CN103344772B - Miltenberger血型抗体检测新方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种非红细胞依赖型Miltenberger血型抗体检测方法，包括步骤为：将羊红细胞醛化磁化后与具有连接链的多肽抗原偶联形成人工筛查细胞；将所述人工筛查细胞与检测样本混匀后孵育并洗涤，再加入荧光标记二抗孵育并洗涤后测定结果。通过上述方式，本发明提供的非红细胞依赖型Miltenberger血型抗体检测方法，该方法因磁力的加入，使洗涤不需要离心，操作简便，能实现完全抗体和不完全抗体的同时检测，检测过程耗时短，结果易于判定，易于自动化，检测结果准确，结合检测仪器可实现半定量或定量检测，该检测方法能保障临床安全、有效、科学的输血。

Description

Miltenberger血型抗体检测新方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种Miltenberger血型抗体检测新方法即非红细胞依赖型Miltenberger血型抗体检测方法。

背景技术

MNS血型系统是继ABO之后发现的第二个血型系统，其抗原的多态性数目仅次于Rh血型系统。MNS血型系统中有一类特殊的Miltenberger亚血型系统，其血型抗原是以人血清免疫抗体所鉴定的一系列低频率抗原组合的红细胞表型。该亚系统中Mur、Mil等几个抗原的发生频率在欧洲白人中低于千分之一，而在中国人和其他亚洲人群中为3％～10％。一项针对844名广西侗族人群的调查显示，Mur稀有血型抗原阳性率为15.4％，而林玛利等人在1990年针对台湾各种族的调查显示，高山原居民的阿美族的Mur血型阳性率则高达88.4％。

抗-Mur发生率在东南亚地区很高，特别是在我国台湾、香港人群中抗-Mur的发生频率甚至仅次于抗-A/抗-B。临床报告证实抗-Mur抗体会导致同种异型免疫性疾病，如输血不良反应、新生儿溶血病等。伴随全球化进程，各种族和各国人口在全世界的流动加快，使得Miltenberger抗原在世界各国的临床意义日益重要。血液免疫学理论和临床实际都明确提出，在亚洲各国应用的血型抗体筛查红细胞组和血型抗体鉴定的谱细胞中应该有Miltenberger血型抗原阳性红细胞。由于缺少相关试剂，多数医疗机构使用的抗体筛查细胞中并没有包含Miltenberger血型抗原，常规检测无法鉴定抗体的特异性，导致对存在该抗体的患者漏检。由于新鲜红细胞保存时间很短，最多3个月，Miltenberger抗原阳性红细胞来源非常有限，Miltenberger血型筛查及其抗体的检测受到极大地限制。目前Miltenberger血型抗体检测中面临的几个主要问题是：1）由于临床检测谱细胞中未使用相应筛选红细胞，不规则抗体经常漏检；2）含有稀有抗原的筛选红细胞的稳定供应得不到长期保证；3）新鲜红细胞保存时间极短。

由于至今也无商品化供应的抗-Miltenberger血型抗原的单克隆抗体，人源血型试剂（人红细胞试剂和人血清抗体试剂）的固有缺点以及没有合适的试验方法，世界各国目前临床上不能够常规开展Miltenberger血型相容性试验，只在少数的大型血液中心和血型参比试验室对一些疑难的血型不相容疾病病人进行相关的检验工作。至今，临床上不能常规开展Miltenberger血型相容性实验的具体障碍和问题是：Miltenberger抗原试剂和抗体试剂都短缺，红细胞血球试剂和人血清抗体试剂的固有缺点，以及目前应用的免疫血清学试验技术方法的缺点等。我国临床对于Miltenberger血型抗原抗体的重要性及检测方法的相关研究也很少，目前仅限个案报道。  

澳大利亚CSL公司利用Kode^TM技术，将合成的多肽抗原连接到红细胞上，制备得到筛检抗-Mur的红细胞。这种技术是将红细胞与含有功能（表位）基团-连接链-脂肪基团（function-epitope-spacer lipid, FSL）的液体混合一段时间，携带有特殊抗原表位的FSL可以模拟糖脂结构结合于红细胞表面，从而改变红细胞的血型。但这种技术只能增加抗原，而不能封闭原有的红细胞抗原。这一筛查红细胞已经被用来进行大规模的抗体筛检。但CSL公司利用Kode^TM技术所制备的仍然是基于存活红细胞的血型抗原试剂，上述提到的几个根本问题并没有得到解决，存在于存活的红细胞膜上的血型抗原，由于红细胞容易溶血，抗原性也随之消亡。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种非红细胞依赖型Miltenberger血型抗体检测方法，该方法能保障临床安全、有效、科学的输血。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种非红细胞依赖型Miltenberger血型抗体检测方法，包括步骤为：（1）将羊红细胞醛化磁化后与具有连接链的多肽抗原偶联形成人工筛查细胞；（2）将所述人工筛查细胞与检测样本混匀后孵育并洗涤，再加入荧光标记二抗孵育并洗涤后测定结果。

在本发明一个较佳实施例中，所述醛化过程是用戊二醛醛化，所述磁化过程是用磁珠磁化。

在本发明一个较佳实施例中，所述连接链的氨基酸序列为GGDGDGDGDG。

在本发明一个较佳实施例中，所述偶联的过程为将所述醛化磁化羊红细胞稀释至体积分数为30-70%，将所述多肽抗原配制浓度为1-5 mg/mL，再将所述醛化磁化羊红细胞和所述多肽抗原用滚轴仪在转速为100-300 rpm的条件下混合偶联3-6 h，得到人工筛查细胞。

在本发明一个较佳实施例中，所述检测样本包括待检样本、阴性样本、阳性样本和空白样本。

在本发明一个较佳实施例中，所述人工筛查细胞与所述检测样本的体积比为1:1-3。

在本发明一个较佳实施例中，所述荧光标记二抗中用于标记的荧光素为花青素Cy系列荧光素或Alexa Fluor系列荧光素。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（2）中所述加入荧光标记二抗孵育后的洗涤次数为2-4次。

本发明的有益效果是：本发明的非红细胞依赖型Miltenberger血型抗体检测方法，该方法形成具有Miltenberger血型抗原的人工筛查细胞，代替传统血型抗体检测试剂中的Miltenberger抗原阳性红细胞，建立了血型抗体的免疫荧光检测技术，解决了目前稀有血型筛查红细胞来源有紧缺的难题。该检测方法中因磁力的加入，使洗涤不需要离心，操作简便，能实现完全抗体和不完全的抗体的同时检测，检测过程耗时短，结果易于判定，可同时对大量样本进行检测，易于自动化，提高检测结果的准确性，检测快速简便，结合检测仪器可实现半定量或定量检测。该检测方法可解决我国乃至世界上目前缺乏简便实用的Miltenberger血型抗体检测试剂的难题，辅助临床因Miltenberger血型抗体引起的新生儿溶血病、输血不良反应等疾病的诊断，以及进行输血前相容性实验检测，保障临床安全、有效、科学输血。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1是本发明的非红细胞依赖型Miltenberger血型抗体检测方法一较佳实施例的原理图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种非红细胞依赖型Miltenberger血型抗体检测方法，包括如下步骤：

（1）磁化醛化羊红细胞制备

1、磁珠的制备

0.85g FeCl₃·6H₂O、0.30g FeCl₂·4H₂O在氮气保护下溶在200 mL蒸馏水中。加入适量表面活性剂，在强力搅拌下，将1.5 mol/L氨水溶液缓慢加入到上述溶液中，当溶液的pH升高至6~7时，溶液中产生大量的黑色Fe₃O₄粒子；继续加氨水至pH=8，使水解完全。在80℃下陈化0.5 h。将生成的固体分离，用蒸馏水洗3次，然后在超声作用下将其分散在100 mL蒸馏水中，得到Fe₃O₄的胶体溶液收集备用。

2、羊红细胞制备

将新鲜羊血在转速为1500 rpm的条件下离心10 min，收集红细胞，再用生理盐水洗涤3次，制成红细胞悬液备用。

3、戊二醛配制

用生理盐水配制成体积分数为2%的戊二醛，备用。

4、羊红细胞醛化

1）用生理盐水稀释羊红细胞至体积分数为5%，加入等体积的体积分数为2%的戊二醛，轻轻混匀后，在4℃下静置30 min；

2）用生理盐水洗涤3次，洗去多余戊二醛，用生理盐水制成悬液备用。

5、醛化羊红细胞磁化

通过预实验确定合适的磁化条件，原则是在保证一定磁响应性的条件下，红细胞上尽可能少包被磁珠，避免红细胞表面位点被占据太多，影响后面的抗体连接实验。

红细胞和磁珠压积比为15:1，两者等体积混匀振荡2 min，磁力吸附洗涤，将未被磁化的红细胞洗去。

（2）磁化醛化羊红细胞偶联多肽得到人工筛查细胞

1）多肽抗原用0.15 M 的pH 值为7.2的 磷酸盐缓冲液稀释至浓度2 mg/mL；

2）磁化醛化羊红细胞用0.15 M的pH值为7.2的磷酸盐缓冲液置换并稀释至体积分数为50%；

3）将体积比为3:1的磁珠和稀释后的多肽抗原混合，室温静置30 min；

4）用滚轴仪混合5 h，转速为100 rpm；

5）室温静置30 min后，用0.15 M的pH值为7.2的磷酸盐缓冲液洗涤3次，制成悬液备用。

（3）患者样本采集与处理

1）抽取正常人静脉血分离血清。

2）抽取待检患者静脉血分离血清。

3）生理盐水及磷酸盐缓冲液的配制

生理盐水的配制：将0.9 g氯化钠溶于100 mL蒸馏水中得到生理盐水；

pH值为5.8的0.2 M磷酸盐缓冲液的配制：将3.12 g NaH₂PO₄·2H₂O溶于100 mL水中，再将7.16 g Na₂HPO₄·12H₂O溶于100 mL水中，取8 mL的Na₂HPO₄·12H₂O溶液加入到92 mL的NaH₂PO₄·2H₂O溶液中得到。

（4）对照血清

阴性对照血清：经国家规定的转氨酶、乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病五项指标检测合格且与上述检测试剂不发生反应的健康成年人血清，表明其血清中不含有Miltenberger血型抗体。

阳性对照血清:经国家规定的转氨酶、乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病五项指标检测合格的健康成年人，且与上述检测试剂发生反应的人血清，表明其血清中含有Miltenberger血型抗体。

（5）样品检测

取100 μL所述“人工筛查细胞”悬液置于96孔酶标板孔中，分别加入50 μL待检样本、50 μL阴性对照血清和50 μL磷酸盐缓冲液，振荡1 min，将所述酶标板在37℃水浴下孵育30 min，再用磷酸盐缓冲液混匀洗涤3次，每次用150 μL，加入用生理盐水稀释8000倍的60 μL荧光标记二抗，在37℃下孵育20 min得到混合液。再用磷酸盐缓冲液混匀洗涤3次，每次用150 μL，最后悬于50 μL磷酸盐缓冲液，读取荧光值。

请参阅图1，本发明用于Miltenberger血型抗体的检测，检测的原理为：磁化醛化羊红细胞与合成多肽偶联，得到具有Miltenberger血型抗原阳性的“人工筛查细胞”，与待检样本孵育反应后，洗涤，加入荧光标记二抗；若血清中不含有Miltenberger血型抗体则无荧光信号，若含有Miltenberger血型抗体，则此抗体与“人工筛查细胞”结合，加入荧光标记二抗，孵育反应洗涤检测荧光强度，可以检测Miltenberger血型抗体。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.一种非红细胞依赖型 Miltenberger 血型抗体检测方法， 其特征在于， 包括步骤为 ：

（1）将羊红细胞醛化磁化后与具有连接链的多肽抗原偶联形成人工筛查细胞； （2）将所述人工筛查细胞与检测样本混匀后孵育并洗涤， 再加入荧光标记二抗孵育并洗涤后测定结果，其中所述检测样本包括待检样本、 阴性样本、 阳性样本和空白样本。

2.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述醛化过程是用戊二醛醛化， 所述磁化过程是用磁珠磁化。

3.根据权利要求 1 所述的检测方法， 其特征在于， 所述连接链的氨基酸序列为GGDGDGDGDG。

4.根据权利要求 1 所述的检测方法， 其特征在于， 所述偶联的过程为将所述醛化磁化羊红细胞稀释至体积分数为30-70%， 将所述多肽抗原配制浓度为1-5 mg/mL， 再将所述醛化磁化羊红细胞和所述多肽抗原用滚轴仪在转速为100-300 rpm的条件下混合偶联3-6 h， 得到人工筛查细胞。

5.根据权利要求 1 所述的检测方法， 其特征在于， 所述人工筛查细胞与所述检测样本的体积比为 1:1-3。

6.根据权利要求 1 所述的检测方法， 其特征在于， 所述荧光标记二抗中用于标记的荧光素为花青素 Cy 系列荧光素或 Alexa Fluor 系列荧光素。

7.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 步骤 （2） 中所述加入荧光标记二抗孵育后的洗涤次数为 2-4 次。