CN104471395A - 多重蛋白质定量标准物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供具有不同分子量多肽的蛋白质定量标准物，其用作电泳凝胶的一条泳道中作为质量定量标准。所述蛋白质定量标准物包括具有不同电泳迁移率并以不同量存在的未染色多肽，从而在观察时凝胶中的条带具有不同强度。所述蛋白质定量标准物还可包括预染色的多肽，其用作可见的分子量标志物。本发明还提供用所述蛋白质定量标准物确定靶多肽或蛋白质质量的方法。

Description

多重蛋白质定量标准物
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2012年6月28日提交的美国临时专利申请第61/665,425号的优先权，其通过引用全文纳入本文。
技术领域
本发明属于蛋白质检测领域，具体涉及对凝胶电泳中的蛋白质定量。
背景
凝胶电泳，包括聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，是用于评估蛋白质或多肽的分子量的常见实验室技术。凝胶电泳用于分离蛋白质，所述分离基于它们的电荷、大小和/或分子量。在非变性条件下，蛋白质可基于其荷质比分离，并且电泳迁移率受天然蛋白质的大小和形状影响。在变性条件下，例如存在阴离子去污剂例如十二烷基磺酸钠(SDS)，蛋白质会基于其分子量分离。阴离子去污剂会使蛋白质解折叠并提供均匀的负电荷密度，从而蛋白质的电泳迁移率是分子量的对数的线性函数。
对样品中蛋白质的量定量的方法为本领域已知，包括Bradford试验。Bradford试验依赖由已知蛋白质标准物生成的标准曲线来测定未知蛋白质的总量。然而，Bradford试验通常使用含有感兴趣蛋白质的溶液进行。若感兴趣蛋白质的消光系数已知，可使用分光光度法测量纯化的蛋白质的量。蛋白质的量还可通过偶联同位素标记方法(如ICAT、iTRAQ和串联治疗标签)的质谱来测定。然而，分光光度法受限用于溶液中纯蛋白质的测量。当前用于对SDS-PAGE凝胶中蛋白质定量的方法涉及从已知质量的纯化蛋白质的系列稀释液生成标准曲线，其中使各稀释液在凝胶的分开泳道中与含感兴趣靶蛋白的样品平行电泳。
本发明公开了用于对电泳凝胶中蛋白质的量定量的蛋白质定量标准物，以及测定凝胶中蛋白质的量的方法，而无需生成已知蛋白质质量的系列稀释或制备感兴趣蛋白质的纯化样品。
发明内容
本发明描述了蛋白质定量标准物，其可用于测定电泳凝胶中靶蛋白的质量(即含量或量)。所述标准物包含可用于生成质量标准曲线的未染色多肽组，用于测定所述凝胶中靶多肽的量。所述未染色多肽组可在混合物中提供，所述混合物适于加样和在凝胶的一个泳道中电泳分离。所述蛋白质定量标准物还可包括预染色多肽组，其可用作测定靶多肽分子量(即大小)的分子量梯度。因此，在一些实施方式中，所述蛋白质定量标准物可用于测定电泳凝胶中靶蛋白的分子量和质量。所述预染色多肽组和未染色多肽组可在混合物中提供，所述混合物适于加样和在凝胶的一个泳道中电泳分离。在电泳分离时，所述预染色多肽显示为凝胶上的条带，使得使用者可确定不同大小多肽之间的分离程度。靶蛋白通常在凝胶的另一泳道中加样，随后电泳分离。
因此，在一个方面，提供一种可加样到电泳凝胶的一条泳道中的蛋白质定量标准物，所述标准物包括未染色多肽组，其中所述未染色多肽组的成员具有不同的电泳迁移率并且以不同量存在，从而所述标准物适于从凝胶的一条泳道中生成蛋白质质量标准曲线。在一个实施方式中，所述未染色多肽组的不同成员具有不同的分子量和/或不同的电泳迁移率。在一个实施方式中，所述未染色多肽组的各成员具有与所述未染色多肽组的其他成员不同的分子量和/或不同的电泳迁移率。
在一些实施方式中，所述蛋白质定量标准物还包含具有不同分子量和/或不同电泳迁移率的预染色多肽组，从而所述标准物适于在凝胶的一条泳道中生成分子量梯度和蛋白质质量标准。在一个实施方式中，所述预染色多肽组的不同成员具有不同的分子量和/或不同的电泳迁移率。在一个实施方式中，所述预染色多肽组的各成员具有与所述预染色多肽组的其他成员不同的分子量和/或不同的电泳迁移率。在一些实施方式中，所述标准物的至少一种预染色多肽和至少一种未染色多肽具有不同电泳迁移率。
在一些实施方式中，所述蛋白质定量标准物在共同混合物中包含具有不同分子量的预染色多肽组和具有不同分子量的未染色多肽组，其中所述未染色多肽组的成员具有不同电泳迁移率且以不同的量存在，从而所述标准物适于在电泳凝胶的一条泳道中生成分子量梯度和蛋白质质量标准。所述蛋白质质量标准可用于从凝胶的一条泳道生成蛋白质定量标准曲线。
在另一实施方式中，本发明公开了用于测定靶蛋白的质量或量的方法。因此，在一些实施方式中，所述方法包括：使所述靶多肽在凝胶的一条泳道中电泳迁移，并使蛋白质定量标准物在凝胶的另一泳道中电泳迁移，其中所述蛋白质定量标准物包含具有不同电泳迁移率并以不同量存在的未染色多肽组；检测所述靶多肽和所述蛋白质定量标准物；和，将所述靶多肽的检测量与由所述蛋白质定量标准物生成的质量标准曲线做比较，从而确定靶蛋白的质量。在一些实施方式中，所述方法包括视觉比较凝胶中的靶多肽含量与凝胶或凝胶图像中的所述蛋白质定量标准物的条带，从而测定或评估所述靶多肽的质量或含量。所述方法还可检测含预染色多肽的蛋白质标准物，所述预染色多肽用于检测所述靶蛋白的表观分子量。所述未染色多肽可在凝胶分离完成期间或之后进行观察或检测，如本文详述。在一些实施方式中，所述检测包括无染剂成像。在一些实施方式中，所述检测包括荧光成像。在一些实施方式中，所述检测包括使所述未染色多肽与染剂或染料接触并观察所述多肽。所述方法可在变性凝胶例如SDS-PAGE凝胶上或非变形凝胶上实施。
在一些实施方式中，所述方法还包括使所述未染色多肽接触一种或多种配体，所述配体特异结合所述标准物的多肽。在一些实施方式中，所述一种或多种配体与生色或化学发光试剂偶联。
本发明还提供在微流体电泳装置或毛细管电泳装置中测定靶蛋白的质量的方法。因此，在一些实施方式中，公开了测定靶多肽质量的方法，所述方法包括：
使本文所述靶多肽和所述蛋白质定量标准物在微流体装置中电泳迁移；
检测所述靶多肽和所述蛋白定量标准物；和
将所述靶多肽的检测量与由所述蛋白质定量标准物生成的质量标准曲线做比较，从而确定所述靶多肽的质量。
本发明还提供测定靶多肽的质量或含量的计算机执行方法。所述计算机执行方法可用经过电泳分离所述蛋白质标准物的凝胶或凝胶图像进行。在一些实施方式中，所述计算机执行方法包括：
对蛋白质定量标准物中的未染色多肽定量，所述蛋白质定量标准物包含具有不同电泳迁移率并以不同量存在的未染色多肽组；
基于所述定量步骤生成回归拟合；
从所述回归拟合计算所述靶多肽的质量；和
提供所述经计算的质量。
所述回归拟合可为线性或非线性回归。在一些实施方式中，所述计算机执行方法受用可执行指令配置的一种或多种计算机系统的控制。
在另一方面，公开了用于进行本文所述方法的一个或多个步骤的计算机产品。在一个实施方式中，所述计算机产品包括永久性计算机可读介质，其储存多项指令，所述指令用于控制处理器进行一种或多种下述步骤的操作：
(i)接收数据，所述数据包括蛋白质定量标准物中的未染色多肽的量，所述蛋白质定量标准物包含具有不同电泳迁移率并以不同量存在的未染色多肽组；
(ii)基于所接收的数据生成回归拟合；
(iii)从所述回归拟合计算所述靶多肽的质量；和
(iv)提供所述经计算的质量。
在一些实施方式中，提供包含计算机产品的计算机系统，所述产品用于进行本文所述方法的一个或多个步骤。在一个实施方式中，所述计算机系统包括永久性计算机可读介质和一种或多种处理器，所述永久性计算机可读介质储存多项指令，所述指令用于控制处理器进行一种或多种下述步骤的操作：
(i)接收数据，所述数据包括蛋白质定量标准物中的未染色多肽的量，所述蛋白质定量标准物包含具有不同电泳迁移率并以不同量存在的未染色多肽组；
(ii)基于所接收的数据生成回归拟合；
(iii)从所述回归拟合计算所述靶多肽的质量；和
(iv)提供所述经计算的质量；且
所述处理器用于执行储存在所述计算机可读介质上的指令。
在一些上述实施方式中，所述回归拟合是线性回归拟合。在某些实施方式中，所述回归拟合是非线性回归拟合。
以下描述进一步实施方式。
附图说明
图1是凝胶或印迹成像的示意图，显示蛋白质定量标准物的一个实施方式的说明性示例。左侧：对应于预染色多肽的条带有色显示于左泳道中，对应于考马斯亮蓝染色多肽的条带在右泳道中显示。右侧：实际凝胶图像显示：左泳道中的所述标准物的预染色条带，和右泳道中的所述标准物的考马斯亮蓝染色条带。
图2是凝胶或印迹成像的示意图，显示多重蛋白质定量标准物的两个实施方式的说明性示例。各实施例的左泳道(“有色”)显示所述标准物的预染色蛋白质可用作分子量梯度。各实施例的中泳道显示所述标准物的未染色多肽可通过数种方法之一来检测，包括Western印迹之后的化学发光检测、考马斯亮蓝染色或无染剂检测。各实施例的右泳道(“Fluor激发”)提供代表性示例，显示用荧光激发观察时左泳道的预染色蛋白质的状态(所示荧光颜色和图谱仅用于示例)。在实施例1所示的实施方式中，所述标准物的未染色多肽群聚在表示预染色分子量标志物多肽的条带的其中两条之间的窄分子量范围内。实施例2说明了所述标准物的未染色多肽分布在表示预染色分子量标志物多肽的多重条带之间的实施方式。
图3显示图1的凝胶图像所示的蛋白质标准物的代表性标准曲线。
图4显示示例性计算机系统800的框图，其可用于本文所述实施方式的系统和方法。
定义
本文所用术语“预染色多肽”指经标记或与染料或染剂偶联的多肽。例如，所述多肽可用蓝色或粉色染料标记以在所述多肽在凝胶中迁移时提供有色标志。
本文所用术语“无染剂成像”指通过氨基酸色氨酸(Trp)和卤代有机化和物之间的紫外(UV)光依赖反应来使蛋白质可视化的方法，其导致在可见光范围内发荧光的产物。无染剂成像的示例如美国专利号第7,569,130和8,007,646所述，其通过引用全文纳入本文。
如本文所用，术语“化学发光”指化学反应引起的热量发射有限的能量发射。术语“增强的化学发光”指使用酶(如HRP)催化化学发光底物转变为敏化试剂。所述敏化试剂可被(例如通过过氧化氢)氧化产生三重羰基，其在衰变为单独羰基时发光。术语“化学发光试剂”指催化化学发光底物转变为敏化试剂的分子或酶。
术语多肽的“质量”指样品中给定蛋白质的绝对含量。所述质量可用样品中蛋白质或多肽的微克数表示，例如加样到电泳凝胶的一条泳道内的靶蛋白的微克数。
本文所用术语“标记物”或“可检测部分”指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。标记的示例是32P、荧光染料、高电子密度试剂、酶(例如，ELISA中常用)、生物素、地高辛以及可被检测的半抗原和蛋白或其他实体(例如通过将放射性标记物整合至肽中或用于检测与肽特异性反应的抗体)。所述标记物可整合至例如抗体和/或其它蛋白质的任何位置。可以采用本领域已知的用于使抗体接合所述标记物的任何方法，例如，使用如下文献中所述的方法：Hermanson，Bioconjugate Techniques(《生物结合技术》)1996，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，圣迭戈。或者，使用高亲和性相互作用的方法可以获得相同的效果，其中一对结合伴侣(binding partner)中的一个能够结合另一个，例如生物素和链霉亲和素。本文所述蛋白质可直接标记有同位素、发色团、发光团、色原体，或者被间接标记，例如通过生物素，该生物素随后可被复合体中的链霉亲和素(包含荧光、放射性或可被直接检测的其他部分)结合。因此，生物素化的抗体被认为是本文使用的“经标记的抗体”。
本文所用术语“抗体”指一种或多种免疫球蛋白基因编码的多肽或其片段，其特异结合并识别抗原，所述抗原例如所述标准物的多肽或作为所述标准物的融合蛋白的部分的肽标签。识别的免疫球蛋白轻链被归类为κ或λ。免疫球蛋白重链分为γ、μ、α、δ或ε，它们进而分别定义免疫球蛋白类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
涉及蛋白质、肽或抗原时，描述与抗体或配体结合的术语“特异性(或选择性)”或“特异性(或选择性)与…发生免疫反应”或“具有对…的结合特异性”指能在蛋白质和其它生物物质的异质群体存在的情况下确定是否存在蛋白质、肽或抗原的结合反应。因此，在给定的条件下，特定的抗体结合样品或所述蛋白质标准物中的特定蛋白质而不以显著量结合样品或所述蛋白质标准物中存在的其他蛋白质。在这样的条件下与抗体的特异性结合可能需要就抗体对特定蛋白质的特异性来选出的抗体。例如，可以选择针对某一蛋白质产生的抗体以得到不与其他蛋白质而与该蛋白质发生特异性免疫反应的抗体。可利用各种免疫测定形式来选择与特定蛋白质发生特异性免疫反应的抗体。例如，常规使用固相ELISA免疫测定、Western印迹或免疫组化法来选择与某一蛋白质发生特异性免疫反应的单克隆抗体。参见，Harlow和Lane，Antibodies,A Laboratory Manual(《抗体，实验室手册》)，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Publications)，纽约(1988)，来获得关于可用于确定特定免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述。通常，特异性或选择性反应会是背景信号或噪音的至少2倍，更通常而言是超过背景10至100倍。
本文所用术语“固体支持物”指固体惰性表面或物体，其上可固定试剂例如蛋白质或多肽。本文所用术语“固定”指分子基础的偶联，其在本文所述试验的任意步骤期间、在任意施加的条件下都不会移开或去偶联。这类固定可通过共价键、离子键、亲和型键或任意其他化学键实现。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。如本文所用，该术语涵盖任意长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中所述氨基酸残基通过共价肽键连接。所述多肽可为天然或重组的，并且可含有天然或非天然氨基酸。所述蛋白质可为融合蛋白，所述融合蛋白包含来自异源蛋白质或多肽的氨基酸，或在所述蛋白质的氨基(N)或羧基(C)末端添加的人工肽。
术语“融合蛋白”指含来自两种或更多种异源或不同的肽或多肽的氨基酸通过肽键连接的多肽。融合蛋白可从重组核酸分子生产，所述重组核酸分子编码所述两种或更多种异源肽或多肽，从而所述多肽在框内连接。短语“在框内连接”指连接编码多肽的两种或更多种多核苷酸序列，从而所述连接的核酸序列翻译为含有融合在一起的原始多肽的单链多肽。所述融合蛋白还可通过所需氨基酸序列的肽合成来生产。
术语“配体”指特异且可逆结合其他化学实体、化合物或多肽以形成复合物的化合物或分子。
术语分子量梯度和分子量标志物可互换使用，指电泳分离时在凝胶上显示为已知大小的条带的多肽。
所选实施方式详述
本发明提供蛋白质定量标准物，其用于对(例如凝胶电泳中的)样品中感兴趣多肽(本文有时称为靶蛋白或靶多肽)的含量或质量定量。在一些实施方式中，所述蛋白质定量标准物还用作凝胶电泳中的分子量标志物。因此所述蛋白质定量标准物可具有双重功能，在凝胶电泳设备的单个泳道中作为质量定量标准物和分子量标志物。本发明还提供包含所述蛋白质定量标准物的试剂盒。本发明还提供测定样品中靶多肽的质量的方法，包括计算机执行方法。所述方法还可测定靶蛋白的质量和大小。所述靶多肽可为已知或未知多肽。
I.蛋白质定量标准物
本发明提供的蛋白质定量标准物包含具有不同电泳迁移率和不同质量的多种多肽，其适于在凝胶的一个泳道中产生蛋白质质量标准。所述蛋白质定量标准物可用于从凝胶的一条泳道生成蛋白质定量标准曲线。当前对SDS-PAGE凝胶中蛋白质定量的方法涉及从已知含量的纯化蛋白质的系列稀释液生成标准曲线，其中使各稀释液在凝胶的分开泳道中与含感兴趣靶蛋白的样品平行电泳。因此现有的方法使用凝胶的多个泳道来生成标准曲线(例如3-5个泳道或更多，取决于生成所述标准曲线所需的数据点)，这就为感兴趣的靶蛋白的加样留下很少的可用泳道。因此，使用现有方法时凝胶上很大一部分泳道无法用于分析感兴趣的蛋白质。本发明人出人意料地发现通过使用具有不同电泳迁移率(或不同表观分子量)的不同含量的多肽，可从凝胶的单个泳道中生成标准曲线。
在一些实施方式中，所述蛋白质定量标准物包含未染色多肽组，其中该未染色多肽组的成员具有不同电泳迁移率且以不同质量存在。在一些实施方式中，所述蛋白质定量标准物包含预染色多肽组，其中该预染色多肽组的成员具有不同电泳迁移率和/或不同分子量。在一些实施方式中，所述蛋白质定量标准物包含预染色多肽和未染色多肽的混合物。在一些实施方式中，所述标准物包含具有不同分子量的预染色多肽组和具有不同分子量的未染色多肽组，其中所述未染色多肽组的成员具有不同电泳迁移率且以不同的质量存在，从而所述标准物适于在凝胶的一条泳道中生成分子量梯度和蛋白质质量标准。例如，在一些实施方式中，所述未染色多肽组的各成员具有不同电泳迁移率且以不同量存在，从而在电泳分离后观察或检测时，凝胶上的各条带具有不同强度。所述多肽可为天然或重组蛋白质。在一些实施方式中，所述多肽是融合蛋白。
A.所述标准物的预染色多肽
所述标准物的预染色多肽可用作凝胶电泳的分子量梯度或标志物，其中所述多肽在经凝胶电泳分离时在凝胶基质中显示为条带。在一些实施方式中，所述预染色多肽用一种或多种有色染料标记。所述一种或多种有色染料还可为荧光染料。所述预染色多肽可(例如)使用户视觉监控电泳的进程，或视觉监控凝胶向固体支持物的转移，而无需用染料例如考马斯亮蓝对所述凝胶进行染色。所有预染色多肽可用相同有色染料染色或一些预染色多肽可用不同有色染料和/或不同荧光染料染色，从而使用户更容易区分具有不同分子量的多肽。在一些实施方式中，所述一种或多种有色染料包含单一有色染料。在一个实施方式中，所述一种或多种有色染料包含不同有色染料的组合。例如，所述标准物中的一些多肽可染为粉色，作为已知分子量(例如25、50和75kDa)的参考条带，而所述标准物中的其他多肽可染为蓝色。所用染剂可为本领域技术人员容易获得的市售蛋白质染剂和染料。例如，蛋白质结合染料可为共价结合至多肽的任何染料。在一些实施方式中，所述染料肉眼可见，例如发色团。本领域熟知将染料偶联到蛋白质上的方法，例如到蛋白质N末端、组氨酸、色氨酸、赖氨酸残基的氨基基团；半胱氨酸的巯基基团；天冬氨酸和谷氨酸的羧基基团；甲硫氨酸的硫醚，和酪氨酸的酚根(参见例如Hermanson,Bioconjugate Techniques(《生物偶联技术》),学术出版社(Academic Press),圣地亚哥(1996)；Wong,Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking(《蛋白偶联和交联化学》),CRC出版社,卡拉顿,1993；Haugland,MOLECULAR PROBESHANDBOOK(《分子探针手册》)(2002))。对多肽染色的方法示例参见美国专利号第7265206号，其通过引用全文纳入本文。在一些实施方式中，所述预染色多肽用荧光染料标记。在一些实施方式中，预染色多肽组用有色染料和荧光染料的组合标记。在一个实施方式中，预染色多肽组的各成员可用不同有色染料或不同荧光染料标记。在一些实施方式中，所述预染色多肽在凝胶上产生观察或检测时看起来具有相似染色强度的条带。
在一些实施方式中，所述标准物的预染色多肽具有不同分子量但具有相似的质量。换句话说，一种或多种所述预染色多肽在凝胶上分离时具有不同的表观大小，但看起来在所述凝胶的一个或多个条带中具有相似含量的蛋白质。在一些实施方式中，所述标准物的预染色多肽具有不同分子量和不同质量，从而当在凝胶中分离时，一种或多种预染色多肽看起来在所述凝胶的一个或多个条带中具有不同含量的蛋白质。
在一些实施方式中，所述标准物的预染色多肽大小范围为约2kDa–约250kDa。在一些实施方式中，所述预染色多肽大小范围为约2kDa–约500kDa。应理解，如本文所述，范围可包括端点和其间所有点。例如，所述预染色多肽可为约2kDa、5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、37kDa、50kDa、75kDa、100kDa、150kDa和250kDa。所述标准物可包括大小范围为约2kDa–约500kDa的预染色多肽的混合物。
在一些实施方式中，所述标准物包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种具有不同分子量和/或不同电泳迁移率的预染色多肽。
在一些实施方式中，所述预染色多肽可用无染剂成像观察或检测。例如，所述无染剂成像可使用卤代有机化合物。暴露在UV辐射下时，所述卤代有机化合物与所述多肽中的色氨酸残基共价反应，形成用UV光(例如来自UV透照器)照射时发荧光的化合物。例如，所述多肽可用约280nm–约320nm的UV光照射。所述荧光多肽可肉眼观察或用成像仪器观察。所述卤代有机化合物可在电泳之前或之后纳入凝胶中。多种卤代有机化合物可用于本发明的实施方式中，实际上，可以使用会与色氨酸发生化学反应以形成暴露在激发光下会产生荧光的物质的任何卤代有机化合物。特别感兴趣的卤代有机化合物是三卤代化合物，尤其是三氯化合物和分子量为200或更低的那些。三卤代脂肪醇、三卤代脂肪酸、三卤代脂肪胺和三卤代脂肪烷都是有用的。特定的示例是氯仿、三氯乙酸和三氯乙醇。卤代有机化合物可单独使用或联用，例如两种或三种这类化合物以大致相等的摩尔比联用。用无染剂成像检测蛋白质的方法如美国专利号第7,569,130和8,007,646所述，其通过引用全文纳入本文。
在一些实施方式中，所述预染色多肽可用荧光成像观察或检测。例如，在一些实施方式中，染上蓝色的多肽在用合适波长照射时显示为红色条带(例如当所述多肽用Uniblue ATM(蓝色染料)标记并用红光激发时，产生另一红移的荧光)。在一些实施方式中，染上红色的多肽在用合适波长照射时显示为黄色条带(例如当所述多肽用TRITC(红色染料)标记并用绿光激发时，产生淡黄的荧光)。对所述多肽的荧光成像的可视化可通过使用约280nm–约320nm的UV光激发源实现。在一些实施方式中，所述预染色多肽可用激发源例如激光或LED光以窄波长范围照射，例如约488nm(蓝)、约555nm(绿)或约630nm(红)。如本领域技术人员所知，所述激发波长的荧光发射光谱具有比激发波长更长的波长，且所述发射光谱可在将接近和低于所述激发波长的光滤除之后检测。例如，在一些实施方式中，所述激发波长用530nm、605nm和/或695nm带通滤波器过滤。然而，应知晓合适的滤波器的选择取决于蛋白质染料或染剂的激发和发射特征。在一些实施方式中，用于预染色多肽的染料在短波长(UV)(例如来自UV透照器)和长波长(例如约555nm绿光或约630nm的红光)处均具有强的荧光激发，且会在甚至更长的波长(例如在约576nm用绿光激发)发射荧光能量。在一些实施方式中，所述染料在肉眼可见的波长内具有明亮色彩，但用荧光成像观察时信号减弱。
在一些实施方式中，所述预染色多肽可用近红外成像观察。例如，本文所述用染料标记的多肽可用650-800nm波长能量激发，且激发的染料会在约670-820nm波长释放能量。
B.所述标准物的未染色多肽
所述定量标准物的未染色多肽可用于对靶多肽的含量或质量定量。例如，在一些实施方式中，所述未染色多肽可用于在凝胶用染料(例如考马斯亮蓝)染色后视觉评估靶多肽的质量。在一些实施方式中，所述未染色多肽可用于使用所述标准物中的一种或多种未染色多肽的已知蛋白质质量生成标准曲线。在一些实施方式中，所述标准物包含具有不同分子量的多种未染色多肽或未染色多肽组，其中具有相同分子量的未染色多肽具有与标准物中其他未染色多肽不同的质量。因此，标准物中具有相同大小的一种或多种未染色多肽的含量可与标准物中具有不同大小的其他未染色多肽的含量不同。例如，具有第一分子量的第一未染色多肽的质量可与具有第二分子量的第二未染色多肽的质量不同。各未染色多肽的含量可经选择，从而生成涵盖预期质量的感兴趣靶蛋白的标准质量曲线。用于生成所述标准曲线的各未染色多肽的含量可通过例如密度分析扫描凝胶泳道中的条带来测定。
在一些实施方式中，所述未染色多肽可用本文所述的无染剂成像观察或检测。在一些实施方式中，所述未染色多肽可用于测量蛋白质的量，使用对所述凝胶中条带强度的无染剂成像。在一些实施方式中，所述未染色多肽可用于测量蛋白质的量，使用对所述凝胶转移到固体支持物后的条带强度的无染剂成像。固体支持物的示例本领域已知，包括硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。
在一些实施方式中，所述未染色多肽可用本文所述近红外成像观察。例如，所述未染色多肽可用合适的染料例如考马斯亮蓝染色，并用近红外成像观察。所述未染色多肽还可转移到固体支持物上(例如Western印迹中的尼龙膜)，与合适的抗体-染料或蛋白质-染料偶联物接触，并用近红外成像观察。
所述未染色多肽还可在凝胶基质中或在转移到固体支持物之后使用荧光染剂例如Ruby(生命技术公司)或FlamingoTM染剂(生物辐射公司)来观察。在一些实施方式中，所述未染色多肽还可使用本文所述的一种或多种可视化方法在电泳进行时在凝胶基质中观察。
在一些实施方式中，所述未染色多肽可通过将所述未染色多肽与对所述未染色多肽具有高亲和性或高特异性的抗体或配体接触来检测。所述抗体或配体可用可检测部分标记或偶联，例如荧光染料或生色或化学发光试剂。
在一些实施方式中，所述未染色多肽包含具有亲和标签的融合蛋白。亲和标签的示例包括N末端或C末端聚组氨酸标签，其可通过结合至含结合金属离子(如镍钴)的柱或树脂来进行所述多肽的亲和纯化。所述亲和标签还可包括结合链霉亲和素、工程改造的链霉亲和素(例如II)或其他配体的其他短氨基酸肽。
所述未染色多肽还可包括含生色和/或化学发光检测标签的融合蛋白。例如，所述标准物的多肽可重组生产为融合蛋白，其含有用作检测标签的短氨基酸序列。在一些实施方式中，所述检测标签与特异结合该检测标签但不结合样品中其他蛋白质的抗体接触。在一些实施方式中，结合所述检测标签的抗体直接偶联至可用于产生生色或化学发光反应的酶。在一些实施方式中，所述酶是用于生色或化学发光检测的碱性磷酸酶(AP)或用于化学发光检测的HRP。若使用AP，所述带标签多肽可用生色底物磷酸对硝基苯酯检测，其产生在405nm处可检测的可溶产物。对于化学发光检测，HRP酶可与底物鲁米诺(luminol)和任选的增强剂一起孵育。若使用HRP，所述带标签多肽还可用生色底物四甲基联苯胺(TMB)检测，其在过氧化氢存在下产生在450nm处可检测的可溶产物。在一些实施方式中，所述亲和标签还可作为检测标签。例如，聚组氨酸标签可结合Ni-NTA-碱性磷酸酶偶联物，然后将其与氯化硝基氮蓝四唑(NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸对甲苯胺盐(BCIP)一起孵育，从而检测Western印迹中的多肽(参见Hochuli,E.,和Piesecki,S.,Methods:A Companion to Methods in Enzymology(《方法：酶学方法手册》)4:68-72(1992))。
在一些实施方式中，使结合所述检测标签的抗体与二级抗体接触，所述二级抗体偶联至可用于产生生色或化学发光反应的酶。在一些实施方式中，所述检测标签能结合链霉亲和素或工程改造的链霉亲和素。例如，在一些实施方式中，使含有检测标签的融合蛋白与偶联HRP的工程改造的链霉亲和素(例如-HRP)接触。所述多肽还可包含融合蛋白，所述融合蛋白包括特异结合IgG抗体的肽序列。在一些实施方式中，用户可使用一级和二级抗体检测所述标准物的多肽，所述一级和二级抗体与在凝胶中加样的样品中蛋白质的化学发光检测所用的相同。
在一些实施方式中，所述未染色多肽包含氨基酸色氨酸(Trp或W)用于改善无染剂定量。例如，所述未染色多肽可经选择或工程改造以具有特定的色氨酸量用于本文所述的无染剂方法的定量。在一些实施方式中，所述未染色多肽包含相同、几乎相同或基本相似(例如差异不多于5％)比例的色氨酸，这样可用所述多肽的质量来评定色氨酸的含量。在一些实施方式中，所述多肽经工程改造以具有平均色氨酸含量，其与在凝胶上加样的样品中蛋白质的平均色氨酸含量匹配。在一些实施方式中，所述色氨酸的含量为所述标准物中多肽的约1.5％-约2.5％(即所述标准物的各多肽中约1.5％-约2.5％的氨基酸是色氨酸)。
在一些实施方式中，所述未染色多肽的大小可经选择，从而进行凝胶电泳时所述未染色多肽的分子量集中在相对窄的范围内。例如，如图2所示(实施例1)，在一个实施方式中，所述未染色多肽的分子量落在所述分子量梯度的两种连续预染色多肽的分子量之间。在一些实施方式中，所述未染色多肽可在凝胶上加样的样品中感兴趣的靶蛋白的大小范围内进行选择。例如，单个未染色多肽的分子量可选为邻近感兴趣的靶蛋白的分子量，从而一些未染色多肽的分子量小于所述靶蛋白，而一些未染色多肽的分子量大于所述靶蛋白。
在其他实施方式中，所述未染色多肽的大小可经选择，从而单个多肽的分子量在预染色多肽的分子量之间分布或分散。例如，如图2所示(实施例2)，在一个实施方式中，所述未染色多肽条带经过凝胶电泳分布在分子量梯度的多重预染色多肽条带之间。在一个实施方式中，未染色多肽在凝胶中邻近两种预染色多肽。因此，在一些实施方式中，所述未染色多肽组的一个成员的分子量小于第一预染色多肽的分子量，且大于第二预染色多肽的分子量。在一些实施方式中，所述未染色多肽大小范围为约2kDa-约500kDa、约2kDa-约250kDa、约2kDa-约100kDa、约20kDa-约100kDa或约20kDa-约50kDa。
在一些实施方式中，所述标准物包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种具有不同分子量和/或不同电泳迁移率的未染色多肽。
在一些实施方式中，所述蛋白质定量标准物包含未标记形式或未染色形式的预染色多肽(即具有与预染色多肽相同的氨基酸序列的未染色多肽)。在一个实施方式中，所述蛋白质定量标准物包含相同多肽的未染色形式和预染色形式的混合物。在一些实施方式中，所述预染色多肽与具有相同氨基酸序列的未染色多肽在凝胶中表现出相同的表观分子量和迁移。
II.方法
本发明还提供测定靶多肽质量的方法。在所述方法的一个示例中，使含靶蛋白或多肽的样品和所述蛋白质定量标准物进行凝胶电泳以根据大小、电荷和/或形状分离所述多肽。在一些实施方式中，所述多肽在变性凝胶中电泳分离。例如，在一个实施方式中，所述多肽在SDS-PAGE凝胶中电泳分离。在一些实施方式中，所述多肽在非变性凝胶(即天然凝胶电泳)中电泳分离。例如，在一个实施方式中，所述多肽在无SDS的聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离。所述多肽可在有或无SDS的Tris-甘氨酸凝胶中电泳分离。在一些实施方式中，所述靶蛋白和所述蛋白质定量标准物在凝胶的不同泳道中电泳迁移。在一些实施方式中，所述标准物包含具有不同电泳迁移率和不同量的未染色多肽组。在一些实施方式中，所述标准物包含预染色多肽组，所述预染色多肽组可用于在电泳进行和多肽在凝胶基质中迁移时视觉监控所述多肽条带迁移。因此在一些实施方式中，本方法还包括检测蛋白质标准物的预染色多肽条带以确定所述靶蛋白的表观分子量。所述预染色多肽可与未染色多肽一同包含在所述蛋白质定量标准物中，或其可在本领域已知的单独分子量标准物中提供。
确定所述标准物的多肽在凝胶中充分分离后，所述标准物的未染色多肽可被染色。例如，所述未染色多肽可用染料例如考马斯亮蓝染色。在一些实施方式中，所述未染色多肽包含已知质量的各多肽，其可用于生成标准曲线以对靶蛋白的质量定量。在一些实施方式中，所述标准曲线通过对条带进行密度分析测量生成，所述条带对应于所述标准物的未染色多肽。所述定量标准物还可用于生成标准曲线以基于其分子量评估靶蛋白的大小。图1显示代表性的凝胶，显示用考马斯亮蓝染色的蛋白质标准物。图3显示图1中的凝胶图像生成的标准曲线。为了测定相同凝胶上上样的靶蛋白含量，用户可通过比较其和凝胶中或标准曲线上所述蛋白质标准物的条带强度来视觉评估该未知靶蛋白的量，或者根据标准曲线拟合一条曲线并基于测量的条带强度计算该未知蛋白质含量。在其他实施方式中，所述预染色多肽包含已知质量的各多肽，其可用于生成标准曲线以对靶蛋白的质量定量。
在一些实施方式中，靶多肽的质量通过基于用凝胶中多肽条带的无染剂成像定量所述标准物的未染色多肽所生成的标准曲线来确定。在一些实施方式中，靶多肽的质量通过基于用Western印迹定量所述未染色多肽所生成的标准曲线来确定。例如，可将凝胶中的多肽转移到固体支持物上，并通过使该固体支持物上的多肽接触特异结合各多肽的抗体来检测所述多肽。因此在一些实施方式中，靶多肽的质量通过比较结合至所述靶蛋白的抗体含量和结合至标准物中的已知质量的各多肽的抗体含量来确定。在一个实施方式中，标准曲线可由Western印迹中的条带强度生成。在一些实施方式中，所述抗体结合用化学发光试验检测。
在一些实施方式中，所述方法可测定微流体电泳装置或毛细管电泳装置中靶蛋白的质量。例如，所述蛋白质定量标准物可在微流体电泳装置(例如生物辐射公司的ExperionTM自动化电泳工作站)中电泳。在一些实施方式中，所述自动化方法还可测定靶蛋白的分子量。
微流体电泳分析使用填充有聚合凝胶的微流体通道，以根据大小分离变性蛋白质。在典型的微流体电泳试验中，运行含未染色分子量标志物组的参比样品，用于计算连续通道中运行的感兴趣蛋白质的分子量。在一些实施方式中，使所述参比样品与本文所述蛋白质定量标准物一起运行。含有感兴趣靶蛋白的样品在不同通道中分离。然后靶蛋白的质量可用由所述蛋白质定量标准物生成的质量标准曲线来确定。在一些实施方式中，在含有靶蛋白的样品中添加已知量的参比蛋白，并且所述质量标准曲线可与样品的参比蛋白(作为标准化因子)联用以更精确地确定靶蛋白的质量。
A.计算机执行的方法和系统
本文所述任何方法均可全部或部分地使用包括一个或多个处理器的计算机系统进行，可对其进行配置以完成所述方法的步骤。因此，实施方式可涉及经配置以进行本文所述任意方法的步骤的计算机系统，其中不同组分可能进行相应步骤或相应步骤组合。虽然以编号或顺序的步骤形式显示，但本文中方法的步骤可同时或以不同顺序进行。此外，这些步骤的部分可与来自其他方法的其他步骤的部分一同使用。同样，步骤的全部或部分可以是任选的。此外，任何方法的任何步骤都可使用模块、循环或用于进行这些步骤的其他手段进行。
因此，在一个实施方式中，提供计算机执行方法以确定靶多肽的质量。在一个实施方式中，所述计算机执行方法受用可执行指令配置的一种或多种计算机系统控制，其包括如下步骤：
i.确定凝胶图像中存在蛋白质定量标准物；
ii.鉴定所述标准物中的定量多肽条带；
iii.对所述标准物中的定量多肽条带定量；
iv.生成线性或非线性回归拟合，例如强度对比质量的校准曲线；和
v.从所述回归拟合计算所述靶蛋白质量；和
vi.提供所述经计算的质量。
在一些实施方式中，所述计算机执行方法通过计算机系统执行，该系统与能够检测凝胶或凝胶图像中条带的图像扫描仪电子通讯。所述计算机执行方法可基于对凝胶的一个泳道中的多肽条带定量来确定在所述凝胶另一泳道上加样的靶蛋白的质量。在一些实施方式中，所述计算机执行方法使用下述方式确定标准曲线：点对点半对数(point-to-point semi-log)、或ES(Elder-Southern)、逻辑、线性、二次、三次或三次样条函数的回归分析。
本发明还提供能进行本文所述方法的任一或所有步骤的计算机产品。因此在一些实施方式中，所述计算机产品包括永久性计算机可读介质，其储存用于控制处理器进行本发明所述方法的一种或多种步骤操作的多项指令。在一些实施方式中，所述计算机产品包括永久性计算机可读介质，其储存多项指令，所述指令用于控制处理器进行一种或多种下述步骤的操作：
i.确定凝胶图像中存在蛋白质定量标准物；
ii.鉴定所述标准物中的定量多肽条带；
iii.对所述标准物中的定量多肽条带定量；
iv.生成线性或非线性回归拟合，例如强度对比质量的校准曲线；和
v.从所述回归拟合计算所述靶蛋白质量；和
vi.提供所述经计算的质量。
在一些实施方式中，所述计算机产品包括永久性计算机可读介质，其储存多项指令，所述指令用于控制处理器进行一种或多种下述步骤的操作：
(i)接收数据，所述数据包括蛋白质定量标准物中的未染色多肽的量，所述蛋白质定量标准物包含具有不同电泳迁移率并以不同量存在的未染色多肽组；
(ii)基于所接收的数据生成回归拟合；
(iii)从所述回归拟合计算所述靶多肽的质量；和
(iv)提供所述经计算的质量。
在一些实施方式中提供系统，该系统包括上述计算机产品，和用于执行储存在计算机可读介质上的指令的一个或多个处理器。
图4显示示例性计算机系统800的框图，其可用于本文所述实施方式的系统和方法。
本文所述任何计算机系统可利用任何适当数目的子系统。这类子系统的示例如图4中计算机设备800所示。在一些实施方式中，计算机系统包括单个计算机设备，其中子系统可以是该计算机设备的组件。在其他实施方式中，计算机系统可包括多个计算机设备，其各是一个子系统，具有内部组件。
图4所示的子系统经由系统总线875互联。显示了其他子系统，如打印机874、键盘878、储存装置879、与显示适配器882偶联的监视器876等。与输入/输出(I/O)控制器871偶联的周边和I/O装置可通过任何数量的本领域已知方式(如串行端口877)连接至计算机系统。例如，串行端口877或外部接口881(例如以太网、Wi-Fi等)可用于将计算机系统800连接至广域网(如因特网)、鼠标输入装置或扫描仪。经由系统总线875的互联允许中央处理器873与各子系统连通并控制来自系统内存872或储存装置879(例如固定磁盘，如硬盘或光盘)指令的执行以及子系统间信息的交换。系统存储器872和/或储存装置879可包含计算机可读介质。本文所述的任何数据都可从一种组件输出至另一种组件并可输出至用户。
计算机系统可包括多种相同的组件或子系统，例如通过外部接口881或通过内部接口连接在一起。在一些实施方式中，计算机系统、子系统或设备可通过网络连通。在这种情况下，可将一台计算机作为客户端并将另一台计算机作为服务器，其中各计算机都可以是同一计算机系统的部分。客户端和服务器可各包括多个系统、子系统或组件。
应理解，上述实施方式可使用硬件(例如专用集成电路或现场可编程门阵列)以控制逻辑的形式和/或采用一般可编程的处理器使用计算机软件以模块化或集成化的方式来实施。如本文中所用，处理器包括同一集成芯片上的多核处理器或者单个电路板上或网络连接的多个处理单元。基于本发明的公开和教导，本领域普通技术人员应知晓并理解使用硬件以及硬件和软件的组合来实施本发明的实施方式的其他方式和/或方法。
本申请中描述的任何软件组件或函数都可作为软件代码使用，以由处理器使用任何适当的计算机语言(如Java、C++或Perl)、使用例如常规或面向对象的技术来执行。软件代码可作为一系列指令或命令储存于计算机可读介质上用于储存和/或传输，合适的介质包括随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、磁性介质(如硬盘或软盘)、光学介质(如光盘(CD)或DVD(数字多功能光盘)、闪速存储器等)。计算机可读介质可以是这类储存或传输装置的任意组合。
也可使用适用于传输的载波信号经由遵循多种协议的有线、光纤和/或无线网络(包括因特网)编码和传输这类程序。同样，可使用这类程序编码的数据信号根据本发明的实施方式创建计算机可读介质。程序代码编码的计算机可读介质可与兼容装置打包或由其他装置单独地提供(例如通过因特网下载)。任何这类计算机可读介质可存在于单个计算机产品(例如硬盘、CD或整个计算机系统)之上或之内，且可存在于系统或网络中不同计算机产品之上或之内。计算机系统可包括监视器、打印机或其他合适的显示器，用于向用户提供任何本文所述结果。
III.试剂盒
本发明还提供包含所述蛋白质定量标准物的试剂盒。例如，所述试剂盒可提供含预染色多肽组和未染色多肽组的容器，其中各预染色多肽组具有不同的分子量，且各未染色多肽组就给定的分子量以不同含量提供。所述试剂盒还可在分开的容器中提供具有相同分子量的各预染色多肽，并在分开的容器中提供具有相同分子量的各未染色多肽。这使得用户可根据需要将预染色和未染色多肽组合为混合物。所述试剂盒还可提供用于检测和定量标准中多肽的其他试剂，以及使用试剂盒的说明。
在所附的权利要求书中，术语“一个”或“一种”是用来表示“一个(种)或多个(种)”。在述及步骤或要素时，其前导术语“包含”及其变化形式例如“包括”和“含有”旨在表示其它步骤或要素的增加是可任选且不被排除的。本说明书中引用的所有专利、专利申请和其它公开的参考材料都通过引用全文纳入本文中。当本说明书的内容与本发明引用的任何参考材料或任何现有技术之间存在矛盾之处的时候，以本说明书为准。所述矛盾之处包括现有技术对词或词组的定义与本说明书对相同的词或词组明确给出的定义之间的差异。

Claims (24)

1.一种可在电泳凝胶的一条泳道中上样的蛋白质定量标准物，所述标准物包括未染色多肽组，其中所述未染色多肽组的成员具有不同的电泳迁移率并且以不同量存在，从而所述标准物适于从凝胶的一条泳道中生成蛋白质质量标准曲线。
2.如权利要求1所述的蛋白质定量标准物，还包括具有不同电泳迁移率的预染色多肽组，从而所述标准物适于从凝胶的一条泳道中生成分子量梯度和蛋白质质量标准曲线。
3.如权利要求1所述的蛋白质定量标准物，其中所述多肽大小范围为约2kDa-约250kDa、或约2kDa-约100kDa、或约20kDa-约100kDa。
4.如权利要求2所述的蛋白质定量标准物，其中所述预染色多肽组的成员具有不同电泳迁移率。
5.如权利要求2所述的蛋白质定量标准物，其中所述预染色多肽组的成员以相似的量存在。
6.如权利要求2所述的蛋白质定量标准物，其中至少一种预染色多肽和至少一种未染色多肽具有不同的电泳迁移率。
7.如权利要求1所述的蛋白质定量标准物，其中所述未染色多肽包含亲和标签。
8.如权利要求1所述的蛋白质定量标准物，其中所述未染色多肽包含检测标签。
9.如权利要求1所述的蛋白质定量标准物，其中所述未染色多肽包含基本相似百分比的色氨酸。
10.如权利要求2所述的蛋白质定量标准物，其中所述预染色多肽用一种或多种有色染料染色，其中所述一种或多种有色染料包含单一有色染料、不同有色染料的组合或荧光染料。
11.如权利要求2所述的蛋白质定量标准物，还包括氨基酸序列与预染色多肽相同的未染色多肽。
12.包含如权利要求1所述的蛋白质定量标准物的试剂盒。
13.确定靶多肽的质量的方法，包括：
使所述靶多肽在凝胶的一条泳道中电泳迁移，并使权利要求1所述的蛋白质定量标准物在所述凝胶的另一泳道中电泳迁移；
检测所述靶多肽和所述蛋白定量标准物；
将所述靶多肽的检测量与由所述蛋白质定量标准物生成的质量标准曲线做比较，从而确定所述靶多肽的质量。
14.如权利要求13所述的方法，还包括检测蛋白质标准物的预染色多肽条带以确定所述靶蛋白的表观分子量。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中所述检测包括无染剂成像。
16.如权利要求13或14所述的方法，其中所述检测包括荧光成像。
17.如权利要求13所述的方法，其中所述检测包括使所述未染色多肽与染剂或染料接触并观察所述多肽。
18.如权利要求13所述的方法，还包括使所述未染色多肽接触一种或多种配体，所述配体特异结合所述标准物的多肽。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述一种或多种配体与生色或化学发光试剂偶联。
20.如权利要求13所述的方法，其中所述凝胶是变性凝胶或非变性凝胶。
21.测定靶多肽的质量的方法，包括：
使所述靶多肽和权利要求1所述的蛋白质定量标准物在微流体装置中电泳迁移；
检测所述靶多肽和所述蛋白定量标准物；
将所述靶多肽的检测量与由所述蛋白质定量标准物生成的质量标准曲线做比较，从而确定所述靶多肽的质量。
22.确定凝胶或凝胶成像中靶多肽的质量的计算机执行方法，包括：
在用可执行指令配置的一种或多种计算机系统控制下；
对蛋白质定量标准物中的未染色多肽定量，所述蛋白质定量标准物包含具有不同电泳迁移率并以不同量存在的未染色多肽组；
基于所述定量步骤生成回归拟合；
从所述回归拟合计算所述靶多肽的质量；和
提供所述经计算的质量。
23.如权利要求22所述的计算机执行方法，其中所述回归拟合是线性回归。
24.如权利要求22所述的计算机执行方法，其中所述回归拟合是非线性回归。
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