CN106482998A - 一种三基色蛋白分子量标准试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种三基色蛋白分子量标准试剂盒,具体包括红色蛋白分子量预染标准品,黄色蛋白分子量预染标准品,蓝色蛋白分子量预染标准品和标准品稀释液。包括以下步骤:1) 根据实验需求选择指示不同分子量的三基色色素基团标记的预染蛋白标准品;2) 根据实验需求将不同浓度的上述蛋白标准品溶解于标准品稀释液,90℃煮沸备用;3) 根据蛋白凝胶上样孔的大小,加入配置好的三基色蛋白分子量标准品即可在蛋白凝胶电泳中作为蛋白分子量和蛋白浓度参考。本发明具有操作简单、成本低、特异性高、反应速度快,可以根据用户实际要求自由组合等特点,在蛋白凝胶电泳中可指示蛋白分子量大小和浓度参考。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域一种三基色蛋白分子量标准试剂盒,具体包括红色蛋白分子量预染标准品,黄色蛋白分子量预染标准品,蓝色蛋白分子量预染标准品和标准品稀释液。
背景技术
蛋白质作为机体生命活动的重要体现者,越来越受到人们的关注和重视,随着蛋白质检测技术的快速发展,基于外源分子量标准准确定位的技术已成为蛋白质检测的重要参考,如蛋白质分子量标准。目前,多种商业化蛋白分子量标准被开发,跑胶后考马斯亮蓝染色等,但该方法存在操作繁琐,环境污染,安全性差等特点,为了进一步直观观察目的蛋白条带的分离趋势,多种预染蛋白分子量标准被开发,但依然存在以下多方面问题:第一:蛋白质分子量的制备方法大部分通过蛋白纯化完成,存在操作繁琐,成本高等缺点,不利于大规模生产;第二:蛋白分子量标准指示的蛋白质大小和颜色固定,市场面通常分为低分子量、中分子量和高分子量标准等不同型号,不能根据实际需求定制不同颜色标记的不同大小蛋白分子量的蛋白分子量标准品;第三:蛋白质分子量中对应的特定蛋白浓度无法定量,不能根据实际需求指定蛋白分子量的浓度作为光密度测定蛋白浓度参考标定。
本发明基于染料的偶联作用获得红黄蓝三基色标记的蛋白质,采用标准品稀释液进行稀释混匀可制备不同分子量大小的蛋白分子量标准,也可根据需要定量制备蛋白分子量标准,可根据实际需求自由组合成不同浓度不同颜色标记的不同分子量的蛋白分子量标准,具有操作简单、成本低、特异性高、反应速度快,可以根据用户实际要求自由组合等特点。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种操作简单、成本低、特异性高、反应速度快,用户可根据实际需求自由组合等特点的三基色蛋白分子量标准试剂盒,具体包括红色蛋白分子量预染标准品,黄色蛋白分子量预染标准品,蓝色蛋白分子量预染标准品和标准品稀释液。
为了实现上述目的,本发明提供了一种三基色蛋白分子量标准试剂盒,包括以下步骤:
1):根据实验需求选择指示不同分子量的三基色色素基团标记的预染蛋白标准品;
2):根据实验需求将不同浓度的上述蛋白标准品溶解于标准品稀释液,90℃煮沸备用;
3):根据蛋白凝胶上样孔的大小,加入配置好的三基色蛋白分子量标准品即可在蛋白凝胶电泳中作为不同蛋白分子量和蛋白浓度的指示参考。
上述1)所述的色素基团,可为酸性染料、碱性染料、活性染料等适用于蛋白质纤维染色的染料,特别是活性染料。
上述1)所述的三基色,可为红色、黄色、蓝色的任意一种或几种染色组合。
上述1)所述的不同分子量,可为2.5kDa到220kDa范围之间的蛋白样品的分子量标准指示参考。
上述1)所述预染蛋白标准品,可为色素基团与蛋白偶联反应在最优条件下形成的蛋白质大分子偶联标记的纯化产物。
上述2)所述的标准品稀释液,由20mM Tris-base (pH=7.4)、0.1 M NaCl、0.1 MNaHCO3、1mMNaN3、0.01% 溴酚蓝和50%甘油组成。
上述3)所述的蛋白凝胶电泳,可为SDS-PAGE、Native-PAGE、明胶酶谱法、银染法、Western blot等一切蛋白相关凝胶电泳实验。
附图说明
图1. 活性红偶联标记牛血清白蛋白最优条件确定;
图2. 活性蓝偶联标记牛血清白蛋白最优条件确定;
图3. 活性嫩黄偶联标记牛血清白蛋白最优条件确定。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作进一步的阐述,但下述实施例仅是一个例子,并不作为本发明的限制,在不偏离本发明的情况下,本发明的主要特征可以用于各种实施方式。
实施例1
活性红偶联标记牛血清白蛋白最优条件探索
1. 实验目的:研究活性红偶联标记蛋白的最优pH值和温度;
2. 实验分组:根据pH值(6,7,8,9)与反应温度(60℃,70℃,80℃)交叉共分成12组。
实验步骤:
1) 色素溶解液和蛋白偶联标记液配置:
a. 色素溶解液:20mM Tris-base + 100mM NaCl + 50mM尿素;
b. 蛋白偶联标记液:20mM Tris-base + 100mM NaCl + 100mM NaHCO3;
根据上述缓冲液浓度称取一定质量的相关试剂,采用HCl调节pH值至6.0,7.0,8.0,滤纸过滤备用。
活性红母液配置:
根据活性红活性基团数量和牛血清白蛋白的氨基数量关系,称取适量活性红,采用上述配置的不同pH值色素溶解液室温振荡溶解至终浓度50mg/ml,5000rpm离心5min,取上清液作为母液备用。
牛血清白蛋白母液配置:
称取适量牛血清白蛋白,采用上述配置的不同pH值蛋白偶联标记液室温振荡溶解至终浓度5.0mg/ml,5000rpm离心5min,取上清液作为母液备用。
活性红偶联标记牛血清白蛋白:
根据上述配置的母液按照10:1的比例采用蛋白偶联标记液稀释至终浓度1mg/ml,分别采用60℃、70℃和80℃三个温度梯度孵育60min,12000rpm室温离心10min,吸取上清,加入适量 5×蛋白上样缓冲液, 95℃水浴锅煮样10 min备用。
检测:
按照聚丙烯酰胺凝胶配置方法制备12.5%的SDS-PAGE胶,按照15μl/孔加入胶孔,浓缩胶:100V 10 min,分离胶:200V 40min,蛋白分离后取出凝胶直接采用照相机拍照采集图片。
实验结果:
如图1所示,随着孵育时间的增加,活性红偶联标记牛血清白蛋白的量逐渐增加。同时,随着反应体系pH值的增加,活性红偶联标记牛血清白蛋白的量先增加后降低,在 pH=7.0,反应温度95℃时最佳。
实施例2
活性蓝偶联标记牛血清白蛋白最优条件探索
1. 实验目的:研究活性蓝偶联标记蛋白的最优pH值和温度;
2. 实验分组:根据pH值(6,7,8,9)与反应温度(60℃,70℃,80℃)交叉共分成12组。
实验步骤:
1) 色素溶解液和蛋白偶联标记液配置:
a. 色素溶解液:20mM Tris-base + 100mM NaCl + 50mM尿素;
b. 蛋白偶联标记液:20mM Tris-base + 100mM NaCl + 100mM NaHCO3;
根据上述缓冲液浓度称取一定质量的相关试剂,采用HCl调节pH值至6.0,7.0,8.0,滤纸过滤备用。
活性蓝母液配置:
根据活性蓝活性基团数量和牛血清白蛋白的氨基数量关系,称取适量活性蓝,采用上述配置的不同pH值色素溶解液室温振荡溶解至终浓度50mg/ml,5000rpm离心5min,取上清液作为母液备用。
牛血清白蛋白母液配置:
称取适量牛血清白蛋白,采用上述配置的不同pH值蛋白偶联标记液室温振荡溶解至终浓度5.0mg/ml,5000rpm离心5min,取上清液作为母液备用。
活性蓝偶联标记牛血清白蛋白:
根据上述配置的母液按照10:1的比例采用蛋白偶联标记液稀释至终浓度1mg/ml,分别采用60℃、70℃和80℃三个温度梯度孵育60min,12000rpm室温离心10min,吸取上清,加入适量 5×蛋白上样缓冲液, 95℃水浴锅煮样10 min备用。
检测:
按照聚丙烯酰胺凝胶配置方法制备12.5%的SDS-PAGE胶,按照15μl/孔加入胶孔,浓缩胶:100V 10 min,分离胶:200V 40min,蛋白分离后取出凝胶直接采用照相机拍照采集图片。
实验结果:
如图1所示,随着孵育时间的增加,活性蓝偶联标记牛血清白蛋白的量逐渐增加。同时,随着反应体系pH值的增加,活性蓝偶联标记牛血清白蛋白的量先增加后降低,在 pH=7.0,反应温度95℃时最佳。
实施例3
活性黄偶联标记牛血清白蛋白最优条件探索
1. 实验目的:研究活性黄偶联标记蛋白的最优pH值和温度;
2. 实验分组:根据pH值(6,7,8,9)与反应温度(60℃,70℃,80℃)交叉共分成12组。
实验步骤:
1) 色素溶解液和蛋白偶联标记液配置:
a. 色素溶解液:20mM Tris-base + 100mM NaCl + 50mM尿素;
b. 蛋白偶联标记液:20mM Tris-base + 100mM NaCl + 100mM NaHCO3;
根据上述缓冲液浓度称取一定质量的相关试剂,采用HCl调节pH值至6.0,7.0,8.0,滤纸过滤备用。
活性黄母液配置:
根据活性黄活性基团数量和牛血清白蛋白的氨基数量关系,称取适量活性黄,采用上述配置的不同pH值色素溶解液室温振荡溶解至终浓度50mg/ml,5000rpm离心5min,取上清液作为母液备用。
牛血清白蛋白母液配置:
称取适量牛血清白蛋白,采用上述配置的不同pH值蛋白偶联标记液室温振荡溶解至终浓度5.0mg/ml,5000rpm离心5min,取上清液作为母液备用。
活性黄偶联标记牛血清白蛋白:
根据上述配置的母液按照10:1的比例采用蛋白偶联标记液稀释至终浓度1mg/ml,分别采用60℃、70℃和80℃三个温度梯度孵育60min,12000rpm室温离心10min,吸取上清,加入适量 5×蛋白上样缓冲液, 95℃水浴锅煮样10 min备用。
检测:
按照聚丙烯酰胺凝胶配置方法制备12.5%的SDS-PAGE胶,按照15μl/孔加入胶孔,浓缩胶:100V 10 min,分离胶:200V 40min,蛋白分离后取出凝胶直接采用照相机拍照采集图片。
实验结果:
如图1所示,随着孵育时间的增加,活性黄偶联标记牛血清白蛋白的量逐渐增加。同时,随着反应体系pH值的增加,活性黄偶联标记牛血清白蛋白的量先增加后降低,在 pH=7.0,反应温度95℃时最佳。
Claims (10)
1.一种三基色蛋白分子量标准试剂盒,具体包括红色蛋白分子量预染标准品,黄色蛋白分子量预染标准品,蓝色蛋白分子量预染标准品和标准品稀释液。
2.其特征在于,包括以下步骤:
1):根据实验需求选择指示不同分子量的三基色色素基团标记的预染蛋白标准品;
2):根据实验需求将不同浓度的上述蛋白标准品溶解于标准品稀释液中,90℃煮沸备用;
3):根据蛋白凝胶上样孔的大小,加入配置好的三基色蛋白分子量标准品即可在蛋白凝胶电泳中作为蛋白分子量和蛋白浓度参考。
3.根据权利1所述的色素基团,其特征在于,包括酸性染料、碱性染料、活性染料等适用于蛋白质纤维染色的纺织品染料。
4.根据权利1所述的标准品稀释液,其特征在于,由20mM Tris-base (pH=7.4)、0.1 MNaCl、0.1 M NaHCO3、1mMNaN3、0.01% 溴酚蓝和50%甘油组成。
5.根据权利1所述的蛋白凝胶电泳,其特征在于,包括SDS-PAGE、Native-PAGE、明胶酶谱法、银染法、Western blot等一切蛋白相关凝胶电泳实验。
6.根据权利1所述的三基色,其特征在于,包括为红、黄、蓝三种颜色中任何一种或几种染色组合。
7.根据权利1所述的不同分子量,其特征在于,包括从2.5kDa低分子量到220kDa高分子量范围之间的指示蛋白。
8.根据权利1所述的蛋白标准品,其特征在于,包括色素基团与蛋白偶联反应在最优条件下形成的蛋白质大分子偶联标记的纯化产物。
9.根据权利6所述的最优条件,其特征在于,包括色素基团与蛋白偶联反应最优反应温度、最优反应时间、最优反应pH值及最优缓冲液。
10.根据权利6所述的纯化产物,其特征在于,包括经过凝胶过滤、透析、凝胶回收等方法处理的产物。
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