。将标准眼镜蛇毒分别与标准抗眼镜蛇毒IgY按不同比例混合(见表1)，置于全温振荡器中在38℃孵育45min，其中振荡15min，振荡速度100rpm/min；静置30min。然后加入上样缓冲液，使标准眼镜蛇毒终浓度为10ug/ul，抗眼镜蛇毒IgY终浓度为6.87～34.35ug/ul。100℃反应5min，12000g/min，离心10min，得上清液。

所述的上样缓冲液的组成为：100mmol/L Tris.HCL(pH 6.8)；4％SDS；0.2％溴酚蓝；20％甘油。

配制SDS-PAGE凝胶：分离胶为10％，浓缩胶5％。

然后取上清液进行加样，每样品槽加10ul。内外槽均用常规电极缓冲液，先在90V的电压下电泳30min；当样品进入分离胶，电压升至110V，当染料前沿到达凝胶下边缘时停止电泳。然后凝胶按常规显色、脱色及进行光密度扫描。

表1.不同泳道的标准眼镜蛇毒/标准抗眼镜蛇毒IgY混合比例

样品组分	各泳道样品组分混合比例(ul)
	各泳道样品组分混合比例(ul)							1	2	3	4	5	6	7
	标准眼镜蛇毒(40mg/ml)标准抗眼镜蛇毒IgY(55mg/ml)PBS(pH 7.0，0.05mol/L)上样缓冲液(4x)	50012525	502510025	50507525	50755025	501002525	50125025	1	2	3	4	5	6	7	01007525

结果：标准眼镜蛇毒与不同比例的标准抗眼镜蛇毒IgY混合后，经38℃孵育、100℃变性及离心，可见明显的沉淀物。上清液加样经SDS-PAGE电泳后显示(参见图1)：泳道1为标准抗眼镜蛇毒，有5条特征性条带(F～K)，泳道7为标准抗眼镜蛇毒IgY，有2条特征性条带(D～E)，泳道2～5显示了在分离胶顶端新出现了A、B及C 3条迁移的浓染条带，分子量大于230KDa；随着抗体量的增加，抗原条带越来越淡(泳道2～4)，最后完全消失(泳道5～6)；泳道6与泳道5相比，抗体条带明显。该结果说明随着泳道2～6的抗体量逐渐增加，标准眼镜蛇毒条带在逐渐变淡直至最后消失，而两者因免疫反应所形成的可溶性抗原/抗体复合物即为分离胶顶端新出现的3个条带。由于泳道6显示了抗体条带，故说明抗体出现过剩现象。根据泳道5的抗体、抗原条带均消失的结果，可初步判定标准眼镜蛇毒与标准抗眼镜蛇毒IgY的结合最佳比例约为1∶2.75。

实施例二：抗眼镜蛇毒IgY稳定性测定

标准眼镜蛇毒和标准抗眼镜蛇毒IgY的提取制备与实施例一相同，得到眼镜蛇毒溶液和抗眼镜蛇毒IgY溶液后，进行抗眼镜蛇毒IgY酸碱稳定性测定和热稳定性测定。

(1)抗眼镜蛇毒IgY酸碱稳定性测定

用1mol/l HCL或NaOH将标准抗眼镜蛇毒IgY液pH值分别调至2、3、4、5、6、6.5、7、8、9、10、11及12，室温下静置30分钟后按2.75∶1与标准眼镜蛇毒混合，38℃孵育45min，其中振荡15min，振荡速度100rpm/min；静置30min。然后加入上样缓冲液，使标准眼镜蛇毒终浓度为10ug/ul，抗眼镜蛇毒IgY终浓度为27.5ug/ul。100℃反应5min，12000g/min，离心10min，得上清液。

配制SDS-PAGE凝胶：分离胶为10％，浓缩胶5％。

然后取上清液按预定顺序进行加样，每样品槽加10ul。进行电泳时内外槽均用常规电极缓冲液，先在90V的电压下电泳30min；当样品进入分离胶，电压升至110V，当染料前沿到达凝胶下边缘时停止电泳。然后凝胶按常规显色、脱色及进行光密度扫描。

结果显示：抗眼镜蛇毒IgY在pH值3-12下，IgY都可不同程度的中和抗原，引起抗原抗体条带迁移，在pH值6～7时中和抗原能力最强，可使所有的抗原条带消失。在pH值11-12条件下，抗体中和抗原能力明显下降，仅部分条带密度降低。当pH值小于3时，抗原抗体结构都被破坏。由此推断抗眼镜蛇毒IgY中和抗原的最佳pH值为6.5，有效pH值范围为3-12(参见图2)。

(2)抗眼镜蛇毒IgY热稳定性测定

抗眼镜蛇毒IgY溶于pH为6.5的磷酸盐缓冲液(PBS)，分别置30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃及90℃水浴中30min，冷至室温后按2.75∶1分别与标准眼镜蛇毒混合，38℃孵育45min，其中振荡15min，振荡速度100rpm/min；静置30min。然后加入上样缓冲液，使标准眼镜蛇毒终浓度为10ug/ul，抗眼镜蛇毒IgY终浓度为27.5ug/ul。100℃反应5min，12000g/min，离心10min，得上清液。

配制SDS-PAGE凝胶：分离胶为10％，浓缩胶5％。

结果显示(参见图3)：抗眼镜蛇毒IgY在70℃及其以下能保持活性，并能中和大部分抗原，使抗原条带发生迁移，当温度达到80℃以上，IgY发生蛋白变性，无抗原中和能力，所有的抗原带无迁移变化。

实施例三：交叉免疫活性测定

取标准抗眼镜蛇毒IgY分别与中华眼镜蛇、尖吻蝮、国产圆斑蝰及银环蛇毒按2.75∶1混合，样品处理同实施例一或实施例二，然后按预定顺序加样，每样品槽加10ul。电泳后染色，凝胶进行光密度扫描，根据相关蛇毒条带的消失或密度减低，定量分析单价抗蛇毒IgY与我国常见4种剧毒蛇毒间的交叉免疫活性及其效价。结果显示(参见图4)：与泳道1相比，泳道2中眼镜蛇毒所有条带均发生飘移，说明抗眼镜蛇毒能完全中和眼镜蛇毒；与泳道7相比，泳道8中银环蛇毒只有部分条带发生飘移或密度降低，说明抗眼镜蛇毒能部分中和银环蛇毒；蝰蛇毒和尖吻蝮蛇毒与抗眼镜蛇毒IgY共同孵育后，前两者的主要条带的密度虽没有显著变化，但浓缩胶中可见明显的抗原抗体复合物形成，说明有一定的交叉免疫反应(泳道3-6)。

实施例四：蛇毒中掺入其他杂蛋白定量检测

取标准抗眼镜蛇毒IgY(终浓度为27.5ug/ul)与标准眼镜蛇毒(终浓度为10ug/ul)及非标准眼镜蛇毒(10ug/ul标准眼镜蛇毒+1ug/ul血清白蛋白，终浓度为11ug/ul)分别混合，样品处理同实施例一或实施例二，然后按预定顺序加样。电泳后染色，凝胶进行光密度扫描，根据非标准眼镜蛇毒的泳道中新出现的抗原条带及其密度，可定量分析蛇毒中所掺入的杂蛋白。结果显示(参见图5)：泳道1、2中眼镜蛇毒所有条带均发生飘移，说明眼镜蛇毒中不含杂质；泳道3、4可见浓染的血清白蛋白位于原位(66kDa)，而其他所有的眼镜蛇毒条带均出现飘移。经光密度扫描，泳道3(加样量：10ul)血清白蛋白条带的光密度峰尖值为109.53，泳道4(加样量：4ul)为45.81。泳道3、4的样品加样量之比与血清白蛋白条带光密度峰尖值之比分别为1∶0.4及1∶0.42，两者基本吻合。

本发明的中所述的实验参数并不仅限于实施例所述的范围，在本发明内容中所公开的实验参数范围内均可实现本发明的目的。

Claims

1、一种蛇毒抗原-抗体反应定量测定的方法，其特征是：它包括以下步骤：

(1)制备蛇毒抗原和抗体；

(2)将蛇毒抗原和抗体混合后置于全温振荡器中进行预孵育，整个预孵育过程分为先振荡后静置两个时段；

(3)在经过预孵育的抗原-抗体溶液中加入上样缓冲液，在100℃反应5～15min；离心，得到的上清液即为样品液；

(4)使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法对样品液进行电泳及显色，然后根据泳道染色条带的密度、迁移及消失的变化来定量分析蛇毒抗原-抗体反应特性。

2、根据权利要求1所述的蛇毒抗原-抗体反应定量测定的方法，其特征是：步骤(2)中所述的预孵育温度为35～45℃；振荡时段的振荡时间为10～20min，振荡速度为80～120rpm/min；静置时段的时间为20～40min。

3、根据权利要求1或2所述的蛇毒抗原-抗体反应定量测定的方法，其特征是：步骤(2)中所述的抗原和抗体混合是定量标准蛇毒抗原与变量标准蛇毒抗体混合，用以测定抗原/抗体最佳结合比例。

4、根据权利要求1或2所述的蛇毒抗原-抗体反应定量测定的方法，其特征是：步骤(2)中所述的抗原和抗体混合是定量标准蛇毒抗原与定量标准蛇毒抗体混合，用以测定抗体的稳定性等特性。

5、根据权利要求1或2所述的蛇毒抗原-抗体反应定量测定的方法，其特征是：步骤(2)中所述的抗原和抗体混合是不同种、属的标准蛇毒抗原与单一标准蛇毒抗体混合，用以测定共同抗体及特异性抗体，或者是测定共同抗原及特异性抗原。

6、根据权利要求1或2所述的蛇毒抗原-抗体反应定量测定的方法，其特征是：步骤(2)中所述的抗原和抗体混合是定量标准蛇毒抗体与变量非标准蛇毒抗原混合，用以测定非标准蛇毒的种、属及杂质含量，或者是测定非标准蛇毒抗体的效价及其它免疫特性。

7、根据权利要求1所述的蛇毒抗原-抗体反应定量测定的方法，其特征是：所述的步骤(3)中上样缓冲液的组成为：100mmol/L Tris.HCL，pH为6.8；4％ SDS；0.2％溴酚蓝；20％甘油；加入上样缓冲液后，抗原-抗体溶液中抗原的终浓度为1～12ug/ul，抗体的终浓度为3～35ug/ul。

8、根据权利要求1所述的蛇毒抗原-抗体反应定量测定的方法，其特征是：所述的步骤(3)中所述的离心速度为5～15min；离心速度为10000～14000g/min。

9、根据权利要求1所述的蛇毒抗原-抗体反应定量测定的方法，其特征是：所述步骤(4)中的SDS-聚丙烯酰胺凝胶组成成分为：分离胶8～12％；浓缩胶为4～6％。

10、根据权利要求1所述的蛇毒抗原-抗体反应定量测定的方法，其特征是：所述步骤(4)中进行电泳时内外槽均用常规电极缓冲液，先在90V的电压下电泳30min；当样品进入分离胶，电压升至110V，当染料前沿到达凝胶下边缘时停止电泳；然后凝胶按常规显色、脱色及进行光密度扫描。