CN103323597A - 一种志贺氏菌的胶体金快速检测卡及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种快速检测志贺氏菌的胶体金免疫层析试纸及其制备方法，包括如下步骤：将志贺氏菌菌体中分离的群特异性O抗原作为免疫原，采用常规方法制备抗志贺氏菌的单克隆抗体并得到配对的两个抗志贺氏菌单克隆抗体；用柠檬酸三钠还原法制备30nm的胶体金颗粒，用该胶体金颗粒标记经过纯化的抗志贺氏菌的单克隆抗体一；用所得的已标记胶体金颗粒的单克隆抗体喷涂金标垫，用经过纯化的抗志贺氏菌单克隆抗体二喷涂T线，用羊抗鼠IgG抗体喷涂C线，组装成检测卡；将样品液从加样孔滴加到样品垫上，获取T、C线的显色，判读结果。本发明可特异性检测志贺氏菌，准确率高，检测速度快，所需时间仅为5-15分钟。
Description
技术领域
本发明属于免疫层析分析检测技术领域，涉及食品安全相关的微生物检测分析技术，尤其提供了一种快速检测痢疾志贺氏菌的检测试纸及其制备方法和在肉制品、蛋制品及奶制品等食品中的应用。
背景技术
志贺氏菌(Shigella)是一类革兰氏阴性杆菌，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，通称痢疾杆菌。志贺氏菌是危害严重的肠道致病菌，在我国感染性腹泻致病菌中居首位，其导致的志贺氏菌性痢疾是世界上，尤其是发展中国家最重要的传染病之一。动物性食品是志贺氏菌的主要传播源，该菌在4℃仍可生长，对动物性食品构成潜在的巨大威胁。
目前，比较常见的应用于志贺氏菌检测的方法有传统细菌培养法利荧光定量PCR法，此两种方法检测时间均较长，最快应需8小时，并且需要制定的实验环境和一起，PCR还易出现假阳性，不适合现场大量样品的快速筛查。
发明内容
本发明属于免疫层析分析检测技术领域，涉及食品安全相关的免疫层析检测分析技术，尤其提供了一种志贺氏菌快速检测卡及其制备和使用方法。适用于各种食品中志贺氏菌的半定量快速筛查。
本发明所提供的志贺氏菌快速检测卡，包括检测卡外壳、支撑底板、样品垫、紧密连接与所述样品垫一段的含有抗志贺氏菌O抗原单克隆抗体一标记胶体金探针的金标垫、与所述金标垫另一端连接的硝酸纤维素膜和连接于硝酸纤维素膜另一端的吸收垫；所述硝酸纤维素膜喷涂有相互平行的两条印迹带检测T线和质控C线。T线喷涂与所述抗志贺氏菌O抗原单克隆抗体一配对的抗志贺氏菌O抗原单克隆抗体二，所述C线喷涂羊抗鼠IgG抗体。
本发明的第二个目的是提供一种上述志贺氏菌快速检测卡的制备方法。
本发明所提供的上述志贺氏菌快速检测卡的制备方法，包括以下步骤：
1、采用志贺氏菌群特异性O抗原作为免疫原，免疫8周龄健康Balb/c小鼠，首次与等量完全弗氏佐剂混合，以后换用不完全弗氏佐剂。每周眼眶采血后间接ELISA法测定抗体效价，待血清效价达到1∶104800后加强免疫，3天后进行细胞融合实验。有限稀释法筛选阳性克隆，体内扩增法大量制备单克隆抗体。用蛋白A亲和层析柱纯化抗志贺氏菌单克隆抗体，通过夹心ELISA法筛选得到配对的抗志贺氏菌群特异性O抗原单克隆抗体一和抗志贺氏菌群特异性O抗原单克隆抗体二。
2、用柠檬酸纳还原法制备30nm的胶体金颗粒，用该胶体金颗粒标记经过纯化的抗志贺氏菌群特异性O抗原单克隆抗体一；
(1)制备30nm胶体金颗粒：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，具体方法为：用超纯水将氯金酸配制成0.01％水溶液，取100mL与1.2mL1％的柠檬酸三钠水溶液混合，加热至沸腾并持续沸腾5分钟。冷却后用超纯水恢复至原体积，制成颗粒直径为30nm的胶体金颗粒。
(2)确定胶体金标记的抗体最适稳定量：采用经典MEY法确定标记1ml胶体金所需要的抗体用量。实验结果显示：每ml胶体金颗粒所需抗体的最适稳定量为15μg，在基础增加20％即1mL胶体金颗粒需18μg抗体。
(3)抗体的胶体金标记：根据每毫升胶体金所需的抗体最适稳定量，在搅拌的条件下，以2mg/ml的浓度向胶体金颗粒中加入单克隆抗体，持续搅拌30分钟，加入20％BSA5mL，搅拌20min。浓缩至十分之一体积4℃保存备用。
(4)金标垫的制备：取标记好的胶体金颗粒5mL加入1g海藻糖，混匀后均匀加到金标垫上，37℃烘干。
3、将步骤三所得的已标记的抗志贺氏菌群特异性O抗原单克隆抗体一喷涂到金标垫上，将抗志贺氏菌群特异性O抗原单克隆抗体二喷涂T线，将羊抗鼠IgG抗体喷涂C线，组装检测卡：
(1)硝酸纤维素膜的包被：用0.01M pH7.2的PBS缓冲液稀释抗志贺氏菌群特异性O抗原单克隆抗体二至2mg/mL，用于包被T线，用0.01M pH7.2的PBS缓冲液稀释羊抗鼠IgG至1mg/mL，用于包被C线。用BIODOT公司XYZ3050工作系统以30mm/s速度喷于硝酸纤维素膜上，形成相互平行的检测T线和质控C线，37℃烘干。
(2)志贺氏菌快速检测卡的制备：试纸条的组装顺序如附图2，在支撑PVC底板10上依次粘贴样品垫6、胶体金垫7、硝酸纤维素膜8、吸收垫9，最后装入外壳1中。即为检测志贺氏菌的快速检测卡，加入干燥剂后铝箔袋内密封保存。
本发明还提供了所述检测卡在检测志贺氏菌的应用。
在本发明检测志贺氏菌的方法中，先将处理好的样品液从检测卡外壳的加样孔中加入，样品垫即吸收样品液，依靠虹吸作用上行层析，至胶体金垫处时，使胶体金抗体标记物复溶，并一起向硝酸纤维素膜迁移。若样品液含有待测特意抗原，其可与金标抗体结合，此复合物流至检测T线时被T线包被的固相抗体捕获，形成红色印迹，过剩的复合物继续层析，至质控C线与固相羊抗鼠IgG结合，形成红色印迹；反之，阴性样本在检测T线处无印迹，仅在质控C线处出现红色印迹。
有益效果：
本发明所述的检测卡可快速进行志贺氏菌的筛查，不需专业培训，结果清晰易辩，操作简单，易于推广，适合大批量样品的筛查及突发事件的现场检测。灵敏度高，可达1×104CFU。
附图说明
图1是一种检测志贺氏菌的胶体金免疫层析检测卡外壳及测试条在外壳内的放置图。
图2是一种检测志贺氏菌的胶体金免疫层析检测卡结构示意图。
附图中，(1)检测卡外壳(2)测试条(3)加样孔(4)观察窗(5)圆形固定柱(6)样品垫(7)胶体金垫(8)硝酸纤维素膜(9)吸收垫(10)支撑底板
具体实施方式
实施例1志贺氏菌快速检测卡的制备及使用
1、单克隆抗体的制备及配对筛选
采用志贺氏菌群特异性O抗原作为免疫原，免疫8周龄健康Balb/c小鼠，首次与等量完全弗氏佐剂混合，以后换用不完全弗氏佐剂。免疫方案见表1。每周眼眶采血后间接ELISA法测定抗体效价，待血清效价达到1∶104800后加强免疫，3天后进行细胞融合实验。有限稀释法筛选阳性克隆，体内扩增法大量制备单克隆抗体。用蛋白A亲和层析柱纯化抗志贺氏菌单克隆抗体，通过夹心ELISA法筛选得到配对的抗志贺氏菌群特异性O抗原单克隆抗体一和抗志贺氏菌群特异性O抗原单克隆抗体二。
表1免疫方案
2、抗体的胶体金标记
(1)制备30nm胶体金颗粒：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，具体方法为：用超纯水将氯金酸配制成0.01％水溶液，取100mL与1.2mL1％的柠檬酸三钠水溶液混合，加热至沸腾并持续沸腾5分钟。冷却后用超纯水恢复至原体积，制成颗粒直径为30nm的胶体金颗粒。
(2)确定胶体金标记的抗体最适稳定量：采用经典MEY法确定标记1ml胶体金所需要的抗体用量。实验结果显示：每ml胶体金颗粒所需抗体的最适稳定量为15μg，在基础增加20％即1mL胶体金颗粒需18μg抗体。
(3)抗体的胶体金标记：根据每毫升胶体金所需的抗体最适稳定量，在搅拌的条件下，以2mg/ml的浓度向胶体金颗粒中加入单克隆抗体，持续搅拌30分钟，加入20％BSA5mL，搅拌20min。浓缩至十分之一体积4℃保存备用。
(4)金标垫的制备：取标记好胶体金颗粒5mL加入1g海藻糖，混匀后均匀加到金标垫上，37℃烘干。
3、志贺氏菌检测卡的制备
如图2所示，志贺氏菌检测卡由外壳1、支撑底板10、样品垫6、金标垫7、硝酸纤维素膜8和吸收垫9六部分组成；
(1)硝酸纤维素膜的包被：用0.01M pH7.2的PBS缓冲液稀释抗志贺氏菌群特异性O抗原单克隆抗体二至2mg/mL，用于包被T线，用0.01M pH7.2的PBS缓冲液稀释羊抗鼠IgG至1mg/mL，用于包被C线。用BIODOT公司XYZ3050工作系统以30mm/s速度喷于硝酸纤维素膜上，形成相互平行的检测T线和质控C线，37℃烘干。
(2)志贺氏菌快速检测卡的制备：试纸条的组装顺序如附图2，在支撑PVC底板10上依次粘贴样品垫6、胶体金垫7、硝酸纤维素膜8、吸收垫9，最后装入外壳1中。即为检测志贺氏菌的快速检测卡，加入干燥剂后铝箔袋内密封保存。
5、志贺氏菌快速检测F的使用方法及结果判读
测定时，将处理好的样品液从检测卡外壳1的加样孔3中加入，样品垫6即吸收样品液，依靠虹吸作用上行层析，至胶体金垫7处时，使胶体金抗体标记物复溶，并一起向硝酸纤维素膜8迁移。若样品液含有待测特意抗原，其可与金标抗体结合，此复合物流至检测T线时被T线包被的固相抗体捕获，形成红色印迹，过剩的复合物继续层析，至质控C线与固相羊抗鼠IgG结合，形成红色印迹；反之，阴性样本在检测T线处无印迹，仅在质控C线处出现红色印迹。
本专利所属项目1：“十二五”国家高技术研究发展计划(863)项目子课题“畜产品病原菌安全控制技术”(2012AA101606-05)；
本专利所属项目2：“十二五”国家科技支撑计划项目“动物源食品HACCP体系建设及致病菌高通量检测技术”(2012BAD28B02-01) 。
Claims (2)
1.一种检测志贺氏菌的胶体金快速检测卡，其特征在于：检测卡外壳、支撑底板、样品垫、紧密连接与样品垫一段的含有抗志贺氏菌O抗原单克隆抗体一，标记胶体金探针的金标垫、与金标垫另一端连接的硝酸纤维素膜和连接于硝酸纤维素膜另一端的吸收垫；硝酸纤维素膜喷涂有相互平行的两条印迹带检测T线和质控C线，将待测样品从检测卡外壳加样孔滴入，待5～15分钟后读取T、C线的显色，得到结果。
2.一种检测志贺氏菌的胶体金快速检测卡制备方法，其特征在于：T线喷涂与抗志贺氏菌O抗原单克隆抗体一配对的抗志贺氏菌O抗原单克隆抗体二，C线喷涂羊抗鼠IgG抗体；其制备步骤为：(1)采用志贺氏菌群特异性O抗原作为免疫原，采用常规方法制备抗志贺氏菌群特异性O抗原单克隆抗体；(2)采用ELISA法筛选出配对的抗志贺氏菌群特异性O抗原单克隆抗体一和抗志贺氏菌群特异性O抗原单克隆抗体二；(3)用柠檬酸纳还原法制备30nm的胶体金颗粒，用该胶体金颗粒标记经过纯化的抗志贺氏菌群特异性O抗原单克隆抗体一，将100mL0.01％的氯金酸溶液与1.2mL1％的柠檬酸三钠水溶液混合加热至沸腾，持续煮沸5分钟，最后加超纯水至100mL，制得30nm的胶体金溶液，在搅拌条件下，向胶体金溶液中加入单克隆抗体，使其终浓度为15μg/mL；(4)将步骤三所得的已标记的抗志贺氏菌群特异性O抗原单克隆抗体一喷涂到金标垫上，将抗志贺氏菌群特异性O抗原单克隆抗体二喷涂T线，将羊抗鼠IgG抗体喷涂C线，组装检测卡。
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