CN101986157A - 一种新型生物条形码检测方法及其应用 - Google Patents

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章金刚
贾茗娴
杨姝
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Abstract

本发明公开了一种生物条形码检测方法及其应用。该方法是在普通生物条形码检测方法的基础上，将标记的条形码DNA链改进为单链，并将其长度延长为适于进行荧光定量PCR/TaqMan荧光探针检测的长度，三明治反应复合物中条形码DNA链不用解离，直接用基于TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR方法或普通PCR方法对三明治反应复合物中条形码DNA链进行定性、定量检测的生物条形码检测方法。本发明降低了检测成本，简化了检测程序，可对被检物进行精确定量，具有准确度高、检测速度快、对仪器设备要求低和成本低廉等优点。本发明对于各种目标蛋白的高灵敏度检测具有较大的实际意义，应用前景广阔。

Description

一种新型生物条形码检测方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域中的检测方法及其应用，特别是涉及一种新型的简易生物条形码检测方法及其在生物检测中的应用。
背景技术
生物条形码检测技术(bio-bar codes assay，BCA)是美国西北大学Mirkin教授领导的课题组于2003年首次报道的一种新型标记免疫测定技术，其突出特点是具有极高的灵敏度，可达常规ELISA方法的106倍(Nam JM，Thaxton CS，Mirkin CA.Nano-particle-based bio-bar codes for the ultrasensitive detection of proteins.Science，2003，301(5641)：1884-1886)。
BCA技术的基本原理是利用被检物单抗标记的磁性微球探针(magnetic micropar-ticles，MMPs)和被检物多抗及特异DNA双链标记的金纳米颗粒探针(nanoparticle，NP)，通过形成MMP-被检物-NP三明治复合物后再利用去杂交将NP探针上标记的特异DNA链释放出来，再通过常规PCR方法或芯片检测方法(金标银染法)鉴定这些释放的DNA链就可确定被检物的存在。
BCA技术中，NP探针标记有双链DNA(48bp)和病原的多克隆抗体，双链DNA的其中一条和胶体金颗粒通过Au-S键相连，另一条和前者互补是用来指示被检物的条形码DNA，每一个直径为30nm的胶体金上大约标记有400条左右的条形码DNA链(Hurst SJ，Lytton-Jean AR，Mirkin CA.Maximizing DNA loading on a range of gold nanoparticle sizes.Anal Chem，2006，78：8313-8318)；MMP探针是对应于分选磁场的直径约为1μm的磁珠微球，其表面上包被有抗病原的单克隆抗体。BCA技术通过抗原抗体高度特异性反应捕获抗原，再通过检测条形码DNA而实现对被检物的间接检测，由于双链DNA标记的一次放大以及PCR反应和芯片检测的二次放大效应，使检测灵敏度得到极大提高。
迄今为止，BCA技术已在某些病原标志物的检测上取得了很好的进展。Nam等人首先利用BCA技术对前列腺特异抗原(prostate specific antigen，PSA)进行了检测，检测下限可达3amol/L，比传统ELISA方法低6个数量级(Nam JM，Thaxton CS，Mirkin CA.Nanoparticle-based bio-bar codes for the ultrasensitive detection of proteins.Science，2003，301(5641)：1884-1886)。Georganopoulou等人利用BCA技术对β-淀粉样蛋白源性播散性配基(amyloid β-derived diffusible ligands，ADDL)进行了检测，能在15μl脑脊液中检测到50个ADDL分子(Georganopoulou DG，Chang L，Nam JM，et al.Nano-particle-based detection in cerebral spinal fluid of a soluble pathogenic biomarker for Alzh-eimer’s disease.Proc Natl Acad Sci，2005，102(7)：2273-2276)。Stoeva等人利用BCA技术对血清中的三种肿瘤标志物PSA、人体绒毛膜促性腺激素(human chorionic gona-dotropin，HCG)和α胎儿球蛋白(α-fetoprotein，AFP)进行了联合检测，检测限度可达170f mol/L(Stoeva SI，Lee JS，Smith JE，et al.Multiplexed detection of protein can-cer markers with biobarcoded nanoparticle probes.Am Chem Soc，2006，128(26)：8378-8379)。
综上所述，BCA技术与现代标记免疫检测技术的金标准-ELISA技术相比，具有非常显著的优点，具体表现在以下几个方面：(1)BCA技术显示了比常规的ELISA方法高出六个数量级(100万倍)的敏感性；(2)针对不同的被检物设计不同长度和序列的条形码DNA，可分析复杂样本中的多种物质；(3)具有较高的特异性，其特异性决定于检测系统使用的单克隆抗体的特异性，只要使用高特异的抗目标检物的单克隆抗体就能保证检测系统的高特异性；(4)检测范围广，只要被检物具有单抗和多抗，就可对其进行检测，这使得它在检测一些不适宜用PCR技术检测的微量物质方面具有很大的优势。
但是，从BCA技术检测的过程和显示体系可以看出，这种技术存在着明显的缺陷。在PCR反应中，由于模板、试剂、焦磷酸盐分子的聚集等因素影响聚合酶反应，最终导致PCR反应不再以指数形式进行而进入“平台期”，一些反应的终产物比另一些要多，因此终点PCR反应方法定量不准确；其次，终点PCR容易交叉污染，产生假阳性。传统BCA技术标记的DNA为双链，长度为48bp左右，不仅操作繁琐、检测过程冗长，而且也间接影响到检测灵敏度，此外还不适宜于进行基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR检测，不能对样品模板进行精确定量分析。条形码DNA的芯片检测由于银染试剂自身的缺点而易产生假阳性，阴阳性不易界定，染色结果因时间、环境因素变化很大。
发明内容
本发明提供了一种用于病原抗原高灵敏度检测的生物条形码(BCA)检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：一种生物条形码检测方法，是在普通生物条形码检测方法的基础上，将标记的条形码DNA链改进为单链，并将其长度延长为适于进行荧光定量PCR/TaqMan荧光探针检测的长度，三明治反应复合物中条形码DNA链不用解离，直接用基于TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR方法或普通PCR方法对三明治反应复合物中条形码DNA链进行定性、定量检测的生物条形码检测方法。
具体来讲，所述生物条形码检测方法可包括以下步骤：
(1)NP探针的制备：设计适用荧光定量PCR/TaqMan荧光探针检测的条形码DNA单链，然后利用金纳米颗粒、抗待测物的多克隆抗体和条形码DNA单链制备NP探针；
(2)MMP探针的制备：用磁性微球和抗待测物的单克隆抗体制备MMP探针；
(3)条形码DNA检测：利用NP探针、MMP探针和待测物通过抗原、抗体作用制备三明治复合物，然后将复合物上标记的条形码DNA链直接进行基于TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR检测或普通PCR检测，以对待测物进行定性、定量检测。
在上述生物条形码检测方法中，所述步骤(1)中的金纳米颗粒直径可为10～40nm，优选为15nm；优选的用于生物条形码检测的单链条形码DNA链可具有序列表中SEQ IDNo：1的核苷酸序列。
所述步骤(2)中磁性微球的直径可为0.5～3μm，优选为2.8μm。
所述步骤(3)中优选的用于对条形码DNA链进行实时荧光定量PCR检测的引物对的上游引物具有序列表中SEQ ID No：2的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQID No：3的核苷酸序列，TaqMan荧光探针具有序列表中SEQ ID No：4的核苷酸序列。
为获得更好的检测效果，所述步骤(1)和步骤(2)中还包括对NP探针和MMP探针进行纯化的步骤。
所述新型生物条形码检测方法的检测范围较广阔，对病毒、细菌、毒素(如蓖麻毒素)、生物战剂、类固醇、脂类、维生素、肿瘤特异性标志物等均可进行检测。
当待测物为蓖麻毒素时，可用蓖麻毒素蛋白作为检测对象进行生物条形码检测。所述检测方法中使用的MMP探针标记有抗蓖麻毒素蛋白的单克隆抗体，NP探针标记有抗蓖麻毒素蛋白的多克隆抗体。当待测物为蓝舍病病毒时，可用VP7蛋白作为检测对象进行生物条形码检测。所述检测方法中使用的MMP探针标记有抗VP7蛋白的单克隆抗体，NP探针标记有抗VP7蛋白的多克隆抗体。依此类推，针对不同的检测物，只需要改变检测目标蛋白，在检测方法中对应调整目标蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体，这些单克隆抗体和多克隆抗体均可采用生物技术领域中的常规方法制备，也可从公司直接购买。
本发明的第二个目的是提供一种生物条形码检测试剂盒。
本发明所提供的试剂盒包括包被有抗待测物单克隆抗体的MMP探针，包被有抗待测物多克隆抗体和条形码单链DNA链的NP探针，以及用于实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan荧光探针。
在上述试剂盒中，优选的与NP探针联结的条形码DNA链具有序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列；优选的用于对条形码DNA链进行实时荧光定量PCR检测的引物对的上游引物具有序列表中SEQ ID No：2的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID No：3的核苷酸序列；优选的用于对条形码DNA链进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan荧光探针具有序列表中SEQ ID No：4的核苷酸序列。
本发明在传统生物条形码检测方法基础上，对标记的条形码DNA链进行了创新，并引进基于TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR对标记DNA进行检测，不仅简化了检测步骤，还可对标记DNA进行直接定性、定量检测。本发明与常规的生物条形码检测方法相比，本发明的BCA检测方法采用长片段、单链条形码DNA链制备NP探针，可直接对反应复合物上的条形码DNA链进行检测，不用预先解离，降低了检测成本，并大大简化了检测程序；此外，利用基于TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR方法对条形码DNA链进行检测，可对被检物进行精确定量，并且消除了常规生物条形码检测方法的阴阳性界限不清等问题，具有准确度高、检测速度快、对仪器设备要求低和成本低廉等优点。本发明对于各种目标蛋白的高灵敏度检测具有较大的实际意义，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为条形码DNA链的荧光定量PCR检测扩增曲线图(蓖麻毒素)
图2为条形码DNA链的荧光定量PCR检测标准曲线图(蓖麻毒素)
图3为条形码DNA链的常规PCR检测扩增产物电泳图(蓖麻毒素)
图4：条形码DNA链的荧光定量PCR检测扩增曲线图(BTV VP7蛋白)
图5为条形码DNA链的荧光定量PCR检测标准曲线图(BTV VP7蛋白)
图6为条形码DNA链的常规PCR检测扩增产物电泳图(BTV VP7蛋白)
具体实施方式
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物、条形码DNA链和TaqMan荧光探针均由TaKaRa公司合成；纳米金颗粒购自Ted pella公司；磁性微球颗粒购自Invitrogen公司；蓖麻毒素蛋白、抗蓖麻毒素蛋白多克隆抗体和抗蓖麻毒素蛋白单克隆抗体均购自诺维森生物科技有限公司；其他目标蛋白及其多克隆抗体和单克隆抗体也均可商购。
实施例1、蓖麻毒素的新型生物条形码(BCA)检测
本实施例以对蓖麻毒素蛋白进行定性、定量检测为例，说明本发明的新型BCA检测方法如何实施，具体包括以下步骤：
(1)NP探针的制备
条形码DNA链合成：设计并合成用于本发明中NP探针制备的条形码DNA链，其序列为：5’-GTG ACT GCA AGT CCA TTG AGG TGA AAT AGC CAG TTC TCG TGG CAT TTGCGT AAT CCT GAT GTA TCG CTC GGT GGT TGC CAA CTA GAG AAC-3’(序列表中SEQ IDNo：1)。
NP探针制备：取10.5μg待检病原的多抗(购自诺维森生物科技有限公司)加入到100μL纳米金(15nm，10～40nm均可)溶液里混合均匀，之后用0.1M NaOH调节pH值至9.5；室温下振荡30min；加入20μL 100μM的单链DNA链，10℃下孵育16h，使溶液中的纳米金粒子和抗体、DNA能充分作用；加入585μL 10％的BSA室温孵育30min；4℃、13000g离心20min，去除上清；之后用0.1M NaCl作为稳定剂，边加边混匀，使稳定剂的终浓度为0.1M，静置7～10h以上，重悬沉淀，定溶至原来的体积。4～8℃保存。
(2)MMP探针制备
缓冲液(Buffer)A：6.18g H3BO3(MW 61.83)添加到800mL蒸馏水中，用5M NaOH调节pH值到9.5，使用蒸馏水定溶至1L。
缓冲液B：2.62g NaH2PO4 H2O(MW137.99)、14.42g Na2HPO4 2H2O(MW 177.99)用蒸馏水定溶到1L，pH值为7.4。
缓冲液C：在缓冲液A或缓冲液B中溶解39.64g(NH4)2SO4，用NaOH或者HCl调节pH值至9.5或7.4，最后用缓冲液A或缓冲液B定溶至100mL。
缓冲液D：0.88g NaCl(MW 58.4)、0.5％(w/v)BSA to 80mL0.01M PBS(pH 7.4)，充分混匀后定溶至100mL，用0.01M PBS(pH 7.4)调节pH 7.4。
缓冲液E：0.88g NaCl(MW 58.4)、0.1％(w/v)BSA到80mL 0.01M PBS(pH 7.4)充分混匀后用0.01M PBS(pH 7.4)定溶至100mL。
把66μL磁珠(直径为2.8μm，0.5～3μm均可，2×109beads/mL)移入EP管后置入磁场中，使磁珠完全沉淀下来，去除上清和除去磁场；加入1mL Buffer A或BufferB重悬磁珠，反复吹打；重新置入磁场中，使磁珠完全沉淀下来，去除上清；除去磁场；之后加入40μL待检病原的单抗(购自诺维森生物科技有限公司)和20μL的Buffer A，反复涡旋；加入40μL Buffer C之后涡旋振荡，37℃孵育12～18h；重新置入磁场，使磁珠沉淀，去除上清；除去磁场；加入1mL Buffer D 37℃孵育1h；再次置入磁场，使磁珠再次完全沉淀，去除上清和磁场；加入1mL Buffer E，涡旋5～10sec；置入磁场，使磁珠完全沉淀，去除上清和除去磁场；之后重复用1mL Buffer E洗涤；最后用96μL的Buffer E重悬磁珠，使磁珠溶液浓度为20mg/mL。4～8℃保存。
(3)蓖麻毒素新型BCA检测中三明治检测复合物的形成
将15μL MMP(20mg/mL)加入30μL蓖麻毒素蛋白(100fg/mL)中，37℃剧烈振荡1h；加入磁场固定MMP探针，用PBS溶液反复冲洗，除去未连接的蓖麻毒素蛋白和其它杂质；加入45μL NP探针，剧烈振荡30min；加入磁场，用500μLPBS反复冲洗4次，除去未连接的NP探针。反复冲洗后用50μL超纯水溶解。得到MMP-蓖麻毒素蛋白-NP三明治结构，复合物中的条形码DNA链可用于下一步的定性、定量检测。
(4)条形码DNA链的实时荧光定量PCR检测
对步骤(3)中的条形码DNA链进行基于TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR检测。
25μl反应体系为：2×PCR缓冲液12.5μl，上游引物1μl(50mM)，下游引物1μl(50mM)，TaqMan荧光探针1μl(25mM)，三明治复合物样品2μl，ddH2O 7.5μl。
反应条件为：95℃ 10s，95℃ 5s，52℃ 20s，共45个循环，每一循环退火结束时收集FAM荧光信号。
上游引物：5’-GTT CTC TAG TTG GCA ACC ACC-3’(序列表中SEQ ID No：2)
下游引物：5’-GTG ACT GCA AGT CCA TTG AGG-3’(序列表中SEQ ID No：3)
TaqMan荧光探针：5’-FAM-AGT TCT CGT GGC ATT TGC GTA ATC C TAMRA-3’(序列表中SEQ ID No：4)
条形码DNA链的荧光定量PCR检测扩增曲线图如图1所示(曲线a、b、c、d、e和f分别为102fg/mL、101fg/mL、100fg/mL、10-1fg/mL、10-2fg/mL和10-3fg/mL，曲线g为阴性对照。)，条形码DNA链的荧光定量PCR检测标准曲线如图2所示(标准曲线方程为y＝45.02-3.35x)，上述检测结果表明本检测的蓖麻毒素蛋白检测灵敏度可达10-2fg/mL。
(5)条形码DNA链的常规PCR检测
对步骤(3)中的条形码DNA链进行常规PCR检测。25μl PCR反应体系为：2×PCR缓冲液12.5μl，上游引物1μl(50mM)，下游引物1μl(50mM)，三明治结构2μl，ddH2O 8.5μl。PCR反应条件为：95℃ 10s，95℃ 5s，52℃ 20s，72℃ 20s，共35个循环；最后72℃ 7min，4℃终止反应。反应结束后，取PCR扩增产物各10μl进行3％琼脂糖凝胶电泳检测(100V电泳40min)。
上游引物：5’-GTT CTC TAG TTG GCA ACC ACC-3’(序列表中SEQ ID No：2)
下游引物：5’-GTG ACT GCA AGT CCA TTG AGG-3’(序列表中SEQ ID No：3)常规PCR检测结果如图3所示(泳道M为DL2000 DNA Marker，泳道a～g分别为102fg/mL、101fg/mL、100fg/mL、10-1fg/mL、10-2fg/mL、10-3fg/mL和阴性对照。)，检测结果表明本检测蓖麻毒素蛋白检测灵敏度可达10-2fg/mL。
实施例2、蓝舌病病毒(BTV)的新型生物条形码(BCA)检测
用本发明的新型BCA检测方法对蓝舌病病毒BTV VP7蛋白进行定性、定量检测，具体方法包括以下步骤：
(1)NP探针的制备
抗BTV VP7蛋白的多克隆抗体的制备：利用蓝舌病病毒免疫新西兰大白兔制备抗VP7蛋白的多克隆抗体，具体方法包括以下：每只雄性新西兰大白兔免疫前，都由耳缘静脉取血2mL，静置分离血清，-20℃保存，以待作为阴性对照用；免疫方案：首次免疫，每只家兔注射2mL的乳化抗原，于足掌及肘窝淋巴结周围，背部两侧、领下、耳后等处皮下多点注射，对照兔子注射等量生理盐水，2周后以同样的剂量(含等体积弗氏不完全佐剂)加强免疫，背部多点注射，2周后再次加强免疫，10天后进行第3次加强免疫，约10天以后进行末次免疫，直接用2mL乳化抗原静脉注射。每次加强免疫后7-10天从兔耳缘静脉采血2-3mL，用间接ELISA法检测抗体效价。结果末次免疫后抗体效价达104，符合要求，末次免疫后7天即用颈动脉放血法采血，4℃静置过夜(10-12小时)，次日4000rpm离心10min，收集上清，分装后-20℃保存。
条形码DNA链合成：设计并合成用于本发明中NP探针制备的条形码DNA链，其序列为：5’-GTG ACT GCA AGT CCA TTG AGG TGA AAT AGC CAG TTC TCG TGG CAT TTG CGT AAT CCT GAT GTA TCG CTC GGT GGT TGC CAA CTA GAG AAC-3’(序列表中SEQ ID No：1)。
NP探针制备：取10.5μg BTV VP7的多抗加入到100μL纳米金(15nm，10～40nm均可)溶液里混合均匀，之后用0.1M NaOH调节pH值至9.5；室温下振荡30min；加入20μL 100μM的单链DNA链，10℃下孵育16h，使溶液中的纳米金粒子和抗体、DNA能充分作用；加入585μL 10％的BSA室温孵育30min；4℃、13000g离心20min，去除上清；之后用0.1M NaCl作为稳定剂，边加边混匀，使稳定剂的终浓度为0.1M，静置7～10h以上，重悬沉淀，定溶至原来的体积。4～8℃保存。
(2)MMP探针制备
缓冲液(Buffer)A：6.18g H3BO3(MW 61.83)添加到800mL蒸馏水中，用5M NaOH调节pH值到9.5，使用蒸馏水定溶至1L。
缓冲液B：2.62g NaH2PO4 H2O(MW137.99)、14.42g Na2HPO4 2H2O(MW 177.99)用蒸馏水定溶到1L，pH值为7.4。
缓冲液C：在缓冲液A或缓冲液B中溶解39.64g(NH4)2SO4，用NaOH或者HCl调节pH值至9.5或7.4，最后用缓冲液A或缓冲液B定溶至100mL。
缓冲液D：0.88g NaCl(MW 58.4)、0.5％(w/v)BSA to 80mL 0.01M PBS(pH 7.4)，充分混匀后定溶至100mL，用0.01M PBS(pH 7.4)调节pH 7.4。
缓冲液E：0.88g NaCl(MW58.4)、0.1％(w/v)BSA到80mL 0.01M PBS(pH 7.4)充分混匀后用0.01M PBS(pH 7.4)定溶至100mL。
抗BTV VP7蛋白的单克隆抗体的制备：用杂交瘤细胞免疫BALB/c小鼠制备抗VP7蛋白的单克隆抗体，方法为：采用6-8周雌性BALB/c小鼠，在注射杂交瘤细胞前7天，预先腹腔注射0.5mL灭菌液体石蜡；然后，每只鼠腹腔注射含1-5×106个杂交瘤细胞的0.5mL的培养液；当小鼠产生腹水时(1-3周)，腹部穿刺放出腹水(1-5mL)，隔天穿刺直至小鼠死亡；随后，3000rpm离心15min，除去腹水中的细胞；将上清无菌储存或加0.01％叠氮钠置于-70℃冰箱保存备用。
把66μL磁珠(直径为2.8μm，0.5～3μm均可，2×109beads/mL)移入EP管后置入磁场中，使磁珠完全沉淀下来，去除上清和除去磁场；加入1mL Buffer A或BufferB重悬磁珠，反复吹打；重新置入磁场中，使磁珠完全沉淀下来，去除上清；除去磁场；之后加入40μL BTV VP7的单抗和20μL的Buffer A，反复涡旋；加入40μL BufferC之后涡旋振荡，37℃孵育12～18h；重新置入磁场，使磁珠沉淀，去除上清；除去磁场；加入1mL Buffer D 37℃孵育1h；再次置入磁场，使磁珠再次完全沉淀，去除上清和磁场；加入1mL Buffer E，涡旋5～10sec；置入磁场，使磁珠完全沉淀，去除上清和除去磁场；之后重复用1mL Buffer E洗涤；最后用96μL的Buffer E重悬磁珠，使磁珠溶液浓度为20mg/mL。4～8℃保存。
(3)BTV VP7新型BCA检测中三明治检测复合物的形成
将15μL MMP(20mg/mL)加入30μL BTV VP7蛋白(100fg/mL)中，37℃剧烈振荡1h；加入磁场固定MMP探针，用PBS溶液反复冲洗，除去未连接的VP7蛋白和其它杂质；加入45μL NP探针，剧烈振荡30min；加入磁场，用500μL PBS反复冲洗4次，除去未连接的NP探针。反复冲洗后用50μL超纯水溶解。得到MMP-BTV VP7-NP三明治结构，复合物中的条形码DNA链可用于下一步的定性、定量检测。
(4)条形码DNA链的实时荧光定量PCR检测
对步骤(3)中的条形码DNA链进行基于TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR检测。
25μl反应体系为：2×PCR缓冲液12.5μl，上游引物1μl(50mM)，下游引物1μl(50mM)，TaqMan荧光探针1μl(25mM)，三明治复合物样品2μl，ddH2O 7.5μl。
反应条件为：95℃ 10s，95℃ 5s，52℃ 20s，共45个循环，每一循环退火结束时收集FAM荧光信号。
上游引物：5’-GTT CTC TAG TTG GCA ACC ACC-3’(序列表中SEQ ID No：2)
下游引物：5’-GTG ACT GCA AGT CCA TTG AGG-3’(序列表中SEQ ID No：3)
TaqMan荧光探针：5’-FAM-AGT TCT CGT GGC ATT TGC GTA ATC C-TAMRA-3’(序列表中SEQ ID No：4)
条形码DNA链的荧光定量PCR检测扩增曲线图如图4所示(曲线a、b、c、d、e和f分别为102fg/mL、101fg/mL、100fg/mL、10-1fg/mL、10-2fg/mL和10-3fg/mLBTV VP7)，条形码DNA链的荧光定量PCR检测标准曲线如图5所示(标准曲线方程为y＝33.46-3.32x)，上述检测结果表明本检测的BTV VP7检测灵敏度可达10-2fg/mL。
(5)条形码DNA链的常规PCR检测
对步骤(3)中的条形码DNA链进行常规PCR检测。25μl PCR反应体系为：2×PCR缓冲液12.5μl，上游引物1μl(50mM)，下游引物1μl(50mM)，三明治结构2μl，ddH2O 8.5μl。PCR反应条件为：95℃ 10s，95℃ 5s，52℃ 20s，72℃ 20s，共35个循环；最后72℃ 7min，4℃终止反应。反应结束后，取PCR扩增产物各10μl进行3％琼脂糖凝胶电泳检测(100V电泳40min)。
上游引物：5’-GTT CTC TAG TTG GCA ACC ACC-3’(序列表中SEQ ID No：2)
下游引物：5’-GTG ACT GCA AGT CCA TTG AGG-3’(序列表中SEQ ID No：3)
常规PCR检测结果如图6所示(泳道M为DL2000 DNA Marker，泳道a～g分别为103fg/mL、102fg/mL、101fg/mL、100fg/mL、10-1fg/mL、10-2fg/mL和10-3fg/mL)，检测结果表明本检测BTV VP7蛋白检测灵敏度可达10-2fg/mL。
利用本发明方法针对多种来源(如病毒、细菌、毒素、生物战剂、类固醇、脂类、维生素、肿瘤特异性标志物)的检测物，仅需确定检测的目标蛋白，检测过程与实施例1和实施例2所列步骤完全相同，所不同的是需使用目标蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体(这些单克隆抗体和多克隆抗体均可采用生物技术领域中的常规方法制备，也可直接购买)，在此不一一赘述；针对不同目标蛋白用本发明方法进行检测，也能达到与实施例1和实施例2类似的检测效果。
实施例3、新型BCA检测试剂盒的制备
将实施例中的条形码DNA链、上游引物、下游引物、TaqMan荧光探针、金钠米颗粒和磁性微球共同包装，得到新型BCA检测试剂盒。
Figure ISA00000330996800011

Claims (10)

1.一种生物条形码检测方法，是在普通生物条形码检测方法的基础上，将标记的条形码DNA链改进为单链，并将其长度延长为适于进行荧光定量PCR/TaqMan荧光探针检测的长度，三明治反应复合物中条形码DNA链不用解离，直接用基于TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR方法或普通PCR方法对三明治反应复合物中条形码DNA链进行定性、定量检测的生物条形码检测方法。
2.根据权利要求1所述的生物条形码检测方法，其特征在于：所述生物条形码检测方法包括以下步骤：
(1)NP探针的制备：设计适用荧光定量PCR/TaqMan荧光探针检测的条形码DNA单链，然后利用金纳米颗粒、抗待测物的多克隆抗体和条形码DNA单链制备NP探针；
(2)MMP探针的制备：用磁性微球和抗待测物的单克隆抗体制备MMP探针；
(3)条形码DNA检测：利用NP探针、MMP探针和待测物通过抗原、抗体作用制备三明治复合物，然后将复合物上标记的条形码DNA链直接进行基于TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR检测或普通PCR检测，以对待测物进行定性、定量检测。
3.根据权利要求2所述的生物条形码检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中的金纳米颗粒直径为10～40nm，优选为15nm；用于生物条形码检测的单链条形码DNA链具有序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列。
4.根据权利要求2所述的生物条形码检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中磁性微球的直径为0.5～3μm，优选为2.8μm。
5.根据权利要求2所述的生物条形码检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中用于对条形码DNA链进行实时荧光定量PCR检测的引物对的上游引物具有序列表中SEQ ID No：2的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID No：3的核苷酸序列，TaqMan荧光探针具有序列表中SEQ ID No：4的核苷酸序列。
6.根据权利要求2所述的生物条形码检测方法，其特征在于：所述步骤(1)和步骤(2)中还包括对NP探针和MMP探针进行纯化的步骤。
7.权利要求1-6任一项所述的生物条形码检测方法在检测病毒、细菌、毒素、生物战剂、类固醇、脂类、维生素和肿瘤特异性标志物中目标蛋白的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于：所述毒素为蓖麻毒素，目标蛋白为蓖麻毒素蛋白，检测中使用的MMP探针标记有抗蓖麻毒素蛋白的单克隆抗体，NP探针标记有抗蓖麻毒素蛋白的多克隆抗体；所述病毒为蓝舍病病毒，目标蛋白为VP7蛋白，检测中使用的MMP探针标记有抗VP7蛋白的单克隆抗体，NP探针标记有抗VP7蛋白的多克隆抗体。
9.一种生物条形码检测试剂盒，包括包被有抗待测物单克隆抗体的MMP探针，包被有抗待测物多克隆抗体和条形码单链DNA链的NP探针，以及用于实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan荧光探针。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述与NP探针联结的条形码DNA链具有序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列；用于对条形码DNA链进行实时荧光定量PCR检测的引物对的上游引物具有序列表中SEQ ID No：2的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID No：3的核苷酸序列；用于对条形码DNA链进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan荧光探针具有序列表中SEQ ID No：4的核苷酸序列。
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