CN115112742A - 一种分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及重组蛋白生物制品理化对照品校正技术领域，具体地说，涉及分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法。包括：对分子量进行校正计算：对胶片进行拍照或扫描；求得标准曲线回归方程；求得供试品和对照品的分子量；计算分子量校正系数k1；将软件测得的样品分子量乘以k1；对等电点进行校正计算：对胶片进行拍照或扫描；做线性回归；求出供试品和对照品的等电点；计算等电点校正系数k2；将软件测得的供试品等电点乘以k2。本发明通过将产品的实测值乘以k值，可以校正产品并用于实际检验控制；可以使得产品计算结果更加科学、准确，并可较大程度避免因系统检验误差导致的产品分子量、等电点的波动，缩小方法误差的范围。
Description
技术领域
本发明涉及理化对照品校正技术领域，具体地说，涉及分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法。
背景技术
电泳是指混悬于溶液中的样品电荷颗粒,在电场影响下向着与自身带相反电荷的电极移动的现象，核酸可降解成片段，还可进一步降解成核苷酸；蛋白质多肽和氨基酸等都具有可电离的基团，基团在溶液中能吸收或者给出氢离子，从而成为电荷粒子；又由于电荷粒子的多少不等以及具有相同电荷的分子又有大有小，于是在不同的介质中，在电场影响下，它们移动的速度也不相同了。人们利用这种特性，用电泳的方法对上述物质进行定性及定量分析，或者将一定的混合物分离成各个组份以及作少量电泳制备。因为电泳技术的这种独特功能，所以就成了分子生物学研究工作中不可缺少的重要分析手段，被广泛应用于基础理论研究、农业科学、医药卫生、工业生产、国防科研、法医学和商检等许多领域；在对重组蛋白生物制品进行研制、生产及实验、检验过程中，可能需要对重组蛋白生物制品原液及理化对照品进行分子量、等电点的检验，检验设备主要为稳压稳流电泳仪、凝胶成像系统。在检验过程中，电泳的时间长短、染色效果、染色的颜色深浅等多种因素都会导致检验的误差增大。
目前凝胶成像系统灵敏度较高，如图1所示，为重组蛋白在凝胶成像系统中的成像图像，同一图像中仍然存在清晰程度不一的重组蛋白结构。因此，为防止检验误差导致检验结果偏离分子量、等电点的理论值，导致检验结果不合理，故需要采用理化对照品校正的方式进行计算，然而，目前却没有较为完善的可以准确控制实际检验数据准确程度的校正值k允许范围的校正方法。鉴于此，基于近1年的数据积累，及其分别总结出校正值k的允许范围，我们提出了分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述技术问题的解决，本发明的目的之一在于，提供了分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、对分子量进行校正计算：
S1.1、在SDS-PAGE凝胶电泳完毕，胶片染色脱色完成后，通过电脑凝胶成像分析仪器软件对胶片进行拍照或扫描；
S1.2、以分子量Maker工作溶液标准蛋白各条带相对分子量的对数为纵坐标，以其相对迁移率为横坐标，进行线性回归拟合，求得标准曲线回归方程；
S1.3、将理化对照品和供试品蛋白相对迁移率代入标准曲线回归方程计算，求得供试品和对照品的分子量；
S1.4、通过理化对照品理论分子量与实测分子量的比值计算分子量校正系数k1；
S1.5、将软件测得的供试品分子量乘以分子量校正系数k1，即得供试品分子量，完成分子量的校正计算；
S2、对等电点进行校正计算：
S2.1、等电聚焦电泳结束，胶片固定染色脱色完成后，通过电脑凝胶成像分析仪器软件对胶片进行拍照或扫描；
S2.2、以每条带距凝胶正极端的距离作为迁移距离，以各标准的等电点对其相应的迁移距离作线性回归；
S2.3、将理化对照品和供试品的迁移距离代入线性回归方程，求出供试品和对照品的等电点；
S2.4、通过理化对照品理论等电点与实测等电点的比值计算等电点校正系数k2；
S2.5、将软件测得的供试品等电点乘以等电点校正系数k2，即得供试品等电点，完成等电点的校正计算。
2.根据权利要求1所述的分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法，其特征在于：所述S1.2中，以分子量Maker工作溶液标准蛋白各条带相对分子量的对数为纵坐标，以其相对迁移率为横坐标，进行线性回归拟合，求得标准曲线回归方程，此过程依据的检验原理为：
大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂SDS按重量成比例结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质分按分子大小分离；在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小；
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和相对分子量的常用对数呈线性关系，符合下式：
logMW＝K-bX
式中，MW为分子量，X为迁移率，K、b均为常数；
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，即所需的标准曲线及其回归方程；
反之，未知蛋白质在相同条件下进行电泳时，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
3.根据权利要求1所述的分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法，其特征在于：所述S1.3中，将供试品蛋白相对迁移率代入计算，求得供试品和对照品的分子量的操作过程，可以使用经确认的凝胶成像分析系统，通过系统自动计算得到所需的分子量。
4.根据权利要求1所述的分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法，其特征在于：所述S1.4中，通过理化对照品实测分子量计算分子量校正系数k1的计算表达式为：
5.根据权利要求1所述的分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法，其特征在于：所述S2.2中，以每条带距凝胶正极端的距离作为迁移距离，根据标准品的等电点对其相应的迁移距离做线性回归，此过程依据的检验原理为：
两性电解质在电泳场中形成一个pH梯度；蛋白质为两性化合物，其所带电荷与介质的pH值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点时，电流达到最小，不再移动，从而达到检测蛋白质和多肽类供试品等电点的方法；
其中，相应的蛋白质不再带电荷的pH值处即为等电点。
6.根据权利要求1所述的分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法，其特征在于：所述S2.3中，将供试品和理化对照品的迁移距离代入线性回归方程，求出供试品和对照品的等电点的操作过程，可以使用经确认的凝胶成像系统，通过系统自动计算得到所需的等电点结果。
7.根据权利要求1所述的分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法，其特征在于：所述S2.4中，通过理化对照品实测等电点计算等电点校正系数k2的计算表达式为：
本发明的目的之二在于，提供了一种分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法的系统搭载平台装置，用于装载相应的电脑仪器软件及经确认的凝胶成像分析系统，该装置包括处理器、存储器以及存储在存储器中并在处理器上运行的计算机程序，处理器用于执行计算机程序时实现上述的分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法的步骤。
本发明的目的之三在于，提供了一种计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现上述的分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法的步骤。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1.该分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法主要是由对照品来实现的，通过对照品的实测数据进行k值计算，然后将产品的实测值乘以k值，这样可以校正产品，并用于实际检验控制；
2.该分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法中，分子量、等电点采用k值校正，通过理化对照品校正，可以使得产品计算结果更加科学、准确，并可较大程度避免因系统检验误差导致的产品分子量、等电点的结果浮动大从而导致结果不合理，更充分满足检验需求，进一步缩小方法误差的范围。
附图说明
图1为本发明中示例性的重组蛋白制品在凝胶成像系统中的成像图像；
图2为本发明中示例性的整体校正方法流程图；
图3为本发明中示例性的电子计算机产品结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
如图1-图3所示，本实施例提供了分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法，包括如下步骤：
S1、对分子量进行校正计算：
S1.1、在SDS-PAGE凝胶电泳完毕，胶片染色脱色完成后，通过电脑凝胶成像分析仪器软件对胶片进行拍照或扫描；
S1.2、以分子量Maker工作溶液标准蛋白各条带相对分子量的对数为纵坐标，以其相对迁移率为横坐标，进行线性回归拟合，求得标准曲线回归方程；
S1.3、将理化对照品和供试品蛋白相对迁移率代入标准曲线回归方程计算，求得供试品和对照品的分子量；
S1.4、通过理化对照品理论分子量与实测分子量的比值计算分子量校正系数k1；
S1.5、将软件测得的供试品分子量乘以分子量校正系数k1，即得供试品分子量，完成分子量的校正计算；
S2、对等电点进行校正计算：
S2.1、等电聚焦电泳结束，胶片固定染色脱色完成后，通过电脑凝胶成像分析仪器软件对胶片进行拍照或扫描；
S2.2、以每条带距凝胶正极端的距离作为迁移距离，以各标准的等电点(PI)对其相应的迁移距离作线性回归；
S2.3、将理化对照品和供试品的迁移距离代入线性回归方程，求出供试品和对照品的等电点；
S2.4、通过理化对照品理论等电点与实测等电点的比值计算等电点校正系数k2；
S2.5、将软件测得的供试品等电点乘以等电点校正系数k2，即得供试品等电点，完成等电点的校正计算。
具体地，理化对照品校正仅仅是一个计算过程，通过电脑仪器软件扫描图片后得出的理化对照品实测值，计算出校正系数k(包括k1、k2)值，然后用仪器软件测得的产品实测值乘以k，即可得出最终结果，因此这个校正过程不涉及任何仪器和实验流程。
其中，值得说明的是，对分子量进行校正计算和对等电点进行校正计算这两个作业过程没有先后之分，两者可以任意顺序进行或同步进行。
本实施例中，S1.2中，以分子量Maker工作溶液标准蛋白各条带相对分子量的对数为纵坐标，以其相对迁移率为横坐标，进行线性回归拟合，求得标准曲线回归方程，此过程依据的检验原理为：
大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂SDS按重量成比例的结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质分按分子大小分离；在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小；
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和相对分子量的常用对数呈线性关系，符合下式：
logMW＝K-bX
式中，MW为分子量，X为迁移率，K、b均为常数；
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，即所需的标准曲线及其回归方程；
反之，未知蛋白质在相同条件下进行电泳时，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
进一步地，S1.3中，将供试品蛋白相对迁移率代入计算，求得供试品和对照品的分子量的操作过程，可以使用经确认的凝胶成像分析系统，通过系统自动计算得到所需的分子量。
进一步地，S1.4中，通过理化对照品实测分子量计算分子量校正系数k1的计算表达式为：
本实施例中，S2.2中，以每条带距凝胶正极端的距离作为迁移距离，根据标准品的等电点对其相应的迁移距离做线性回归，此过程依据的检验原理为：
两性电解质在电泳场中形成一个pH梯度；蛋白质为两性化合物，其所带电荷与介质的pH值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点时，电流达到最小，不再移动，从而达到检测蛋白质和多肽类供试品等电点的方法；
其中，相应的蛋白质不再带电荷的pH值处即为等电点。
进一步地，S2.3中，将供试品和理化对照品的迁移距离代入线性回归方程，求出供试品和对照品的等电点的操作过程，可以使用经确认的凝胶成像系统，通过系统自动计算得到所需的等电点结果。
进一步地，S2.4中，通过理化对照品实测等电点计算等电点校正系数k2的计算表达式为：
为了验证上述校正步骤的可行性和实用性，本实施例还提供了理化对照品分子量、等电点及其k值统计近1年的历史数据，如下表：
上述计算效果由标准品/对照品计算k值来实现，通过理化对照品校正，可以使得产品计算结果更加科学、准确。
如上表中第三列数据“样品分子量检测数据kDa”所示，通过对比分析可得：因系统导致的偏差比较大，如果不进行分子量、等电点的理化对照品校正，则结果数据会有很大波动。
另外，值得说明的是，目前规定的理化对照品分子量k值为0.90～1.00，等电点k值为0.90～1.00，若日常检验超出此标准规定，则需重新检验。
如图3所示，本实施例还提供了一种分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法的系统搭载平台装置，用于装载相应的电脑仪器软件及经确认的凝胶成像分析系统，该装置包括处理器、存储器以及存储在存储器中并在处理器上运行的计算机程序。
处理器包括一个或一个以上处理核心，处理器通过总线与存储器相连，存储器用于存储程序指令，处理器执行存储器中的程序指令时实现上述的分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法的步骤。
可选的，存储器可以由任何类型的易失性或非易失性存储设备或者它们的组合实现，如静态随时存取存储器(SRAM)，电可擦除可编程只读存储器(EEPROM)，可擦除可编程只读存储器(EPROM)，可编程只读存储器(PROM)，只读存储器(ROM)，磁存储器，快闪存储器，磁盘或光盘。
此外，本发明还提供一种计算机可读存储介质，计算机可读存储介质存储有计算机程序，计算机程序被处理器执行时实现上述的分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法的步骤。
可选的，本发明还提供了一种包含指令的计算机程序产品，当其在计算机上运行时，使得计算机执行上述各方面分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法的步骤。
本领域普通技术人员可以理解，实现上述实施例的全部或部分步骤的过程可以通过硬件来完成，也可以通过程序来指令相关的硬件完成，程序可以存储于计算机可读存储介质中，上述提到的存储介质可以是只读存储器，磁盘或光盘等。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (7)
1.分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、对分子量进行校正计算：
S1.1、在SDS-PAGE凝胶电泳完毕，胶片染色脱色完成后，通过电脑凝胶成像分析仪器软件对胶片进行拍照或扫描；
S1.2、以分子量Maker工作溶液标准蛋白各条带相对分子量的对数为纵坐标，以其相对迁移率为横坐标，进行线性回归拟合，求得标准曲线回归方程；
S1.3、将理化对照品和供试品蛋白相对迁移率代入标准曲线回归方程计算，求得供试品和对照品的分子量；
S1.4、通过理化对照品理论分子量与实测分子量的比值计算分子量校正系数k1；
S1.5、将软件测得的供试品分子量乘以分子量校正系数k1，即得供试品分子量，完成分子量的校正计算；
S2、对等电点进行校正计算：
S2.1、等电聚焦电泳结束，胶片固定染色脱色完成后，通过电脑凝胶成像分析仪器软件对胶片进行拍照或扫描；
S2.2、以每条带距凝胶正极端的距离作为迁移距离，以各标准的等电点对其相应的迁移距离作线性回归；
S2.3、将理化对照品和供试品的迁移距离代入线性回归方程，求出供试品和对照品的等电点；
S2.4、通过理化对照品理论等电点与实测等电点的比值计算等电点校正系数k2；
S2.5、将软件测得的供试品等电点乘以等电点校正系数k2，即得供试品等电点，完成等电点的校正计算。
2.根据权利要求1所述的分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法，其特征在于：所述S1.2中，以分子量Maker工作溶液标准蛋白各条带相对分子量的对数为纵坐标，以其相对迁移率为横坐标，进行线性回归拟合，求得标准曲线回归方程，此过程依据的检验原理为：
大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂SDS按重量成比例结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质分按分子大小分离；在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小；
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和相对分子量的常用对数呈线性关系，符合下式：
logMW＝K-bX
式中，MW为分子量，X为迁移率，K、b均为常数；
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，即所需的标准曲线及其回归方程；
反之，未知蛋白质在相同条件下进行电泳时，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
3.根据权利要求1所述的分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法，其特征在于：所述S1.3中，将供试品蛋白相对迁移率代入计算，求得供试品和对照品的分子量的操作过程，可以使用经确认的凝胶成像分析系统，通过系统自动计算得到所需的分子量。
4.根据权利要求1所述的分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法，其特征在于：所述S1.4中，通过理化对照品实测分子量计算分子量校正系数k1的计算表达式为：
5.根据权利要求1所述的分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法，其特征在于：所述S2.2中，以每条带距凝胶正极端的距离作为迁移距离，根据标准品的等电点对其相应的迁移距离做线性回归，此过程依据的检验原理为：
两性电解质在电泳场中形成一个pH梯度；蛋白质为两性化合物，其所带电荷与介质的pH值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点时，电流达到最小，不再移动，从而达到检测蛋白质和多肽类供试品等电点的方法；
其中，相应的蛋白质不再带电荷的pH值处即为等电点。
6.根据权利要求1所述的分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法，其特征在于：所述S2.3中，将供试品和理化对照品的迁移距离代入线性回归方程，求出供试品和理化对照品的等电点的操作过程，可以使用经确认的凝胶成像系统，通过系统自动计算得到所需的等电点结果。
7.根据权利要求1所述的分子量等电点使用理化对照品进行校正的方法，其特征在于：所述S2.4中，通过理化对照品实测等电点计算等电点校正系数k2的计算表达式为：
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