CN101382554A - 蓝舌病病毒的生物条形码检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蓝舌病病毒的生物条形码检测方法。该方法是以蓝舌病病毒的VP7蛋白作为检测对象进行的生物条形码检测方法。所述MMP探针包被有抗VP7蛋白的单克隆抗体，NP探针包被有抗VP7蛋白的多克隆抗体。所述对蓝舌病病毒进行生物条形码检测的条形码DNA链具有序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列，互补探针NP链具有序列表中SEQ ID No：2的核苷酸序列。本发明在蓝舌病的诊断及进出口检验检疫领域中有具有较大的实际意义，应用前景广阔。

Description

蓝舌病病毒的生物条形码检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中病毒的检测方法，特别是涉及蓝舌病病毒的生物条形码检测方法。

背景技术

蓝舌病(bluetongue，BT)是由蓝舌病病毒(bluetongue virus，蓝舌病病毒)引起的一种侵害反刍动物的虫媒性传染病，被世界动物卫生组织(World Organizationfor Animal Health，OIE)列为上报疾病，是国内外动物防疫和出入境检验检疫机构监测和防控的重点疫病，对国际间动物贸易具有非常大的影响。

随着医药产品的迅速发展，人用动物源生物制品的研发已成为最为活跃、发展最快的产业之一，例如人用牛源凝血酶、牛源凝血因子VIII、聚合牛血红蛋白、胸腺肽、羊胎盘素等。此外，动物源生物敷料在医药产品的研发中也得到了广泛应用，如牛源明胶可作为人用疫苗稳定剂，牛源胶原可用于制备纤维蛋白止血药敷料等。但是，鉴于该类产品的病毒感染事件时有发生，其病毒安全性问题受到了国际组织、各国政府和社会公众的高度重视。蓝舌病病毒作为反刍动物的常见病毒性病原，已成为动物源生物制品和动物源生物材料等病毒安全性检测的重要病原之一。

蓝舌病病毒是呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)的代表成员。在环状病毒属14个群中，蓝舌病病毒群与鹿流行性出血热病毒群(Epizootichemorrhagic disease virus，EHDV)的亲缘关系最为密切，有较强的交叉反应性。此外，蓝舌病病毒的血清型众多，目前国际公认至少存在24个血清型。

VP7是蓝舌病病毒核心蛋白的主要构成组份，约占核心蛋白总量的36％，是病毒可溶性群特异性抗原。Lewis等通过病毒核心的表面碘化作用进行的研究结果表明，VP7是病毒核心颗粒上的主要暴露蛋白，VP7至少有两个表位暴露于病毒表面，提示VP7可作为利用抗体检测蓝舌病病毒的理想靶位(Lewis SA，Grubman MJ.Bluetonguevirus：surface exposure of VP7.Virus Research，1990，16(1)：17-26)。

上世纪中期以来，蓝舌病广泛流行于热带、亚热带和温带地区的50多个国家和地区，成为世界性危害的虫媒性传染病。我国于1979年5月在云南省师宗首次发现蓝舌病，并分离出蓝舌病病毒，从而确定了蓝舌病的存在，随后湖北、安徽、四川、山西等省区也发现蓝舌病临床病例。目前，全国已有29个省(市)区检出羊蓝舌病病毒抗体，许多省份的牛群中亦发现蓝舌病病毒抗体阳性动物。

2006年8-10月，蓝舌病首次出现在欧洲的比利时、荷兰、德国和法国等地，使蓝舌病北部分布界线从北纬50°北移至北纬53°，这次的发病症状非常严重，造成了巨大的经济损失。2007年7-10月，英国、法国、意大利等国发生蓝舌病爆发，2008年3-4月，保加利亚、法国、意大利等国发生蓝舌病爆发，这引起了国际社会和各国政府的高度关注。

目前，世界各国尚未研制出十分有效的预防蓝舌病的疫苗，也无有效的防治措施。在这种情况下，有必要加强我国蓝舌病病原的监测工作，使用早期准确的检测手段，及时隔离和处理已感动物，是减少经济损失的关键。

目前，人们主要利用病毒分离鉴定、血清学检测和病毒核酸检测等实验室检测手段对蓝舌病进行确切诊断。病毒分离鉴定是OIE推荐的蓝舌病病毒诊断方法之一，其灵敏度高，但完成整个检测过程需1-2月，具有检测周期长的局限性。血清学检测主要包括琼脂免疫扩散试验(AGID)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、病毒中和试验(VNT)等。AGID试验操作简便、敏感性高、成本低，不需要复杂实验设备，是最早得到广泛推广应用的蓝舌病病毒抗体检测方法之一，也是OIE推荐使用的方法，其缺点是与相关环状病毒如EHDV有交叉反应。竞争ELISA(C-ELISA)是OIE推荐的蓝舌病病毒血清学诊断首选方法，是最敏感和特异的蓝舌病病毒抗体检测技术，其缺点在于其检测灵敏度只能达到ng级，已逐渐不能满足检测检疫的要求。近年来，蓝舌病病毒的核酸检测得到广泛研究，然而亦未见商品化的蓝舌病病毒核酸检测试剂上市。

综上所述，建立适于各血清型蓝舌病病毒的高灵敏度、高特异性的检测技术，以及研制相应的检测试剂变得很迫切。

2003年，美国科学家Mirkin(Nam JM，Thaxton CS，Mirkin CA.Nanoparticle-based bio-bar codes for the ultrasensitive detection of proteins.Science，2003，301(5641):1884-1886.)领导的课题组首次报道了一种新型的标记免疫测定技术——生物条形码检测技术(bio-bar codes assay，BCA)，其基本原理几乎等同于ELISA检测中双抗体夹心法高度特异地捕获抗原，通过检测特异条形码DNA链而实现对抗原物质的间接检测。对特异条形码DNA链的检测是用常规PCR扩增或基于金标银染的芯片检测，由于PCR扩增和芯片检测的放大效应，使的检测灵敏度得到极大提高，可达常规ELISA方法的10⁶倍。

利用生物条形码技术检测PSA的方法为：纳米颗粒探针(nanoparticle探针，NP)即是金纳米颗粒包被有双链DNA和抗PSA的多克隆抗体，双链DNA的其中一条和胶体金颗粒通过Au-S键相连，另一条和前者互补是用来指示被检物的条形码DNA，每一个直径为30nm的胶体金上大约标记有400条左右的条形码DNA链(Hurst SJ，Lytton-Jean AR，Mirkin CA.Maximizing DNA loading on a range of gold nanoparticle sizes.Anal.Chem.2006，78：8313-8318.)，磁性微球探针(magnetic microparticle探针，MMP)即是对应于分选磁场的直径约为1μm的磁珠微球，其表面上包被有抗PSA的单克隆抗体。

检测过程包括以下三个步骤：第一步抗原抗体作用 先用抗PSA的单抗功能化的MMP探针特异性地结合标本中可能的PSA，加上磁场固定MMP探针，用PBS溶液反复冲洗，除去未连结的抗原和不相关的蛋白；第二步洗脱和去杂交加入被双链DNA和抗PSA的多抗修饰的NP探针，将被检测物夹在中间，形成一个三明治结构，接着加上磁场，用磁铁固定MMP探针的同时，反复冲洗，除去未连接的NP探针；第三步DNA分离此步是一个去杂交步骤，三明治结构被磁场固定，在高温低盐条件下，NP探针上结合的数以百计的条形码DNA释放在溶液中，接着对条形码DNA进行定量，从而对微量目的蛋白进行定性、定量。

迄今为止，BCA技术已在某些病原标志物的检测上取得了很好的进展。Nam等人首先利用BCA技术对前列腺特异抗原(prostate specific antigen，PSA)进行了检测，利用BCA技术检测PSA的检测下限可达3amol/L，检测下限比现有的传统ELISA方法低6个数量级(Nam JM，Thaxton CS，Mirkin CA.Nanoparticle-based bio-bar codes forthe ultrasensitive detection of proteins.Science，2003，301(5641):1884-1886.)；Georganopoulou等人利用BCA技术对β-淀粉样蛋白源性播散性配基(amyloid β-derived diffusible ligands，ADDL)进行了检测，其检测极限能在15μL脑脊液中检测到50个ADDL分子(Georganopoulou DG，Chang L，Nam JM，et al.Nanoparticle-based detection in cerebral spinal fluid of a solublepathogenic biomarker for Alzheimer’s disease.Proc Natl Acad Sci，2005，102(7):2273-2276)；Stoeva等人利用BCA技术对血清中的三种肿瘤标志物PSA、人体绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)和α胎儿球蛋白(α-fetoprotein，AFP)进行了联合检测，检测结果显示检测限度可达170f mol/L(Stoeva SI，Lee JS，Smith JE，et al.Multiplexed detection of protein cancermarkers with biobarcoded nanoparticle probes.Am Chem Soc，2006，128(26):8378-8379)。

发明内容

本发明提供了一种灵敏度较高的蓝舌病病毒的生物条形码检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：本发明所提供的蓝舌病病毒的生物条形码检测方法，是以蓝舌病病毒的VP7蛋白作为检测对象进行的生物条形码检测方法。

所述检测方法中使用的MMP探针包被有抗VP7蛋白的单克隆抗体，NP探针包被有抗VP7蛋白的多克隆抗体。

所述抗VP7蛋白的单克隆抗体和抗VP7蛋白的多克隆抗体均可采用生物技术领域中的常规方法制备。

优选的对蓝舌病病毒进行生物条形码检测的条形码DNA链具有序列表中SEQ IDNo：1的核苷酸序列，互补探针NP链具有序列表中SEQ ID No：2的核苷酸序列。

具体来讲，所述蓝舌病病毒的生物条形码检测方法可包括以下步骤：

1)NP探针的制备：用常规方法及金纳米颗粒、抗VP7蛋白的多克隆抗体、上述互补探针NP链和条形码DNA链制备NP探针；

2)MMP探针的制备：用磁性微球和抗VP7蛋白的单克隆抗体制备MMP探针；

3)蓝舌病病毒的生物条形码检测：利用NP探针、MMP探针和蓝舌病病毒通过抗原、抗体作用制备NP-VP7-MMP三明治复合物，然后在高温低盐条件下，释放条形码DNA链，最后对获得的条形码DNA链进行常规PCR检测和/或芯片检测，以对蓝舌病病毒进行定性、定量检测。

在上述蓝舌病病毒的生物条形码检测方法中，步骤1)中可利用柠檬酸三钠还原法制备金纳米颗粒，金纳米颗粒的直径可为20-40nm，优选为30nm；可利用蓝舌病病毒全病毒免疫新西兰大白兔制备抗VP7蛋白的多克隆抗体。

步骤2)中磁性微球的直径为0.5-1.5um，优选为1um；可通过将蓝舌病病毒杂交瘤细胞株免疫BALB/c小鼠的方法制备抗VP7蛋白的单克隆抗体。

为获得更好的检测效果，所述步骤1)和步骤2)中还包括对NP探针和MMP探针进行纯化的步骤。

本发明的第二个目的是提供一种蓝舌病病毒的生物条形码检测试剂盒。

本发明所提供的试剂盒，可包括包被有抗VP7蛋白的单克隆抗体的MMP探针，以及包被有抗VP7蛋白的多克隆抗体的NP探针。

所述优选的与NP探针联结的条形码DNA链具有序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列，互补探针NP链具有序列表中SEQ ID No：2的核苷酸序列。

所述试剂盒中还可包括芯片检测所需的检测探针和捕获DNA链，所述检测探针可与条形码DNA链特异结合，所述捕获DNA链可与检测探针特异结合，以将其固定在芯片上。

本发明提供了一种蓝舌病病毒的生物条形码检测方法。该方法是以蓝舌病病毒颗粒上的VP7蛋白为检测对象的灵敏度较高(可达10fg/mL)的检测方法。本发明具有以下优点：

1、首次建立了蓝舌病病毒的生物条形码检测方法，利用此检测方法可以对细胞培养物、分泌物、血液和肉品等中的蓝舌病病毒进行高灵敏检测。

2、本检测方法与蓝舌病病毒的其它常规检测方法如病毒的分离培养鉴定、琼脂糖扩散实验和竞争ELISA相比，具有相当高的灵敏度，检测灵敏度是常规ELISA方法的10⁶倍。

3、本检测方法与蓝舌病病毒的其它常规检测方法，如病毒的分离培养鉴定、琼脂糖扩散实验和竞争ELISA相比，具有相当高的特异性，只要使用高特异的抗蓝舌病病毒的单克隆抗体就能保证检测方法的高特异性。

4、本检测方法与蓝舌病病毒的其它常规检测方法，如病毒的分离培养鉴定、琼脂糖扩散实验和竞争ELISA相比，具有操作程序简单易用的特点，并可进一步制成检测试剂盒，操作程序化，适合大面积推广和应用。

5、本检测方法为研制蓝舌病病毒的生物条形码检测试剂奠定了基础。

6、本检测方法为其它类似的被检物，尤其是那些不适于建立核酸检测方法的微量物质如毒素、生物战剂、类固醇、脂类、维生素、肿瘤特异性标志物等的检测提供了新方法，对被检物建立类似检测体系起到了良好的借鉴作用。

综上所述，本发明在蓝舌病的诊断及进出口检验检疫领域中有具有较大的实际意义，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为VP7蛋白灵敏度的常规PCR检测结果

图2为蓝舌病病毒灵敏度的常规PCR检测结果

图3为VP7蛋白灵敏度的芯片检测结果

图4为蓝舌病病毒灵敏度的芯片检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物及核苷酸序列均由北京三博远志公司合成。

实施例1、蓝舌病病毒的生物条形码检测

用本发明的生物条形码检测方法对蓝舌病病毒进行定性、定量检测，具体方法包括以下步骤：

一、寡核苷酸链的合成

设计并合成本发明蓝舌病病毒生物条形码检测方法中所用的寡核苷酸链，序列如下：

条形码DNA链：

5’-CGCATTCAGGATTGCATGATTGCCTCGTCTTAACGGTCTCAACTCGTA-3’(序列表中SEQ IDNo：1)

互补探针NP链：

5’-TACGAGTTGAGACCGTTAAGACGAGGCAACATGCAATCCTGAATGCGA₁₀-(CH₂)₆-SH-3’(序列表中SEQ ID No：2)

捕获DNA链(芯片检测用)：

5’-HS-(CH₂)₆-A₁₀-TACGAGTTGAGACCGTTAAGACGA-3’

NP标签链(芯片检测用)：

5’-GGCAATCATGCAATCCTGAATGCGA₁₀-(CH₂)₆-SH-3’

2、金纳米颗粒的制备

用柠檬酸钠还原法制备直径为30nm(20-40nm均可)的金纳米颗粒，具体方法为：取500mL0.01％(质量百分浓度)的氯化金(HAuCl₄)溶液，在搅动的情况下加热至沸腾后迅速准确加入7.5mL的1％(质量百分浓度)的柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)水溶液，继续加热煮沸15min，整个过程始终用磁力搅拌器进行搅拌，当溶液的颜色渐渐加深，最后为深紫红色，停止加热，最好将制备好的纳米金用0.45μm的尼龙膜过滤，冷却至室温，4℃避光保存。

蓝舌病病毒多抗的制备

3、抗VP7蛋白的多克隆抗体的制备

利用蓝舌病病毒免疫新西兰大白兔制备抗VP7蛋白的多克隆抗体，具体方法包括以下：每只雄性新西兰大白兔免疫前，都由耳缘静脉取血2mL，静置分离血清，-20℃保存，以待作为阴性对照用；免疫方案：首次免疫，每只家兔注射2mL的乳化抗原，于足掌及肘窝淋巴结周围，背部两侧、领下、耳后等处皮下多点注射，对照兔子注射等量生理盐水，2周后以同样的剂量(含等体积弗氏不完全佐剂)加强免疫，背部多点注射，2周后再次加强免疫，10天后进行第3次加强免疫，约10天以后进行末次免疫，直接用2mL乳化抗原静脉注射。每次加强免疫后7-10天从兔耳缘静脉采血2-3mL，用间接ELISA法检测抗体效价。结果末次免疫后抗体效价达10⁴，符合要求，末次免疫后7天即用颈动脉放血法采血，4℃静置过夜(10-12小时)，次日4000rpm离心10min，收集上清，分装后-20℃保存。

4、金纳米颗粒-蓝舌病病毒多抗复合物的制备

分别取1mL步骤2制备的金纳米颗粒和1mL(0.45μg)抗VP7蛋白的多克隆抗体，用0.1mol/L K₂CO₃调节至pH9.0，然后在搅拌条件下将金纳米颗粒和抗VP7蛋白的多克隆抗体混合，10min后再加入稳定剂(5％BSA)，使其最终浓度为1％(或加入1％聚乙二醇(PEG，分子量20kD)至标记物总量的1/10)，以防止抗体蛋白和金纳米颗粒的聚合和发生沉淀。

5、NP探针的制备、纯化及鉴定

用下述方法制备NP探针：将互补探针NP链(终浓度为2μmol/L)加入被抗VP7蛋白的多克隆抗体修饰的金纳米颗粒(浓度为4.5nmol/L)中，室温放置16小时；再用磷酸盐缓冲液调整pH值至7.0，增强离子浓度至0.1mol/L NaCl，室温放置40小时，然后10,000rpm离心30min，得到互补探针NP链修饰的金纳米颗粒；将得到的深红色沉淀用含0.1M NaCl的10mM PBS(pH7.0)溶液洗涤3次，去除未标记的金纳米颗粒；最后，将条形码DNA链(终浓度为2μmol/L)加入上述互补探针NP链修饰的金纳米颗粒中，室温下杂交4小时后，14,000rpm离心30分钟，得到NP探针。

6、抗VP7蛋白的单克隆抗体的制备

1)杂交瘤细胞的制备

通过BHK-21接种，增殖蓝舌病病毒，将收获的病毒液用甲醛灭活。用纯化病毒免疫Balb/c小鼠，取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。用ELISA试验筛选阳性株，采用有限稀释法对其进行克隆，经过融合共获得2株能稳定分泌抗BTV VP7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为3E2和1C11(杨姝，李文超，吕茂民等.群特异性蓝舌病病毒单克隆抗体的制备和鉴定.生物技术通讯，2008年第6期)。

2)抗VP7蛋白的单克隆抗体的大量制备

用步骤1)获得的杂交瘤细胞免疫BALB/c小鼠制备抗VP7蛋白的单克隆抗体，方法为：采用6-8周雌性BALB/c小鼠，在注射杂交瘤细胞前7天，预先腹腔注射0.5mL灭菌液体石蜡；然后，每只鼠腹腔注射含1-5×10⁶个杂交瘤细胞的0.5mL的培养液；当小鼠产生腹水时(1-3周)，腹部穿刺放出腹水(1-5mL)，隔天穿刺直至小鼠死亡；随后，3000rpm离心15min，除去腹水中的细胞；将上清无菌储存或加0.01％叠氮钠置于-70℃冰箱保存备用。

7、MMP探针的制备、纯化及鉴定

将100μg抗VP7蛋白的单克隆抗体溶于20mL PBS中，将其加入到激活的磁珠(直径为1.0um，0.5-1.5um均可)中，剧烈振荡，然后将烧瓶置于混合器上反应16-24小时；磁性分离，弃掉上清；在40mL PBS中重悬磁珠；加入20mL淬灭剂(甘氨酸)，剧烈振荡，将其放在混合器上反应30min；磁性分离，弃掉上清；用PBS洗3次，磁性分离；最后，用50mL洗液重悬磁珠，4℃保存。

8、检测探针的制备、纯化及鉴定

将NP标签链(终浓度为2μmol/L)加入金纳米颗粒(浓度为4.5nmol/L)中，室温放置16小时；再用磷酸盐缓冲液调整pH值至7.0，增强离子浓度至0.1mol/LNaCl，室温放置40小时，10,000rpm离心30min得到检测探针；纯化：用0.3mol/L NaCl，10mmol/L pH7.0的PBS混悬，离心，洗涤两次，最后用0.3mol/L的PBS溶解，得到纯化的检测探针。

9、蓝舌病病毒的生物条形码检测方法的建立

将50μL步骤7制备的抗VP7抗原的单克隆抗体功能化的磁性微球(5mg/mL)加入10μL已知浓度的VP7蛋白(100fg/mL)或一定滴度的蓝舌病病毒中，在37℃下剧烈振荡1小时；加上磁场固定MMP探针，用PBS溶液反复冲洗，除去未连结的VP7抗原和不相关的蛋白；加入步骤5制备的被双链DNA和抗VP7蛋白的多克隆抗体修饰的0.1nmol/L金纳米颗粒探针50μl，剧烈振荡30分钟，形成NP-VP7-MMP三明治结构；加上磁场，再用磁铁固定MMPs的同时，用500μl的PBS缓冲液反复冲洗4次，除去未连接的NP探针；最后，加入50μl超纯水到三明治结构中，60℃剧烈振荡30分钟，使条形码DNA链去杂交。三明治复合物被磁性分离，收集上清液，内含条形码DNA链，用于定性、定量检测。

10、条形码DNA链的常规PCR检测

在引物1：5’-CGCATTCAGGATTGCATGAT-3’和引物2：5’-TACGACTTGACACCGTTAAG-3’的引导下，对步骤9获得的条形码DNA链进行普通PCR扩增，PCR反应条件如下：

反应结束后，取5μl扩增产物，进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，缓冲液为TAE，100伏25分钟，在凝胶成像系统下观察并记录结果。VP7蛋白灵敏度的常规PCR检测结果如图1所示(泳道M：低分子量Marker；泳道1-7：VP7蛋白的浓度依次为1pg/mL、100fg/mL、10fg/mL、1fg/mL、100ag/mL、10ag/mL、0g/mL)，蓝舌病病毒灵敏度的常规PCR检测结果如图2所示(泳道M：低分子量Marker；泳道1-7：蓝舌病病毒滴度的浓度依次为10^-1TCID₅₀/0.1mL、10^-2TCID₅₀/0.1mL、10^-3TCID₅₀/0.1mL、10^-4TCID₅₀/0.1mL、10^-5TCID₅₀/0.1mL、10^-6TCID₅₀/0.1mL、0TCID₅₀/0.1mL)，当有扩增条带时，结果为阳性。检测结果表明本发明的检测方法具有较高的灵敏度，VP7蛋白检测灵敏度可达1fg/mL，蓝舌病病毒检测灵敏度可达10^-4TCID₅₀/0.1mL。

11、条形码DNA的芯片检测

取25μl条形码DNA和10μl步骤8制备的检测探针和65μl PBS(pH7.0)混匀，点在检测玻片上，放置在杂交盒内，在42℃下杂交3小时，同时，向盒内加入500μl3×SSC以保证湿度；杂交完毕后，用3×SSC洗脱，以除去多余的检测探针；将银染液A液1mL和B液1mL混匀，加在芯片的捕获DNA链处，静置，平板扫描仪记录结果。VP7蛋白灵敏度的VP7蛋白灵敏度的芯片检测结果如图3所示(泳道M：低分子量Marker；泳道1-7：VP7蛋白的浓度依次为1pg/mL、100fg/mL、10fg/mL、1fg/mL、100ag/mL、10ag/mL、0g/mL)，蓝舌病病毒灵敏度的芯片检测结果如图4所示(泳道M：低分子量Marker；泳道1-7：蓝舌病病毒滴度的浓度依次为10^-1TCID₅₀/0.1mL、10^-2TCID₅₀/0.1mL、10^-3TCID₅₀/0.1mL、10^-4TCID₅₀/0.1mL、10^-5TCID₅₀/0.1mL、10^-6TCID₅₀/0.1mL、0TCID₅₀/0.1mL)，当结果大于cutoff值，结果为阳性。检测结果表明本发明的检测方法具有较高的灵敏度，VP7蛋白检测灵敏度可达1fg/mL，蓝舌病病毒检测灵敏度可达10^-4TCID₅₀/0.1mL。

12、蓝舌病病毒的生物条形码检测试剂盒的制备

1、常规PCR检测试剂盒

将步骤5制备的NP探针，步骤7制备的MMP探针，以及步骤10中的引物1和引物2共同包装，得到蓝舌病病毒的生物条形码检测试剂盒。

2、芯片检测试剂盒

将步骤5制备的NP探针，步骤7制备的MMP探针，步骤8制备的检测探针以及步骤1中的捕获DNA链共同包装，得到蓝舌病病毒的生物条形码检测试剂盒。

序列表

<160>2

<210>1

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

<210>2

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Claims (10)

1、蓝舌病病毒的生物条形码检测方法，是以蓝舌病病毒的VP7蛋白作为检测对象进行的生物条形码检测方法。

2、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述检测方法中使用的MMP探针包被有抗VP7蛋白的单克隆抗体，NP探针包被有抗VP7蛋白的多克隆抗体。

3、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述对蓝舌病病毒进行生物条形码检测的条形码DNA链具有序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列，互补探针NP链具有序列表中SEQ ID No：2的核苷酸序列。

4、根据权利要求1或2或3所述的检测方法，其特征在于：所述蓝舌病病毒的生物条形码检测方法包括以下步骤：

1)NP探针的制备：用常规方法及金纳米颗粒、抗VP7蛋白的多克隆抗体、互补探针NP链和条形码DNA链制备NP探针；

2)MMP探针的制备：用磁性微球和抗VP7蛋白的单克隆抗体制备MMP探针；

3)蓝舌病病毒的生物条形码检测：利用NP探针、MMP探针和蓝舌病病毒通过抗原、抗体作用制备NP-VP7-MMP三明治复合物，然后在高温低盐条件下，释放条形码DNA链，最后对获得的条形码DNA链进行常规PCR检测和/或芯片检测。

5、根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述步骤1)中用柠檬酸三钠还原法制备金纳米颗粒，金纳米颗粒的直径为20-40nm；用蓝舌病病毒全病毒免疫新西兰大白兔制备抗VP7蛋白的多克隆抗体。

6、根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述步骤2)中磁性微球的直径为0.5-1.5um；用蓝舌病病毒杂交瘤细胞株免疫BALB/c小鼠的方法制备抗VP7蛋白的单克隆抗体。

7、根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述步骤1)和步骤2)中还包括对NP探针和MMP探针进行纯化的步骤。

8、一种蓝舌病病毒的生物条形码检测试剂盒，包括包被有抗VP7蛋白的单克隆抗体的MMP探针，以及包被有抗VP7蛋白的多克隆抗体的NP探针。

9、根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述与NP探针联结的条形码DNA链具有序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列，互补探针NP链具有序列表中SEQ ID No：2的核苷酸序列。

10、根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括芯片检测所需的检测探针和捕获DNA链。

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