CN101198707A - 基于生物条形码检测靶分析物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于检测样品中是否存在一种或多种靶分析物,例如,生物分子的筛选方法,组合物,和试剂盒。具体地说,本发明涉及使用报道寡核苷酸作为生化条形码检测溶液中的多种蛋白质结构或其它靶分析物的方法。
Description
技术领域:
本发明涉及用于检测样品中是否存在一种或多种靶分析物,例如,蛋白质,核酸,或其它化合物的筛选方法。具体地说,本发明涉及使用报道寡核苷酸作为生化条形码检测溶液中的一种或多种分析物的方法。
交叉参考:
本申请是2004年6月25日申请的美国专利申请10/877,750和2004年6月25日申请的国际申请PCT/US04/020493的部分连续申请,两者以其整体引用以供参考。本申请要求了2004年5月12日申请的临时申请号60/570,723;2004年7月1日申请的60/585,294;和2005年1月19日申请的——(代理人档案号05-192)的权利。本申请还要求2003年9月25日申请的临时申请号60/506,708;2003年6月27日申请的60/482,979;2003年8月21日申请的60/496,893;2003年10月28日申请的60/515,243;2003年12月18日申请的60/530,797的权利且它是2002年3月27日申请的美国专利申请系列号10/108,211的部分延续,后者要求了以其整体作为参考文献引用的2000年3月28申请的美国临时申请号60/192,699;和2001年11月13日申请的60/350,560的权利,且它是2001年3月28日申请的美国专利申请系列号09/820,279的部分延续。本申请中所报道的工作由NSF,ARO,AFOSR,DARPA,和NIH拨款部分资助。本文的工作也得到国家卫生研究所先锋奖金1DP1-0D000285-01和空军科学研究办公室拨款F496-20-01-1-0401和爱迪生基金6144601-05-0001的部分资助。因此,美国政府明确享有本申请中所述发明的权利。
背景技术:
分析物的检测对于分子生物学研究和医学应用都是重要的。现在基于荧光,质谱法,凝胶电泳,激光扫描和电化学的诊断方法可用于鉴定各种蛋白质结构。1-4基于抗体的反应广泛用于鉴定血细胞的遗传学蛋白质变异体,诊断疾病,定位组织中的分子探针,和纯化分子或完成分离过程。5对于医学诊断应用(例如,疟疾和HIV),诸如酶联免疫吸附测定法,Western印迹,和间接荧光抗体试验的抗体试验对于鉴定单个靶蛋白结构极其有用。6,7对存在的多种抗体进行迅速和同时的样品筛选在研究和临床应用中都是有益的。然而,在试验条件下使用上述相关方法同时检测一些蛋白质结构是困难,昂贵,和耗时的。
聚合酶链式反应(PCR)和其它形式的靶扩增使得用于研究,法医,和临床应用的检测和定量感兴趣的DNA靶的有效工具的开发迅速发展。26-32相应的蛋白质靶扩增方法的开发可显著改进医学诊断和发展蛋白质学(proteomics)领域。33-36尽管还不能化学复制蛋白质靶,但是可以用寡核苷酸标记来标记该靶,接着可用PCR进行扩增,然后使用DNA检测法来鉴定该感兴趣的靶。37-45该方法通常称为免疫-PCR,它允许检测带有各种不同形式的DNA标记的蛋白质(图5)。至今,所有的免疫-PCR方法均包含异质测定法(heterogeneous assays),即它包含开始将靶分析物固定到一个表面,随后使用带DNA标记的抗体进行检测(例如,参见美国专利号5,635,602,和5,665,539)。该DNA标记一般牢固地结合到抗体上(通过共价相互作用或链霉抗生物素蛋白-生物素结合)。尽管这些方法在蛋白质检测中具有显著进步,但是它们也具有一些缺点:1)由于DNA识别序列与检测抗体的比率低而限制了灵敏度;2)由于靶捕捉过程的异质特性而延缓了靶结合动力学,即增加了测定时间并降低了测定灵敏度(图5步骤3);3)化学连接抗体与DNA-标记所需的结合化学复杂(图5步骤4);和4)需要PCR扩增步骤。45因此,需要能够多重化且容易实施的一种灵敏和迅速的检测样品中靶分析物的方法。
对于DNA检测方法,使用放射性标记,分子荧光团,化学发光系统,电化学标记,和最近的基于纳米结构(nanostructure)的标记已经开发了许多测定法。61-70尽管一些基于纳米结构的方法在灵敏度方面接近PCR,但是至今都不能达到PCR产生的1-10拷贝的灵敏度水平。允许进行PCR-样信号扩增而无与PCR相关的复杂性,昂贵,时间和劳动密集型特点的方法相对于基于PCR的方法将提供明显的优势。
发明概要:
本发明涉及使用寡核苷酸作为生化条形码用于检测溶液中的多种分析物的方法,探针,组合物,和试剂盒。该方法利用以纳米颗粒(nanoparticles)直接或间接功能化(functionalized)的特异性结合对的识别元件,和导致金纳米颗粒聚集的杂交事件可明显改变其物理特性(例如,光学,电学,力学)的以前观察结果8-12。总体思路是特异性结合对的各识别元件可与具有分开且可剪裁(tailorable)的杂交和解链特性的不同寡核苷酸序列和一个与纳米颗粒相连的物理标记相联。该分开的杂交和解链特性可用于通过与纳米颗粒相连的物理标记的改变或者通过杂交/去杂交或解链/退火事件检测寡核苷酸序列来解码多分析物试验中的一系列分析物。
本发明提供了检测样品中存在的一种或多种靶分析物的方法,样品中的各靶分析物具有与特异性结合补体发生特异性结合相互作用的至少两个结合位点,该方法包括步骤:
a)提供至少一种类型的捕捉基质,该捕捉基质具有与其结合的与特异性靶分析物的至少第一结合位点结合的该特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体;
b)提供至少一种类型的微粒检测探针,该微粒检测探针包含具有下列成份与其结合的微粒:(i)特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体和(ii)多个DNA条形码,该DNA条形码任选用报道标记进行标记,其中与微粒检测探针结合的特异性结合补体与该靶分析物的至少一个第二结合位点结合;
c)将捕捉基质与相信含有靶分析物的样品在允许特异性靶分析物与结合到捕捉基质上的特异性结合补体结合的有效条件下接触以便将该靶分析物固定到捕捉基质上;
d)将固定的靶分析物与至少一种类型的微粒检测探针在允许靶分析物与结合到微粒检测探针上的该分析物的特异性结合补体之间结合并在存在靶分析物时在捕捉基质上形成复合物的有效条件下进行接触;
e)任选分离和洗涤捕捉基质以去掉未结合的微粒检测探针;和
f)检测DNA条形码的存在,其中存在该DNA条形码表示样品中存在特异性靶分析物。
另外,本发明提供了检测样品中存在的一种或多种靶分析物的方法,样品中的各靶分析物具有与特异性结合补体发生特异性结合相互作用的至少两个结合位点,该方法包括步骤:
a)提供至少一种类型的捕捉基质,该捕捉基质具有与其结合的与特异性靶分析物的至少第一结合位点结合的特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体;
b)提供至少一种类型的微粒检测探针,该微粒检测探针包含具有下列成份与其结合的微粒:(i)特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体和(ii)多个DNA条形码,该DNA条形码用荧光标记,其中与微粒检测探针结合的特异性结合补体与该靶分析物的至少一个第二结合位点结合;
c)将捕捉基质与相信含有靶分析物的样品在允许特异性靶分析物与结合到捕捉基质上的特异性结合补体结合的有效条件下接触以便将该靶分析物固定到捕捉基质上;
d)将固定的靶分析物与至少一种类型的微粒检测探针在允许靶分析物与结合到微粒检测探针上的该分析物的特异性结合补体之间结合并在存在靶分析物时在捕捉基质上形成复合物的有效条件下进行接触;
e)任选分离和洗涤捕捉基质以去掉未结合的微粒检测探针;和
f)检测DNA条形码中荧光信号的存在,其中存在荧光信号表示样品中存在特异性靶分析物。
本发明还提供了检测样品中存在的一种或多种靶分析物的方法,样品中的各靶分析物具有与特异性结合补体发生特异性结合相互作用的至少两个结合位点,该方法包括步骤:
a)提供至少一种类型的捕捉基质,该捕捉基质具有与其结合的与特异性靶分析物的至少第一结合位点结合的特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体;
b)提供至少一种类型的微粒检测探针,该微粒检测探针包含具有下列成份与其结合的微粒:(i)特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体和(ii)多个DNA条形码,该DNA条形码用荧光标记,其中与微粒检测探针结合的特异性结合补体与该靶分析物的至少一个第二结合位点结合;
c)将捕捉基质与相信含有靶分析物的样品在允许特异性靶分析物与结合到捕捉基质上的特异性结合补体结合的有效条件下接触以便将该靶分析物固定到捕捉基质上;
d)将固定的靶分析物与至少一种类型的微粒检测探针在允许靶分析物与结合到微粒检测探针上的该分析物的特异性结合补体之间结合并在存在靶分析物时在捕捉基质上形成复合物的有效条件下进行接触;
e)任选分离和洗涤捕捉基质以去掉未结合的微粒检测探针;
f)在有效释放该DNA条形码的条件下处理该分离的洗涤捕捉基质;和
g)检测DNA条形码中荧光信号的存在,其中存在DNA条形码的荧光信号表示样品中存在特异性靶分析物。
另外,本发明提供了检测样品中存在的一种或多种靶分析物的方法,样品中的各靶分析物具有与特异性结合补体发生特异性结合相互作用的至少两个结合位点,该方法包括步骤:
a)提供至少一种类型的捕捉基质,该捕捉基质具有与其结合的与特异性靶分析物的至少第一结合位点结合的特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体;
b)提供至少一种类型的微粒检测探针,该微粒检测探针包含具有下列成份与其结合的微粒:(i)特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体和(ii)多个DNA条形码,该DNA条形码包含报道标记,其中与微粒检测探针结合的特异性结合补体与该靶分析物的至少一个第二结合位点结合;
c)将捕捉基质与相信含有靶分析物的样品在允许特异性靶分析物与结合到捕捉基质上的特异性结合补体结合的有效条件下接触以便将该靶分析物固定到捕捉基质上;
d)将固定的靶分析物与至少一种类型的微粒检测探针在允许靶分析物与结合到微粒检测探针上的该分析物的特异性结合补体之间结合并在存在靶分析物时在捕捉基质上形成复合物的有效条件下进行接触;
e)任选分离和洗涤捕捉基质以去掉未结合的微粒检测探针;
f)在有效释放该DNA条形码的条件下处理该分离的洗涤捕捉基质;和
g)检测DNA条形码中报道标记的存在,其中存在DNA条形码的报道标记表示样品中存在特异性靶分析物。
本发明还提供了检测样品中存在的一种或多种靶分析物的方法,样品中的各靶分析物具有与特异性结合补体发生特异性结合相互作用的至少两个结合位点,该方法包括步骤:
a)提供至少一种类型的捕捉基质,该捕捉基质具有与其结合的与特异性靶分析物的至少第一结合位点结合的特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体;
b)提供至少一种类型的颗粒检测探针,该颗粒检测探针包含具有下列成份与其结合的微粒或纳米颗粒:(i)特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体和(ii)多个DNA条形码,该DNA条形码任选用报道标记进行标记,其中与颗粒检测探针结合的特异性结合补体与该靶分析物的至少一个第二结合位点结合;
c)将捕捉基质与相信含有靶分析物的样品在允许特异性靶分析物与结合到捕捉基质上的特异性结合补体结合的有效条件下接触以便将该靶分析物固定到捕捉基质上;
d)将固定的靶分析物与至少一种类型的颗粒检测探针在允许靶分析物与结合到颗粒检测探针上的该分析物的特异性结合补体之间结合并在存在靶分析物时在捕捉基质上形成复合物的有效条件下进行接触;
e)任选分离和洗涤捕捉基质以去掉未结合的微粒检测探针;
f)通过化学释放剂从该颗粒检测探针释放该DNA条形码;和
g)检测DNA条形码的存在,其中存在DNA条形码表示样品中存在特异性靶分析物。
本发明还提供了检测样品中存在的一种或多种靶分析物的方法,样品中的各靶分析物具有与特异性结合补体发生特异性结合相互作用的至少两个结合位点,该方法包括步骤:
a)提供可从样品中分离的至少一种类型的捕捉基质,该捕捉基质具有与其结合的与特异性靶分析物的至少第一结合位点结合的特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体;
b)将捕捉基质与相信含有靶分析物的样品在允许特异性靶分析物与结合到捕捉基质上的特异性结合补体结合的有效条件下接触以便将该靶分析物固定到捕捉基质上;
c)任选分离捕捉基质和样品中与其结合的任何靶分析物;
d)提供至少一种类型的颗粒检测探针,该颗粒检测探针包含具有下列成份与其结合的颗粒:(i)特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体和(ii)任选用报道标记进行标记的多个寡核苷酸,其中与颗粒检测探针结合的特异性结合补体与该靶分析物的至少一个第二结合位点结合;
e)将固定的靶分析物与至少一种类型的颗粒检测探针在允许靶分析物与结合到颗粒检测探针上的该分析物的特异性结合补体之间结合并在存在靶分析物时在捕捉基质上形成复合物的有效条件下进行接触,其中该复合物包含包含靶分析物和捕捉基质和颗粒检测探针;
f)任选分离该复合物与未结合的颗粒检测探针;和
g)检测该复合物的存在,其中存在该复合物表示样品中存在特异性靶分析物。
如本文所述,本发明的测定方法高度灵敏且可在不超过60分钟内完成,不需要酶扩增或扫描测量(scanometric)检测系统。通过排除PCR和扫描测量方法而不损失灵敏度,本发明的方法克服了这两种常规方法中的一些缺陷,例如测定时间长和测定复杂。另外,由于其简便性,非科学家,例如护士,医生,和士兵在简单培训后应当能够学会如何使用本发明的方法。通过对不同靶蛋白使用不同荧光团可容易地复合进行本发明的方法且通过优化探针浓度和反应条件可更进一步缩短总测定时间。另外,本发明的方法可用于检测可在夹心试验中检测的任何靶,包括蛋白质,DNA,RNA,小分子,和金属离子。另外,可将其它类型的报道基团连接到条形码上以便进行非荧光检测的方法来鉴定该条形码和扩增的检测信号。它们包括,但不限于,氧化还原活性基团,具有电标记的基团,放射性基团,催化基团,具有不同吸收特性的基团,和具有拉曼(Raman)标记的基团。该报道基团可以是具有不同且可测量的化学或物理标记的任何物质。
在本发明的一个实施方案中,提供了一种用于检测样品中是否存在一种或多种靶分析物的方法,该靶分析物具有至少两个结合位点,该方法包括步骤:
提供一种基质;提供一种或多种类型的颗粒探针,每种类型的探针包含具有特定靶分析物的一种或多种特异性结合补体和一种或多种DNA条形码与其结合的颗粒,其中每种类型的颗粒探针的特异性结合补体对特定靶分析物具有特异性,且每种类型的颗粒探针的DNA条形码用作该特定靶分析物的标记;
将该靶分析物固定到该基质上;
在允许靶分析物与该分析物的特异性结合补体之间结合且在靶分析物存在的条件下形成复合物的有效条件下将该固定的靶分析物与一种或多种类型的颗粒探针接触;
洗涤该基质以去掉未结合的颗粒探针;和
任选扩增该DNA条形码;和
检测是否存在该DNA条形码,其中是否存在该标记表示样品中是否存在特异性靶分析物。
在本发明的该实施方案的一个方面,该靶分析物是蛋白质或半抗原且其特异性结合补体是包含单克隆或多克隆抗体的抗体。
在本发明的另一方面,DNA条形码通过PCR进行扩增。
在本发明的另一方面,该颗粒用至少两个DNA条形码进行标记。
在本发明的另一方面,该基质上排列了靶分析物的一种或多种类型的捕捉探针。
在本发明的另一实施方案中,提供了一种检测样品中是否存在一种或多种靶分析物的方法,每种靶分析物具有至少两个结合位点,该方法包括:
提供结合于基质上的一种或多种类型的捕捉探针,每种类型的捕捉探针包含特异性靶分析物的第一结合位点的特异性结合补体;
提供一种或多种类型的检测探针,每种类型的检测探针包含具有与其结合的寡核苷酸的纳米颗粒,该特异性靶分析物的第二结合位点的一个或多个特异性结合补体,和用作特定靶分析物标记的一个或多个DNA条形码,其中该DNA条形码序列的至少一部分与结合到纳米颗粒上的至少一些寡核苷酸杂交;
在允许靶分析物和探针之间发生特异性结合相互作用且在存在靶分析物时形成聚集复合物的有效条件下接触样品,捕捉探针,和检测探针;
洗涤基质以去掉未结合的检测探针;
检测基质上的聚集复合物中是否存在该DNA条形码,其中是否存在该DNA条形码的检测结果是样品中是否存在靶分析物的指标。
在本发明的该实施方案的一个方面,该检测探针包含(i)特异性靶分析物的第二结合位点的一个或多个特异性结合补体,(ii)与纳米颗粒结合的至少一种类型的寡核苷酸,和具有与至少一种类型的寡核苷酸的至少一部分互补的预定序列的DNA条形码,该DNA条形码与各类型的检测探针结合用作特定靶分析物的标记;
在该实施方案的另一方面,在所述的检测步骤之前,该方法还包括步骤:
在使复合物去杂交且释放该DNA条形码的有效条件下处理该聚集复合物;和
在所述检测前扩增该DNA条形码。
在该实施方案的另一方面,该DNA条形码通过PCR扩增。
在该实施方案的另一方面,捕捉探针结合到诸如磁性颗粒的磁性基质上。
在该实施方案的另一方面,靶分析物是具有至少两个部分的序列的靶核酸,该检测探针包含具有与其结合的寡核苷酸的纳米颗粒,该寡核苷酸的至少一部分具有与该DNA条形码互补的序列,该检测探针的特异性结合补体包含具有与靶核酸的第一部分互补的序列的第一靶识别寡核苷酸,捕捉探针的特异性结合补体包含具有与靶核酸的至少第二部分互补的序列的第二靶识别寡核苷酸。
在该实施方案的另一方面,该靶分析物是具有至少两个部分的序列的靶核酸,该检测探针包含具有寡核苷酸与其结合的纳米颗粒,该DNA条形码具有与结合到该检测探针上的寡核苷酸的至少一部分互补的序列,该特异性结合补体包含具有至少第一和第二部分的序列的靶识别寡核苷酸,该第一部分与靶核酸的第一部分互补且第二部分与结合到纳米颗粒上的寡核苷酸的至少一部分互补,该基质的特异性结合补体包含具有与靶核酸的第二部分互补的至少一部分的靶识别寡核苷酸。
在该实施方案的另一方面,该检测探针包含树突体(dendrimer)。
在本发明的另一实施方案中,提供了检测样品中是否存在一种或多种靶分析物的方法,每种靶分析物具有至少两个结合位点,该方法包括:
提供一种或多种类型的捕捉探针,每种类型的捕捉探针包含(i)磁性颗粒;和(ii)附着到磁性颗粒上的第一特异性结合对的第一个成员,其中第一特异性结合对的第一成员结合到特异性靶分析物的第一结合位点上;
提供各靶分析物的一种或多种类型的检测探针,每种类型的检测探针包含(i)纳米颗粒;(ii)附着到纳米颗粒上的第二特异性结合对的第一个成员,其中该第二特异性结合对的第一个成员与靶分析物的第二结合位点结合;(iii)与纳米颗粒结合的至少一种类型的寡核苷酸;和(iv)至少一种类型的DNA条形码,每种类型的DNA条形码具有与特定类型的寡核苷酸的至少一部分互补的预定序列且用作特异性靶分析物的标记;
在允许靶分析物和探针之间进行特异性结合相互作用且在存在靶分析物的条件下与磁性颗粒结合形成聚集复合物的有效条件下接触该样品与捕捉探针和检测探针;
洗去磁性颗粒上未结合的检测探针;和
检测复合物中是否存在DNA条形码,其中该DNA条形码的检测结果是靶分析物存在的指标。
在该实施方案的一个方面,该方法还包括在所述检测步骤前的步骤:
使用磁场分离该聚集复合物;
在去杂交和聚集复合物释放该DNA条形码有效的条件下处理该聚集复合物;
分离该释放的DNA条形码。
在该实施方案的另一方面,该方法还包括扩增释放的DNA条形码。
在该实施方案的另一方面,该方法还包括:
提供具有寡核苷酸与其结合的基质,该寡核苷酸具有与DNA条形码序列的至少一部分互补的序列;
提供包含与其结合的寡核苷酸的纳米颗粒,其中结合到纳米颗粒上的寡核苷酸的至少一部分具有与DNA条形码的至少一部分互补的序列;和
在允许DNA条形码的至少第一部分与结合到基质上的互补寡核苷酸之间和DNA条形码的第二部分与结合到纳米颗粒上的一些寡核苷酸之间杂交的有效条件下接触DNA条形码,结合到基质上的寡核苷酸,和纳米颗粒。
在该实施方案的另一方面,在检测前通过PCR扩增该DNA条形码。
在该实施方案的另一方面,该方法还包含在分析聚集复合物前分离该聚集复合物。
在该实施方案的另一方面,通过对聚集复合物使用磁场来分离该聚集复合物。
在该实施方案的另一方面,该纳米颗粒是诸如金纳米颗粒的金属纳米颗粒或半导体纳米颗粒。
在该实施方案的另一方面,特异性结合对是抗体和抗原;受体和配体;酶和底物;药物和靶分子;抗体核酸(aptamer)和抗体核酸靶;两条至少部分互补的寡核苷酸链。
在该实施方案的另一方面,该DNA条形码可用生物素标记,放射性标记,或荧光标记。
在本发明的另一实施方案中,提供了检测样品中是否存在一种或多种靶分析物的方法,该方法包括:
提供至少一种或多种类型的颗粒复合物探针,每种类型的探针包括与其结合的寡核苷酸,特异性靶分析物的一种或多种特异性结合补体,用作特定靶分析物标记的一种或多种DNA条形码,其中该DNA条形码序列的至少一部分与结合到纳米颗粒上的至少一些寡核苷酸杂交;
在允许靶分析物和颗粒复合物探针之间发生特异性结合相互作用且在存在靶分析物的条件下形成聚集复合物的有效条件下接触该样品与颗粒复合物探针;和
观察是否出现聚集复合物形成。
本发明的另一实施方案提供了检测是否存在一种或多种靶分析物的方法,每种靶分析物具有至少两个结合位点。该方法包括对于每种靶分析物使用至少一种类型的捕捉探针和至少一种类型的检测探针。这些探针可在进行实际测定之前产生或者在进行测定时原位产生。捕捉探针包含第一特异性结合对的第一成员,其中该第一特异性结合对的第一成员与靶分析物的第一结合位点结合,其中第一特异性结合对的第一成员任选与基质结合。在一个优选的实施方案中,该基质包括磁性颗粒。检测探针包括(1)纳米颗粒;(2)附着到纳米颗粒上的第二特异性结合对的第一成员,其中第二特异性结合对的第一成员与靶分析物的第二结合位点结合;和(3)与纳米颗粒结合的至少一种类型的寡核苷酸;和(4)至少一种类型的DNA条形码,每种类型的DNA条形码具有与特定类型的寡核苷酸的至少一部分互补的预定序列。当在含有靶分析物的样品中使用时,捕捉探针上的第一特异性结合对的第一成员与靶分析物的第一结合位点结合,检测探针上的第二特异性结合对的第一成员与靶分析物的第二结合位点结合。当捕捉探针和检测探针由靶分析物带到一起时出现聚集。分离该聚集物并进行进一步的解链分析以鉴定具体靶分析物,其中存在如上所述的多种靶。另外,该聚集物可去杂交以释放DNA条形码。
在该实施方案的一个方面,每种类型的颗粒复合物探针中的DNA条形码具有不同且用作特定靶分析物标识符的序列。
在该实施方案的另一方面,该方法还包含如下步骤:
分离聚集复合物;和
分析该聚集复合物以测定具有不同序列的一种或多种DNA条形码的存在。
在该实施方案的另一方面,该方法还包括如下步骤:
分离该聚集复合物;
在该聚集复合物去杂交且释放DNA条形码有效的条件下处理该聚集复合物;
分离该DNA条形码;和
检测具有不同序列的一种或多种DNA条形码的存在,其中各DNA条形码是样品中存在特定靶分析物的指标。
在该实施方案的另一方面,该方法还包括如下步骤:
分离聚集复合物;
在该聚集复合物去杂交且释放DNA条形码有效的条件下处理该聚集复合物;
分离该DNA条形码;
扩增分离的DNA条形码;和
检测具有不同序列的一种或多种扩增的DNA条形码的存在,其中各DNA条形码是样品中存在特定靶分析物的指标。
在该实施方案的另一方面,该靶具有两个以上的结合位点且提供至少两种类型的颗粒复合物探针,第一种类型的探针具有靶分析物上第一结合位点的特异性结合补体,第二种类型的探针具有探针上第二结合位点的特异性结合补体。可提供许多颗粒复合物探针,每种类型的探针具有靶分析物上不同结合位点的一种特异性结合补体。
在该实施方案的另一方面,存在一种或多种DNA条形码的检测步骤包括:
提供具有寡核苷酸与其结合的基质,该寡核苷酸具有与DNA条形码序列的至少一部分互补的序列;
提供含有寡核苷酸与其结合的纳米颗粒,其中与纳米颗粒结合的寡核苷酸的至少一部分具有与DNA条形码的至少一部分互补的序列;和
在允许DNA条形码的至少第一部分与结合到基质上的互补寡核苷酸之间和DNA条形码的第二部分与结合到纳米颗粒上的一些寡核苷酸之间杂交的有效条件下接触DNA条形码,结合到基质上的寡核苷酸,和纳米颗粒;和
观察可检测的改变。
在该实施方案的另一方面,该基质包含以阵列方式附着其上的许多类型的寡核苷酸以便允许检测一种或多种不同类型的DNA条形码。
在该实施方案的另一方面,可检测的改变是在基质上形成暗区域。
在该实施方案的另一方面,可检测的改变用光学扫描器观察。
在该实施方案的另一方面,基质与银染剂接触以产生可检测的改变。
在该实施方案的另一方面,DNA条形码在允许DNA条形码与结合到基质上的互补寡核苷酸杂交的有效条件下与基质接触,且随后将结合到基质上的DNA条形码在允许结合到纳米颗粒上的至少一些寡核苷酸与基质上的DNA条形码序列的一部分杂交的有效条件下与具有寡核苷酸与其结合的纳米颗粒接触。
在该实施方案的另一方面,DNA条形码在允许DNA条形码与结合到纳米颗粒上的至少一些寡核苷酸杂交的有效条件下与具有寡核苷酸与其结合的纳米颗粒接触;且随后将结合到纳米颗粒上的DNA条形码在允许结合到纳米颗粒上的DNA条形码序列的至少一部分与结合到基质上的互补寡核苷酸杂交的有效条件下与基质接触。
在该实施方案的另一方面,在接触步骤前扩增DNA条形码。
在该实施方案的另一方面,提供至少两种类型的颗粒复合物探针,第一种类型的探针具有靶分析物第一结合位点的特异性结合补体,第二种类型的探针具有靶分析物第二结合位点的特异性结合补体。
在本发明的另一实施方案中,提供了颗粒复合物探针。因此,在该实施方案的一个方面,颗粒复合物探针包含具有寡核苷酸与其结合的颗粒,一种或多种DNA条形码,和具有与其结合的特异性靶分析物的特异性结合补体的寡核苷酸,其中(i)DNA条形码具有至少两个部分的序列;(ii)附着到颗粒上的至少一些寡核苷酸具有与DNA条形码的第一部分互补的序列;(iii)具有与其结合的特异性结合补体的寡核苷酸具有与DNA条形码的第二部分互补的序列;和(iv)每种类型的颗粒复合物探针中的DNA条形码具有不同且用作特定靶分析物标识符的序列。
在该实施方案的另一方面,颗粒复合物探针包含具有至少两种类型的寡核苷酸与其结合的颗粒,一种或多种DNA条形码,和具有与其结合的靶分析物的特异性结合补体的寡核苷酸,其中与探针结合的第一类型的寡核苷酸具有与DNA条形码至少一部分互补的序列,与探针结合的第二种类型的寡核苷酸具有一个这样的序列,即它与具有特异性结合补体的寡核苷酸序列的至少一部分互补。
在该实施方案的另一方面,颗粒复合物探针包含具有寡核苷酸与其结合的颗粒,一个或多个DNA条形码,和靶分析物的特异性结合补体,其中与颗粒结合的寡核苷酸的至少一部分具有与DNA条形码序列的至少一部分互补的序列且其中该DNA条形码用作特定靶分析物的标识符。
在本发明的另一实施方案中,提供了一种颗粒复合物探针。因此在本发明的一个实施方案中,提供的颗粒复合物探针包含具有寡核苷酸与其结合的颗粒,DNA条形码,和具有与其结合的特定靶分析物的特异性结合补体的寡核苷酸,其中(i)DNA条形码具有至少两个部分的序列;(ii)附着到颗粒上的至少一些寡核苷酸具有与DNA条形码的第一部分互补的序列;(iii)具有与其结合的特异性结合补体的寡核苷酸具有与DNA条形码的第二部分互补的序列;和(iv)每种类型的颗粒复合物探针中的DNA条形码具有不同且用作特定靶分析物标识符的序列。
在本发明的另一实施方案中,提供了一种颗粒复合物探针,它包含具有至少两种类型的寡核苷酸与其结合的颗粒,DNA条形码,和具有与其结合的靶分析物的特异性结合补体的寡核苷酸,其中与探针结合的第一类型的寡核苷酸具有与DNA条形码至少一部分互补的序列,与探针结合的第二种类型的寡核苷酸具有一个这样的序列,即它与具有特异性结合补体的寡核苷酸序列的至少一部分互补。
在本发明的另一实施方案中,提供了一种颗粒复合物探针,它包含具有寡核苷酸与其结合的颗粒,DNA条形码,和靶分析物的特异性结合补体,其中与颗粒结合的寡核苷酸的至少一部分具有与DNA条形码序列的至少一部分互补的序列且其中该DNA条形码用作特定靶分析物的标识符。
在本发明的另一实施方案中,提供了一种检测探针,它包含纳米颗粒;与纳米颗粒结合的特异性结合对的一个成员;与纳米颗粒结合的至少一个类型的寡核苷酸;和分别具有预定序列的至少一个类型的DNA条形码,其中每种类型的DNA条形码与至少一种类型寡核苷酸的至少一部分杂交。
在本发明的另一实施方案中,提供了含有上述颗粒复合物探针的试剂盒。
本发明的这些和其它实施方案按下面的详细描述将会变得显而易见。
附图简述
图1显示了基于DNA/Au纳米颗粒的蛋白质检测方案。(A)半抗原修饰的纳米颗粒探针的制备。(B)使用蛋白质结合的探针的蛋白质检测。注意在序列A中有9个G,C对,在序列B中仅有2个G,C对。
图2显示了由DNA和蛋白质连接的Au纳米颗粒聚集物的热变性图。监测260nm下的消光(extinction)作为温度递增的函数(1℃/分,1分钟持续时间)。在恒定搅拌以悬浮聚集物的条件下测量各UV-Vis光谱。进行解链分析前将所有聚集物悬浮于1ml的0.3M PBS中。A)存在具有一种靶抗体的两种探针(IgE(-),IgG1(---));所有数据经过正态化;(B)存在同时具有两种靶抗体的两种探针。插图:热变性曲线的第一导数(first derivative)。
图3显示了使用DNA作为蛋白质的生物条形码的基于阵列的蛋白质检测方案。
图4显示了DNA生物条形码的扫描测量(scanometric)DNA阵列检测法。左列是与IgG1相连的生物条形码的检测,右列是与IgE相连的生物条形码的检测。IgG1系统的捕捉寡核苷酸是5′-巯基修饰的ataactagaacttga(SEQ IDNO:1),IgE系统为5′-巯基修饰的ttatctattatt(SEQ ID NO:2)。各点直径大约为250um且用Epson Expression 1640XL平板扫描器(Epson America,Longbeach,California)通过灰度-等级(gray-scale)阅读。试验了这些测定法且在20nM到700nM的靶浓度范围内效果相当好。
图5显示了通用类型的基于免疫-PCR的分析物检测法。
图6描述了使用条形码PCR(BPCR)方案检测靶分析物,即前列腺特异性抗原(PSA)。A组显示了探针的设计和制备。B组显示了PSA检测和条形码DNA扩增及鉴定。
图7显示了评价引物二聚体形成,DNA条形码扩增的对照实验,和使用25个热循环时DMSO浓度递增的影响。泳道1至5是PCR反应混合物中存在DNA条形码的结果,而泳道6至10中无DNA条形码。注意从泳道1至5和从6至10 DMSO增加(以0.5%的增量从0到2%)。
图8显示了PSA检测后PCR扩增的条形码DNA的凝胶电泳照片和相对带强度图形。A组,泳道1和2是对照实验(泳道1:背景蛋白抗-二硝基苯(anti-dinitrophenyl)和β-半乳糖苷酶,无PSA,泳道2:无蛋白质)。从泳道3至8,样品中的PSA浓度(1Oμl)分别为300aM,3fM,30fM,300fM,3pM,和30pM。PSA的标准生物条形码DNA 40-聚体在泳道9中电泳与PCR后的其它凝胶带进行比较。B组,BPCR后的相对凝胶电泳带强度。C组,PSA的低浓度检测。从泳道2(3aM)至泳道7(300fM)以10倍稀释浓度从3aM到300fM。仅含背景蛋白的阴性对照在泳道1中显示,标准生物条形码40聚体(6μM生物条形码双螺旋)在第一条泳道(泳道C)中显示。D组,BPCR后的相对凝胶电泳带强度。
图9显示了PSA-特异性条形码DNA的扫描测量检测。PSA浓度(10ml样品体积)从300fM到3aM之间变动且显示了未加入PSA的阴性对照样品(对照)。在所有7个样品中,加入2ml抗-二硝基苯(10pM)和2mlβ-半乳糖苷酶(10pM)作为背景蛋白。还显示了用30nm NP探针无PCR检测PSA(30aM和对照)(插图)。用Verigene ID系统拍摄芯片。
图10显示了BPCR的理论检测极限。左组,凝胶照片显示了起始条形码DNA浓度递减时PCR后的带。泳道1:3×109拷贝,泳道2:3×108拷贝,泳道3:3×107拷贝,泳道4:3×106拷贝,泳道5:3×105拷贝,泳道6:3×104拷贝,泳道7:3×103拷贝,泳道8:3×102拷贝,泳道9:3×101拷贝,和泳道10:无条形码DNA。右组,相对凝胶电泳带强度图形。
图11显示了PSA-特异性条形码DNA的检测,其中PSA溶于复合羊血清培养基中。各组显示了各种浓度的分析物(3pM至3aM)通过BPCR扩增条形码DNA产生的信号。
图12显示了用30nm NP探针无PCR检测PSA。每组和柱形图上的相关相对强度值显示了在各种浓度(30aM至3pM,和对照)下通过直接检测条形码DNA(即,无-BPCR扩增)产生的信号。用Verigene ID系统(Nanosphere,Inc.,Northbrook,IL)拍摄芯片。
图13显示了DNA-BCA测定法。A.纳米颗粒和磁性微颗粒探针的制备。B.基于纳米颗粒的无PCR DNA扩增方案。
图14显示了用Verigene ID系统进行扩增的炭疽条形码DNA检测。A.用20nm NP探针进行炭疽条形码DNA检测。B.用30nm NP探针进行炭疽条形码DNA检测。
图15显示了20nm和30nm NP探针银染增强后条形码DNA和NP探针夹心斑点的强度图形。
图16显示了“通用”纳米颗粒探针检测方案的一个实施方案。A.合成对一个或多个靶核酸序列具有特异性的通用探针。靶识别DNA可用于控制该探针对靶的特异性。该探针可用于在给定待测溶液中存在单一或多种靶核酸序列的测定系统中。B.通用探针可与结合到诸如磁性微颗粒或玻璃片的基质上的第二种类型的识别寡核苷酸结合使用。混合第二种类型的识别寡核苷酸,通用探针,和认为含有靶核酸的待测溶液并在允许杂交和形成复合物的条件下反应。分离该复合物与未反应的通用探针和待测溶液成份,检测报道寡核苷酸。
图17显示了通用纳米颗粒探针的另一实施方案,包含树突体探针,扩增的树突体探针,和树突体-纳米颗粒杂交探针。第一种类型的树突体探针包含识别寡核苷酸序列和与诸如条形码DNA的报道寡核苷酸互补的核酸序列。在第一种类型的树突体探针上的识别寡核苷酸序列可与第二种类型的树突体探针杂交。在杂交条件下,产生可按需要伸展的树突体探针复合物(或矩阵(matrix))。第二种类型的树突体探针可与多种树突体探针结合并起到扩增整体矩阵内所含的报道寡核苷酸量的作用。同样,可增加或减少第一种类型的树突体上存在的识别寡核苷酸的量,以便提供与第二种类型的树突体复合的更多位点,或者提供更多的报道寡核苷酸。第一种或第二种类型的树突体探针可与诸如金纳米颗粒探针或磁性颗粒探针的其它颗粒探针一起使用以便产生具体测定法所需的杂交探针复合物(或矩阵)系统。
图18显示了基于荧光团的生物条形码扩增测定法。各聚苯乙烯探针的条形码DNA为大约1.1×105且总测定时间为大约50分钟。
图19显示了前列腺特异性抗原(PSA)(10μL样品)的荧光信号(Alexa-647)。灵敏度为大约30aM PSA。测微荧光计测量池(50μL容量)用于Alexa-647。
图20显示了本发举例性测定法的示意图,其中金纳米颗粒探针表面的探针链也代表报道分子。作为mRNA特异性靶序列探针的巯基化寡核苷酸双链和报道分子通过共价键固定在金纳米颗粒表面。如图所示,靠近金纳米颗粒表面的小球代表用于荧光阅读的荧光团或可用于扫描测量金纳米颗粒标记的“通用”DNA序列。
图21显示了检测模拟(mock)mRNA靶的示意图。探针如图20所示。使用荧光阅读检测对待测mRNA靶特异性的DTT-释放的荧光标记探针。
图22显示了复合检测许多核酸靶的示意图,其中它们在高密度微阵列上被分类,随后使用任何标准方法阅读。重要的是,小球可代表荧光阅读方法或代表可使用“通用”金纳米颗粒探针在扫描测量技术中探测的通用捕捉序列。
图23显示了按图20所示检测模拟mRNA序列后荧光测量检测释放的荧光标记探针链。6pM荧光4检测极限与根据Alexa 488的大约1nM的荧光检测极限使用13nm探针每次检测事件释放大约100个荧光标记的报道分子可能达到的极限一样低。
发明详述
本文使用的具有寡核苷酸与其附着的纳米颗粒,偶连物,颗粒,乳液微球体,等的“类型”是指许多该项具有相同类型的寡核苷酸与其附着。“具有寡核苷酸与其附着的纳米颗粒”或“具有寡核苷酸与其附着的纳米颗粒”有时也称为“纳米颗粒-寡核苷酸连接物”或,在本发明的检测方法中,称为“纳米颗粒寡核苷酸探针”,“纳米颗粒探针”或仅称为“探针”。
本文使用的术语“颗粒”是指优选可由金属,二氧化硅,氧化硅,或聚苯乙烯组成的物质的小块。“颗粒”可以是任何性状,例如球形或杆状。本文使用的术语“颗粒”特别包括下文定义和描述的纳米颗粒和微粒。
本发明使用的“条形码”,“生化条形码”,“生物条形码”,“条形码DNA”,“DNA条形码”,“报道条形码”,“报道条形码DNA”,等都可互换且具有相同的含义。DNA条形码可以是核酸,例如脱氧核酸或核糖核酸。优选的是,DNA条形码是预定序列的寡核苷酸。如果需要,该DNA条形码可用例如,生物素,放射性标记,或荧光标记进行标记。
术语“纳米颗粒复合物”或“纳米颗粒复合物探针”是指由纳米颗粒-寡核苷酸连接物,报道寡核苷酸,和具有靶分析物的特异性结合补体与其结合的寡核苷酸组成的连接物。
术语“分析物”或“靶分析物”是指待测化合物或组份,包括药物,代谢产物,杀虫剂,污染物,等等。分析物可由特异性结合对(sbp)的一个成员组成且可以是单价(单表位)或多价(多表位)的配体,优选是抗原或半抗原,且可以是单一化合物或具有至少一个共同表位或决定簇位点的多种化合物。分析物可以是诸如细菌的细胞的一部分或者是携带诸如A,B,D,等血型抗原或HLA抗原的细胞,或者是微生物,例如,细菌,真菌,原生动物,或病毒。如果该分析物为单表位,可通过例如,化学方式,进一步修饰该分析物以提供一个或多个另外的结合位点。在本发明的实践中,该分析物具有至少两个结合位点。
多价配体分析物一般是较大的有机化合物,通常具有聚合物的特性,例如多肽和蛋白质,多糖,核酸,及其组合物。该组合物包括细菌,病毒,染色体,基因,线粒体,细胞核,细胞膜等的成份。
在最大程度上,本发明可应用的多表位配体分析物具有至少大约5,000的分子量,更常见的是至少大约10,000。在聚合物分子分类中,感兴趣的聚合物一般是从大约5,000到5,000,000的分子量,更常见的是从大约20,000到1,000,000的分子量;在感兴趣的激素中,分子量范围一般从大约5,000到60,000分子量。
许多类型的蛋白质可认为属于具有相似结构特征的蛋白质家族,具有特定生物学功能的蛋白质,与特定微生物,特别是致病微生物相关的蛋白质,等。该蛋白质包括,例如,免疫球蛋白,细胞因子,酶,激素,癌抗原,营养标记,组织特异性抗原,等。
本发明的蛋白质类型,凝血因子,蛋白质激素,抗原性多糖,微生物和感兴趣的其它病原体在美国专利号4,650,770中具体公开,本文以其整体引用该公开内容以供参考。
单表位配体分析物一般从大约100到2,000的分子量,更常见的是从125到1,000的分子量。
该分析物可以是在诸如宿主体液的样品中直接发现的分子。该样品可直接检查或者可预处理以导致该分析物更易于检测。另外,通过检测仅当样品中存在感兴趣的分析物时可检测到其存在的,可证实感兴趣的分析物的试剂,例如,与感兴趣的分析物互补的特异性结合对成员,可测定该感兴趣的分析物。因此,可证实该分析物的试剂变成在试验中检测的分析物。体液可以是,例如,尿,血液,血浆,血清,唾液,精液,粪便,痰,脑脊液,眼泪,粘液,等等。
术语“特异性结合对(sbp)成员”是指与另一分子的特定空间和/或极性结构特异性结合且可定义为互补的两个不同分子之一。特异性结合对的成员可称为配体和受体(抗配体蛋白(antiligand))。它们通常是诸如抗原-抗体的免疫对成员,尽管其它特异性结合对,例如生物素-抗生物素蛋白,酶-底物,酶-拮抗剂,酶-促效剂,药物-靶分子,激素-激素受体,核酸双螺旋,IgG-蛋白质A/蛋白质G,诸如DNA-DNA,DNA-RNA的多核苷酸对,蛋白质-DNA,脂类-DNA,脂类-蛋白质,多糖-脂类,蛋白质-多糖,核酸的抗体核酸和相关靶配体(例如,小有机化合物,核酸,蛋白质,肽,病毒,细胞,等),和类似物不是免疫对,但是它们也包括在本发明中且属于sbp成员的定义。特异性结合对的一个成员可以是完整分子,或者仅是该分子的一部分,只要该成员可特异性结合靶分析物的结合位点以形成特异性结合对。
术语“配体”是指其受体天然存在或可以制备的任何有机化合物。术语配体也包括配体类似物,它是修饰的配体,通常是有机自由基或分析物类似物,通常具有超过100的分子量,它与相似配体竞争受体,该修饰提供了连接配体类似物与另一分子的手段。该配体类似物通常与配体的区别在于至少用连接该配体类似物与hub或标记的键取代氢,但也不必如此。配体类似物可按与配体相似的方式与受体结合。该类似物可以是,例如,抗配体的独特型抗体的抗体。
术语“受体”或“抗配体蛋白”是指能够识别分子的特定空间和极性结构,例如表位或决定簇位点的任何化合物或组合物。举例性的受体包括天然存在的受体,例如,甲状腺素结合的球蛋白,抗体,酶,Fab片断,凝集素,核酸,核酸的抗体核酸,抗生物素蛋白,蛋白质A,芽孢杆菌RNA酶抑制剂(barstar),补体成份Clq,等等。抗生物素蛋白试图包括卵白抗生物素蛋白和其它来源的生物素结合蛋白,例如链霉抗生物素蛋白。
术语“特异性结合”是指两个不同分子之一对另一分子的特异性识别,相比之下其它分子基本上不能识别。一般来说,该分子在其表面或空穴中具有引起两个分子之间特异性识别的区域。特异性结合的例子是抗体-抗原相互作用,酶-底物相互作用,多核苷酸相互作用,等等。
术语“非特异性结合”是指具有相对独立的特异性表面结构的分子之间的结合。非特异性结合可由包括分子间的疏水相互作用的一些因素产生。
术语“抗体”是指与另一分子的特定空间和极性结构特异性结合且因此定义为互补的免疫球蛋白。抗体可以是单克隆或多克隆抗体且可通过本领域熟知的技术来制备,例如免疫宿主并收集血清(多克隆抗体)或者通过制备连续杂交细胞系并收集分泌蛋白(单克隆抗体),或者通过克隆和表达至少编码天然抗体特异性结合所需的氨基酸序列的核苷酸序列或其诱变型来制备。抗体可包括完整免疫球蛋白或其片断,该免疫球蛋白包括各种类型和同种型,例如IgA,IgD,IgE,IgG1,IgG2a,IgG2b和IgG3,IgM,等。其片断可包括Fab,Fv和F(ab′)2,Fab′,等等。另外,如果合适可使用免疫球蛋白或其片断的聚集体,聚合物,和连接物,只要它能维持对特定分子的结合亲和力。
在某些实施方案中,本发明提供了一种新检测试剂,它含有合适大小的报道颗粒,该颗粒可被衍生化以便在其表面包含某一数目的特异性结合预选靶化学种类的选择性结合分子和大量拷贝的预选报道分子。该报道分子使用标准化学过程共价附着到报道颗粒的表面。
使用该放大材料的优选检测方法与夹心免疫测定法所用的方法相似。具体地说,将待分析的样品与能够选择性和特异性结合感兴趣的种类的捕捉相接触,该捕捉相固定在不溶性材料上。然后通过标准方法将未结合的物质与固定的分析物分离。然后将固定的分析物与本发明的检测试剂接触。该检测试剂通过掺入其上的选择性结合分子与固定的分析物结合。由此形成的“夹心”结构(不溶性基质-分析物-检测试剂)因此将检测试剂有效固定在不溶性基质上。通过标准方法将未结合的检测试剂与该固定的结构分离。通过对固定的不溶性基质-分析物-检测试剂夹心产物进行处理破坏报道分子与报道颗粒之间的键,导致报道分子释放进介质中可进行放大。由于可形成比制备该检测试剂期间更大的开始结合到报道颗粒上的报道分子与选择性结合分子的数目比率,因此从该颗粒释放的报道分子导致进入介质中的报道分子比结合到不溶性基质上靶分析物分子更多。使用适合于该报道分子化学性质的任何方法可对释放的报道分子进行检测,和任选进行定量。各靶分析物分子检测中的报道分子检测信号的明显放大产生了一个非常灵敏,可靠和合适的化学检测测定法。
在某些实施方案中,本发明的检测试剂由经过衍生化在其表面包含与靶化学品或靶分析物特异性结合的选择性结合分子和许多预选报道分子的合适大小的报道颗粒组成。该报道颗粒可以是与含有靶分析物的样品相容且能够结合该选择性结合分子和报道分子的任何材料。合适的报道颗粒的例子包括,但不限于,金属,二氧化硅,氧化硅,和聚苯乙烯。
该选择性结合化合物可以是能够选择性识别靶分析物并与其结合而不干扰靶分析物与捕捉相之间结合的任何化合物。合适的选择性结合化合物的例子包括,但不限于,抗体,酶,蛋白质,寡核苷酸和无机化合物。
选择报道颗粒的功能性大小一般具有纳米到微米范围的直径。由于开始结合到报道颗粒上的报道分子与选择性结合分子数目的比率可形成比在本发明的检测试剂制备期间的更大,因此从该颗粒释放报道分子导致进入介质中的报道分子比结合到报道颗粒上的分析物分子更多。该比率形成了靶分析物分子检测中的信号放大系数。例如,与一个固定分析物分子结合的携带1000拷贝报道分子的一个报道颗粒释放报道分子导致在原始夹心产物中对于每个分析物分子在介质中出现1000个报道分子。这导致该化学信号代表放大系数为1000的靶分析物。在合成检测试剂期间通过控制诸如报道颗粒表面积和报道颗粒表面上选择性结合分子和报道分子之间的比率和包装密度的参数可调节该放大系数。因此,报道颗粒的大小决定了可释放的报道分子数目,和对于标记的靶分子获得的最终放大系数。例如,13nm金颗粒可携带多达200个硫醇化表面寡聚体用作报道分子,从而实现在检测测定法形成的夹心物中200个报道分子比单个报道颗粒结合的单个靶分子的放大系数。更大尺寸(例如,微米大小)的颗粒显然可产生更大的放大系数。
报道分子优选通过足够牢固的方式附着到报道颗粒的表面以防止在检测方法步骤中该报道分子明显非特异性释放但同时在检测步骤之前容易立即分离和释放该报道分子。优选的是,该报道分子通过这样的共价键附着在报道颗粒的表面,即当与在检测步骤前立即加入固体支持物中的特异性试剂接触时可断裂该共价键。在该实施方案中,共价键用于将报道分子锚定在报道颗粒上,用于从报道颗粒释放报道分子的化学试剂是通过优先与该报道颗粒结合,或反应同时取代该报道分子可有效代替报道颗粒表面报道分子的分子。
该报道分子的例子可包括,但不限于,荧光团,发色团,含有或不含附着荧光团或发色团的寡核苷酸,包括酶和卟啉的蛋白质,脂类,糖类,合成多聚体和诸如同位素或放射性标记的标记物。这些化学试剂可与报道颗粒通过诸如硫醇,二硫化物,磷酰基硫醇等的硫原子之间的共价键连接。在这种情况下,将报道颗粒与通过优先结合共价键中的硫原子可取代报道分子的化学试剂接触可释放报道分子用于随后的检测。可有效取代报道分子的化学试剂包括通过诸如其它硫醇或含二硫化物的分子,二硫苏糖醇(DTT),二硫赤蘚糖醇(DTE),巯基乙醇等的硫醇键优先与报道颗粒结合的任何分子。同样,诸如氢硼化钠的还原剂可裂解二硫键释放该报道分子。
在本发明的一个具体实施方案中,该报道分子和选择性结合化合物是相同的化学实体。例如,在一个优先的实施方案中,该报道分子和选择性结合化合物描述为与靶分析物互补的单一寡核苷酸且在从报道颗粒去掉后还可以检测到(例如通过该寡核苷酸上存在的荧光标记)。
在本发明的检测方法的第一个步骤中,需要分析靶分子存在的样品与能够选择性和特异性结合感兴趣的靶类型的诸如抗体,寡核苷酸,凝集素或类似物质的捕捉相接触。该捕捉相固定在与测定化学过程相容且容易从反应介质中分离的不溶性材料上。构建该固定捕捉相使得它特异性结合,捕捉和固定感兴趣的分析物,但优选不会结合样品中存在的任何其它物质。适用于本发明方法的不溶性材料的例子包括,但不限于,微量滴定板孔,微粒,纤维或膜滤器,或其它该不溶性材料。
优选选择该捕捉相使其与分析物上不同于检测试剂的选择性结合分子组件的决定簇结合。然后通过任何合适的方法,包括例如,倾析,沉淀,洗涤,离心或联合这些方法将任何未结合的物质与固定的靶分析物分离。该过程的最终结果是感兴趣的分析物在不溶性材料表面以纯化和浓缩状态存在。
在本发明方法的随后步骤中,将固定的靶分析物与含有结合了报道分子的报道颗粒和至少一个选择性结合分子的本发明的检测试剂接触。该选择性结合分子与靶分析物特异性结合形成“夹心”结构,该结构包括与靶分析物结合的不溶性基质,而该靶分析物又结合到该检测试剂上。该夹心结构可将检测试剂有效固定在不溶性基质上,通过上述任何合适的方法,例如,倾析,沉淀,洗涤,离心或联合这些方法将任何未结合的检测试剂与该固定结构分离。
在该方法的另一步骤中,通过将固定的不溶性基质-靶分析物-检测试剂夹心结构与含有可从报道颗粒释放报道分子的化学试剂的介质接触可放大靶分析物的结合和检测产生的信号。然后如上文的详细描述,释放的报道分子进入与靶分析物结合的检测试剂周围的介质中。
可使用适合于报道分子化学特性的任何方法分析含有释放的报道分子的介质中存在的释放报道分子。例如,通过测量介质中的荧光强度或荧光消偏可检测且甚至可定量荧光标记的报道分子,而通过测量在加入合适的触发剂时出现的发光可测定存在的化学发光标记的报道分子。基于寡核苷酸的报道分子可通过聚合酶链式反应进一步扩增或被固定在不溶性基质上的互补寡核苷酸捕捉并使用通常与基于核酸的微阵列联合使用的方法检测和定量。也可使用许多其它的选择,包括电化学,阻抗,酶和放射性检测。
因此,在某些实施方案中,本发明提供了检测样品中存在的一种或多种靶分析物的方法,样品中的各靶分析物具有与特异性结合补体发生特异性结合相互作用的至少两个结合位点,该方法包括步骤:
a)提供至少一种类型的捕捉基质,该捕捉基质具有与其结合的与特异性靶分析物的至少第一结合位点结合的该特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体;
b)提供至少一种类型的微粒检测探针,该微粒检测探针包含具有下列成份与其结合的微粒:(i)特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体和(ii)多个DNA条形码,该DNA条形码任选用报道标记进行标记,其中与微粒检测探针结合的特异性结合补体与该靶分析物的至少一个第二结合位点结合;
c)将捕捉基质与相信含有靶分析物的样品在允许特异性靶分析物与结合到捕捉基质上的特异性结合补体结合的有效条件下接触以便将该靶分析物固定到捕捉基质上;
d)将固定的靶分析物与至少一种类型的微粒检测探针在允许靶分析物与结合到微粒检测探针上的该分析物的特异性结合补体之间结合并在存在靶分析物时在捕捉基质上形成复合物的有效条件下进行接触;
e)任选分离和洗涤捕捉基质以去掉未结合的微粒检测探针;和
f)检测DNA条形码的存在,其中存在该DNA条形码表示样品中存在特异性靶分析物。
在其它实施方案中,本发明提供了检测样品中存在的一种或多种靶分析物的方法,样品中的各靶分析物具有与特异性结合补体发生特异性结合相互作用的至少两个结合位点,该方法包括步骤:
a)提供至少一种类型的磁性基质,该磁性基质具有与其结合的与特异性靶分析物的至少第一结合位点结合的特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体;
b)提供至少一种类型的微粒检测探针,该微粒检测探针包含具有下列成份与其结合的微粒:(i)特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体和(ii)多个DNA条形码,该DNA条形码用荧光标记,其中与微粒检测探针结合的特异性结合补体与该靶分析物的至少一个第二结合位点结合;
c)将磁性基质与相信含有靶分析物的样品在允许特异性靶分析物与结合到磁性基质上的特异性结合补体结合的有效条件下接触以便将该靶分析物固定到磁性基质上;
d)将固定的靶分析物与至少一种类型的微粒检测探针在允许靶分析物与结合到微粒检测探针上的该分析物的特异性结合补体之间结合并在存在靶分析物时在磁性基质上形成复合物的有效条件下进行接触;
e)任选分离和洗涤磁性基质以去掉未结合的微粒检测探针;和
f)检测DNA条形码中荧光信号的存在,其中存在荧光信号表示样品中存在特异性靶分析物。
在其它实施方案中,本发明提供了检测样品中存在的一种或多种靶分析物的方法,样品中的各靶分析物具有与特异性结合补体发生特异性结合相互作用的至少两个结合位点,该方法包括步骤:
a)提供至少一种类型的磁性基质,该磁性基质具有与其结合的与特异性靶分析物的至少第一结合位点结合的特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体;
b)提供至少一种类型的微粒检测探针,该微粒检测探针包含具有下列成份与其结合的微粒:(i)特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体和(ii)多个DNA条形码,该DNA条形码用荧光标记,其中与微粒检测探针结合的特异性结合补体与该靶分析物的至少一个第二结合位点结合;
c)将磁性基质与相信含有靶分析物的样品在允许特异性靶分析物与结合到磁性基质上的特异性结合补体结合的有效条件下接触以便将该靶分析物固定到磁性基质上;
d)将固定的靶分析物与至少一种类型的微粒检测探针在允许靶分析物与结合到微粒检测探针上的该分析物的特异性结合补体之间结合并在存在靶分析物时在磁性基质上形成复合物的有效条件下进行接触;
e)任选分离和洗涤磁性基质以去掉未结合的微粒检测探针;
f)在有效释放该DNA条形码的条件下处理该分离的洗涤磁性基质;和
g)检测DNA条形码中荧光信号的存在,其中存在DNA条形码的荧光信号表示样品中存在特异性靶分析物。
在其它实施方案中,本发明提供了检测样品中存在的一种或多种靶分析物的方法,样品中的各靶分析物具有与特异性结合补体发生特异性结合相互作用的至少两个结合位点,该方法包括步骤:
a)提供至少一种类型的磁性基质,该磁性基质具有与其结合的与特异性靶分析物的至少第一结合位点结合的特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体;
b)提供至少一种类型的微粒检测探针,该微粒检测探针包含具有下列成份与其结合的微粒:(i)特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体和(ii)多个DNA条形码,该DNA条形码包含报道标记,其中与微粒检测探针结合的特异性结合补体与该靶分析物的至少一个第二结合位点结合;
c)将磁性基质与相信含有靶分析物的样品在允许特异性靶分析物与结合到磁性基质上的特异性结合补体结合的有效条件下接触以便将该靶分析物固定到磁性基质上;
d)将固定的靶分析物与至少一种类型的微粒检测探针在允许靶分析物与结合到微粒检测探针上的该分析物的特异性结合补体之间结合并在存在靶分析物时在磁性基质上形成复合物的有效条件下进行接触;
e)任选分离和洗涤磁性基质以去掉未结合的微粒检测探针;
f)在有效释放该DNA条形码的条件下处理该分离的洗涤磁性基质;和
g)检测DNA条形码中报道标记的存在,其中存在DNA条形码的报道标记表示样品中存在特异性靶分析物。
在其它实施方案中,本发明提供了检测样品中存在的一种或多种靶分析物的方法,样品中的各靶分析物具有与特异性结合补体发生特异性结合相互作用的至少两个结合位点,该方法包括步骤:
a)提供至少一种类型的捕捉基质,该捕捉基质具有与其结合的与特异性靶分析物的至少第一结合位点结合的特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体;
b)提供至少一种类型的颗粒检测探针,该颗粒检测探针包含具有下列成份与其结合的微粒或纳米颗粒:(i)特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体和(ii)多个DNA条形码,该DNA条形码任选用报道标记进行标记,其中与颗粒检测探针结合的特异性结合补体与该靶分析物的至少一个第二结合位点结合;
c)将捕捉基质与相信含有靶分析物的样品在允许特异性靶分析物与结合到捕捉基质上的特异性结合补体结合的有效条件下接触以便将该靶分析物固定到捕捉基质上;
d)将固定的靶分析物与至少一种类型的颗粒检测探针在允许靶分析物与结合到颗粒检测探针上的该分析物的特异性结合补体之间结合并在存在靶分析物时在捕捉基质上形成复合物的有效条件下进行接触;
e)任选分离和洗涤捕捉基质以去掉未结合的微粒检测探针;
f)通过化学释放剂从该颗粒检测探针释放该DNA条形码;和
g)检测DNA条形码的存在,其中存在DNA条形码表示样品中存在特异性靶分析物。
在某些实施方案中,本发明的方法还可包含在靶分析物固定在其上之后和在将捕捉基质与颗粒检测探针接触之前洗涤捕捉基质的步骤。
靶分析物可以是蛋白质或半抗原,其特异性结合补体可以是包含单克隆或多克隆抗体的抗体。靶分析物也可以是核酸分子。
微粒可用多个DNA条形码标记。
在其它实施方案中,本发明的方法可在所述的检测步骤之前和所述的分离和洗涤步骤之后包含这样的步骤:在从微粒检测探针释放DNA条形码的有效条件下处理该复合物;和任选在所述的检测之前扩增该DNA条形码。
在所述的检测之前将释放的DNA条形码固定在基质上。
DNA条形码可直接结合到微粒上或可通过任何连接分子结合到微粒上。该微粒还可包含与其结合的寡核苷酸且该DNA条形码可与结合到微粒上的寡核苷酸的至少一部分杂交。
本发明方法中所用的微粒可以是聚合物(例如聚苯乙烯),玻璃,金属,半导体,或陶瓷。
特异性结合对可以是,例如,抗体和抗原;受体和配体;酶和竞争性抑制剂;药物和靶分子;或两条至少部分互补的寡核苷酸链。
在某些实施方案中,DNA条形码是生物素标记的,放射性标记的,或荧光标记的。
靶分析物可具有超过2个结合位点。在某些情况下,除了其第一结合位点外,靶分析物可修饰成包含第二结合位点。
在一些实施方案中,本发明的方法提供了至少两种类型的微粒检测探针,第一种类型的探针具有靶分析物上第一结合位点的特异性结合补体,第二种类型的探针在该探针上具有第二结合位点的特异性结合补体。
在某些情况下,提供了多个微粒检测探针,每种类型的探针具有靶分析物上不同结合位点的特异性结合补体。
特异性结合补体和靶分析物可以是特异性结合对的成员。“特异性结合对的成员”可包含核酸,寡核苷酸,肽核酸,多肽,抗体,抗原,糖类,蛋白质,肽,氨基酸,激素,类固醇,维生素,药物,病毒,多糖,脂类,脂多糖,糖蛋白,脂蛋白,核蛋白,寡核苷酸,抗体,免疫球蛋白,白蛋白,血红蛋白,凝血因子,肽和蛋白质激素,非肽类激素,白介素,干扰素,细胞因子,包含肿瘤特异性表位的肽,细胞,细胞表面分子,微生物,微生物的碎片,部分,组份,或产物,小有机分子,核酸和寡核苷酸,任何上述物质的代谢产物或抗体。核酸和寡核苷酸包括基因,病毒RNA和DNA,细菌DNA,真菌DNA,哺乳动物DNA,cDNA,mRNA,RNA和DNA片断,寡核苷酸,合成寡核苷酸,修饰的寡核苷酸,单链和双链核酸,天然和合成核酸。
下面是靶分析物:特异性结合补体的非限制性例子。靶分析物可以是核酸且特异性结合补体可以是寡核苷酸。靶分析物可以是蛋白质或半抗原且特异性结合补体可以是包含单克隆或多克隆抗体的抗体。靶分析物是来自基因组DNA样品的序列且特异性结合补体可以是寡核苷酸,该寡核苷酸具有与该基因组序列的至少一部分互补的序列。基因组DNA可以是真核,细菌,真菌或病毒DNA。靶分析物是来自游离DNA样品的序列且特异性结合补体可以是寡核苷酸,该寡核苷酸具有与该游离DNA序列的至少一部分互补的序列。特异性结合补体和靶分析物可以是抗体-配体对的成员。
“捕捉基质”可以是按上文和本说明书全文所述分析物可固定在其上的任何不溶性材料。本文使用的“捕捉基质”可从样品中捕捉靶分析物,且帮助从样品中分离这些捕捉的靶分析物(在用检测探针处理之前和之后)。该基质相对于该分析物一般形体更大且优选不溶于样品。在特定情况下,本发明的方法包含使用本文所述的磁性基质,通过用磁场处理该磁性基质可分离该磁性基质。
本发明方法中的其它分离步骤可包括本领域的技术人员已知的任何分离方法。例如,分离方法包括,但不限于,过滤,沉淀,浮集,流体力学,或梯度方法。过滤步骤可包括,例如,去掉不包含DNA条形码的样品成份的膜。
按上文和本说明书别处所述通过破坏条形码与表面结合的化学释放剂可将DNA条形码从其附着的微粒上释放出来。本文所述的该试剂包括,但不限于,通过诸如其它硫醇或含二硫化物的分子,二硫苏糖醇(DTT),二硫赤蘚糖醇(DTE),巯基乙醇等的硫醇键优先与微粒结合的任何分子,和可裂解二硫键从而将DNA条形码从其附着的微粒上释放出来的诸如氢硼化钠的还原剂。
DNA条形码也可通过在该DNA条形码从寡核苷酸上去杂交的条件下处理该条形码从微粒上释放出来,其中该条形码通过该寡核苷酸附着到微粒上。
如本文所述,条形码可用可检测的报道基团标记。合适的报道基团包括,但不限于,荧光团,发色团,氧化还原活性基团,具有电标记的基团,放射性基团,催化基团,或拉曼(Raman)标记。
拉曼标记可以是具有不同拉曼散射光谱的许多分子中的任一种。不同于酶免疫测定法中所用的酶,这些标记类型可以是稳定,简单,便宜的分子,可按需要对其进行化学修饰。下列属性增强了该标记在该应用中的效力:(a)在激光激发波长附近有一个强吸收带(消光系数接近104);(b)有一个能够共价连接到特异性结合成员上的官能团;(c)耐光性;(d)具有足够的表面和共振增强,允许检测亚纳克范围的分析物;(e)标记与非标记的特异性结合成员之间的结合相互作用干扰最小;(f)在所用的激发波长下出现最少的强荧光发射;(g)具有少数高峰的相对简单的散射形式;和/或(h)标记具有不互相干扰的散射形式,因此可同时分析几个指示剂分子。
下面列出了这些拉曼活性标记的一些,但不是全部潜在的候选物:4-(4-氨基苯偶氮)苯胂酸一钠盐,偶氮胂I,碱性品红,芝加哥天蓝,刚果红81,分散橙3,HABA(2-(4-羟基苯偶氮)-苯甲酸),藻红B,台盼蓝,丽春红S,丽春红SS,1,5-二氟-2,4-二硝基苯,甲酚紫和p-二甲胺基偶氮苯。选择的标记可与感兴趣的特异性结合成员共价连接或附着或与其相联。
本发明的一个重要方面是可将多个拉曼标记结合到颗粒上以提供索引不同颗粒的多编码拉曼标记。因此,本发明包括一种试剂,它具有多种拉曼染料和与颗粒结合的特异性结合物质,例如DNA,RNA,抗体,抗原,小分子。对于基于颗粒的检测探针,该拉曼标记或染料可直接或间接附着到该颗粒上。该拉曼标记可用与诸如金属纳米颗粒的颗粒表面结合的一个官能团,例如,巯基,胺,或膦进行修饰。如果需要,该拉曼染料可用诸如寡核苷酸(例如,多聚腺苷,多聚胸苷)的分子进一步功能化以增强纳米颗粒稳定性或用特异性结合对成员(例如具有与核酸靶的至少一部分互补的序列的寡核苷酸或特定配体的受体)功能化。作为选择,该拉曼标记可与携带与颗粒结合的官能团的分子或任何接头,例如,polyA或polyT寡核苷酸连接。拉曼标记可按例如,作为参考文献引用的2003年5月7日申请的美国专利申请号10/431,341所述进行检测。
本文提供的实施例1-10证实了在临床标本,环境样品,工业处理废水,或可能含有靶分析物的其它该介质中同时检测和任选定量极低浓度的许多不同靶分析物的能力。实施例11和12证实了以类似于较高浓度更迅速地检测少数不同靶分析物的能力。具体地说,实施例11和12提供了对实施例1-10提供和描述的方法的修饰,它允许将该方法用于要求较低的应用而保留了该方法的灵敏度优势。该修饰也有利于其它检测技术的使用。
要求较低的应用的一个例子需要同时检测只有少数,一般是1到10个之间的靶分析物而不是实施例1-10所述方法范围内的10到几百个。在这种情况下,实施例11和12根据附着到检测探针寡核苷酸上的荧光标记的发射波长可方便地区分和鉴定靶分析物而不是按实施例1-10所述在检测前回收和分离该寡核苷酸。另外,本文所述的方法允许根据本发明的具体目标用途对底物,靶抗原和检测探针之间形成的三重夹心复合物,或在溶液中直接进行检测步骤。这些方法还可引申为效法实施例1-10所述的寡核苷酸回收和分离,但是以更快和更简单的方式。
本发明的方法需要靶具有互不相同的至少第一和第二特征且允许将该靶分析物与含有该靶分析物的介质中存在的所有其它物质区分开来。为了举例说明,假定该靶分析物是蛋白质且不同特征是不同表位,每个表位可被相应抗体选择性结合。然而,在这些改良方法的实践中可按相同方式使用本文所述的任一类型的特征和互补的化学结合分子,下文也称为特异性结合补体和结合对成员。如果需要检测该介质中存在的多个靶分析物,一个优选的安排是鉴定可能存在的任一靶分析物的这对区别特征与鉴定在相同介质中可能存在的所有其它靶分析物的区别特征对不同。另外,一个区别特征对于可能存在的所有靶分析物可以是相同的,而第二区别特征是每种类型的靶分析物所特有的。在任一情况下,需要在该介质中可能存在的其它物质都没有与靶分析物相关的任一区别特征。
另外,本发明的方法使用了一种基质,相应于各靶分析物上第一特征的互补化学结合分子附着于其上。在本文所述的某些方法中,对于每个靶分析物提供了一种分离的基质,它携带与靶分析物第一特征结合的互补化学结合分子。本发明还提供了允许使用其它基质结构的方法。在一种该结构中,相应于各靶分析物第一特征的互补化学结合分子结合到相同基质上。在另一该结构中,相应于各靶分析物第一特征的互补化学结合分子以这样的方式结合到相同基质上,即该方式使得相应于一个靶分析物的互补化学结合分子与相应于其它靶分析物的互补化学结合分子定位于基质的不同空间区域上。这些可供选择的结构在本发明的一些用途和实施中是有益的。
在本发明方法中使用的该基质有三个主要目的。一个目的是提供一种表面,可将靶分析物选择性固定在其上而介质中不是靶分析物的物质不会这样固定。通过将相应于靶分析物第一特征的互补化学结合分子附着到基质表面且允许靶分析物与互补化学结合分子结合从而固定在基质的表面可实现这点。第二个目的是便于将固定在基质表面的靶分析物与介质分离。在本发明的某些实施方案中,该基质可由磁性材料制成,通过使用磁场该磁性材料可与结合在其表面的任何物质一起与介质分离。分离基质与介质的许多其它方法是已知的且同样可使用。两个可能的解释性例子是由比介质密度更大或更小的材料制成且因此,可分别通过沉淀或浮集与介质分离的基质;和足够大使得可通过过滤将它们与介质分离的基质。基质可按本文所述悬浮于介质中。作为选择,本发明的方法可得益于使用显微基质,例如,但不限于显微镜载玻片,其中可形成含有不同互补化学结合分子的空间分离区域。该基质的第三个目的是依靠其结合靶分析物的能力,它导致在该基质表面的靶分析物的局部浓度显著高于介质中靶分析物的浓度。总之,这三个目的有效提高了该分析的灵敏度和特异性且提供了广阔的选择范围,可从中选择本发明的最佳实施方案用于任何特定用途或目的。
本文所述的方法可使用一种检测探针,它包含选择性结合靶分析物第二特征的互补化学结合分子和多个寡核苷酸对附着于其上的直径为大约10至50nM的金纳米颗粒。与任何特定检测探针反应的靶分析物身份可在与金纳米颗粒连接的寡核苷酸碱基序列中编码。编码特定靶分析物身份的寡核苷酸可变地称为该靶分析物的“条形码”或“生物条形码”。
在某些实施方案中,本发明的方法可任选使用诸如下文所述的检测特征以便产生诸如操作简单和结果快速的效果而保留本文所述的使用金纳米颗粒方法的灵敏度。具体地说,球形颗粒的表面积与其直径的平方成比例。一微米直径的球体表面积比例如,3OnM直径颗粒的表面积大接近1100倍。这意味着1微米直径的球形颗粒可比3OnM颗粒多容纳大约1100倍的寡核苷酸,由于本发明中可测量的信号是该寡核苷酸数目的函数,因此使用1微米颗粒构建的检测探针每个结合事件产生的可测量信号预期比从3OnM颗粒获得的信号大接近1100倍。使用更大颗粒产生的该增加的“增益”或“放大”允许极大地简化该分析方法而不损失灵敏度。然而,颗粒的扩散速率,且因此它们移动到与待测靶分析物接触的频率和与存在的任何特定成份的靶分析物完成结合所需的时间与其直径成反比。因此,这些结合事件可用的时间对可以使用的颗粒最大尺寸施加了实际的限制,而该颗粒最大尺寸应仍然满足由任何特定用途或本发明的实施方案所赋予的该时间限制。因此,任何特定用途或实施方案的最佳颗粒大小是通过平衡上述因素来确定的且一般在0.5到5.0微米的范围内。
除了使用1微米(100OnM)聚苯乙烯微粒外,可与前面所述基于3OnM金颗粒的探针同样地构建一种类型的检测探针。当需要同时测定只存在的少数靶分析物时,第二种类型的检测探针特别实用。该第二种类型的检测探针编码的靶分析物的身份在结合到探针颗粒上的寡核苷酸所结合的“可检测实体”的特征中,而不是在该寡核苷酸包含的碱基序列中。在本说明书中,“可检测的实体”可以是,例如,具有由荧光团的发射波长所编码的靶分析物身份的荧光团。其它合适的可检测实体可包括,但不限于放射性同位素,电化学活性类型,拉曼活性类型,化学发光类型,等等。这种类型的检测探针特别适用于以流式细胞术方法的检测和靶分析物的原位检测。第三种类型的检测探针还允许携带可检测实体的该寡核苷酸从微粒上化学裂解以便在溶液中检测。这些改进的检测探针为优化本发明的实施方案用于任何特定用途或目的提供了另外的选择。
本发明涉及利用寡核苷酸作为生化条形码检测样品中的多种分析物的方法。该方法利用以纳米颗粒直接或间接功能化的识别元件(例如,蛋白质或核酸),和导致金纳米颗粒聚集的杂交事件可明显改变其物理特性(例如,光学,电学,力学)的以前观察结果。8-12总体思路是各识别元件可与具有分开且可剪裁的杂交和解链特性的不同寡核苷酸序列(DNA条形码)和一个解链时发生改变的与纳米颗粒相联的物理标记相联来解码多分析物试验中的一系列分析物。因此,可使用DNA连接的聚集物的解链温度和解链时发生改变的与纳米颗粒相联的物理特性来解码多分析物试验中的一系列分析物。本文的条形码与基于物理诊断标记,例如纳米条,23荧光团标记珠,24和量子点25的条形码的区别在于解码信息是储存于预定寡核苷酸序列中的化学信息的形式。
本发明提供了一些应用广泛的方法用于使用以寡核苷酸严重功能化的纳米颗粒探针(优选金纳米颗粒探针),检测样品中的各种生物分子,例如,单一或多种多价蛋白。具体地说检测样品中多种蛋白质的已知方法复杂且通常需要费时而昂贵的测定方法。在这方面,有人最近使用荧光团标记的肽核酸和DNA微阵列来识别溶液中的多种蛋白质靶。15-17然而,该方法依赖于用寡核苷酸标记的蛋白质与微阵列表面的结合。本文所述方法的最后步骤仅仅以普通DNA的表面化学为基础。因此,它可吸收目前发展水平的纳米颗粒DNA检测方法的许多高灵敏性因素,9,11而允许检测诸如蛋白质的各种生物分子,而不是在检测事件期间无蛋白质存在的DNA。对于表面测定,蛋白质一般比短寡核苷酸更难以实施,因为它们倾向于表现出与固体支持物更大的非特异性结合,即通常产生更高的背景信号。最后,对于同质测定,与这些纳米颗粒结构相关的异常急剧的解链图形与表现出正态和宽阔DNA解链行为的探针相比允许设计更多的生物条形码。
本发明涉及使用适合于用于检测试验的具有寡核苷酸与其附着的任何合适颗粒。然而,在实施本发明时,优选微粒和纳米颗粒。该颗粒的大小,形状和化学组成赋予包括DNA条形码的所得探针的特性。这些特性包括光学特性,光电子特性,电化学特性,电子特性,在各种溶液中的稳定性,孔和通道大小变化,充当过滤器时分离生物活性分子的能力,等。预期可使用具有不同大小,形状和/或化学组成的颗粒混合物,以及使用具有统一大小,形状和化学组成的纳米颗粒。合适颗粒的例子包括,但不限于,纳米和微小尺寸的核心颗粒,聚集物颗粒,各向同性(例如球形颗粒)和各向异性颗粒(例如非球形杆,四面体,棱柱)和核心-外壳颗粒,例如以其整体作为参考文献引用的2002年12月28日申请的美国专利申请号10/034,451,和2002年12月28日申请的国际申请号PCT/US01/50825中所述的颗粒。在实施本发明时,检测探针优选在进行实际测定前产生。另外,检测探针可在进行测定时原位产生。
因此,在本发明的一个实施方案中,提供了纳米颗粒连接物探针。用于本发明实践中的纳米颗粒包括金属(例如,金,银,铜和铂),半导体(例如,CdSe,CdS,和用ZnS包裹的CdS或CdSe)和磁性(例如,铁磁性)胶体物质。用于本发明实践中的其它纳米颗粒包括ZnS,ZnO,TiO2,AgI,AgBr,HgI2,PbS,PbSe,ZnTe,CdTe,In2S3,In2Se3,Cd3P2,Cd3As2,InAs,和GaAs。纳米颗粒的大小优选从大约5nm到大约150nm(平均直径),更优选从大约30到大约100nm,最优选从大约40至大约80nm。本发明的微粒的大小优选从大约1μm到大约150μm(平均直径),更优选从大约1μm到大约50μm,最优选大约1μm。用于本发明方法的微粒或纳米颗粒的大小可随其具体用途或应用的需要而变化。大小的变化可有利地用于优化该纳米颗粒的某些物理特性,例如,光学特性或可衍生化的总表面积。纳米颗粒也可以是杆,棱柱,或四面体。
制备金属,半导体和磁性纳米颗粒的方法是本领域熟知的。参见,例如,Schmid,G.(ed.)Clusters and Colloids(VCH,Weinheim,1994);Hayat,M.A.(ed.)Colloidal Gold:Principles,Methods,and Applications(Academic Press,San Diego,1991);Massart,R.,IEEE Taransactions On Magnetics,17,1247(1981);Ahmadi,T.S.等,Science,272,1924(1996);Henglein,A.等,J.Phys.Chem.,99,14129(1995);Curtis,A.C.,等,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,27,1530(1988)。
制备ZnS,ZnO,TiO2,AgI,AgBr,HgI2,PbS,PbSe,ZnTe,CdTe,In2S3,In2Se3,Cd3P2,Cd3As2,InAs,和GaAs纳米颗粒的方法是本领域已知的。参见,例如,Weller,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,32,41(1993);Henglein,Top.Curr.Chem,143,113(1988);Henglein,Chem.Rev.,89,1861(1989);Brus,Appl.Phys.A.53,465(1991);Bahncmann,参见Photochemical Conversion and Storage of Solar Energy(Pelizetti和Schiavello编,1991),第251页;Wang和Herron,J.Phys.Chem.,95,525(1991);Olshavsky等,J.Am.Chem.Soc.,112,9438(1990);Ushida等,J.Phys.Chem.,95,5382(1992)。
合适的纳米颗粒也可从商业途径获得,例如,Ted Pella,Inc.(金),Amersham Corporation(金)和Nanoprobes,Inc.(金)。
目前优选用于检测核酸的是金纳米颗粒。金胶体颗粒对于引发其美丽色彩的光谱带具有高消光系数。这些强烈的色彩随颗粒大小,浓度,颗粒间距离,和聚集程度及聚集物形状(几何学)而改变,使得这些物质对于比色测定法特别有吸引力。例如,附着到金纳米颗粒上的寡核苷酸与寡核苷酸和核酸的杂交引起裸眼可见的直接颜色变化(参见,例如,实施例)。
可功能化纳米颗粒,寡核苷酸或两者以便将寡核苷酸附着到纳米颗粒上。该方法是本领域已知的。例如,用链烷硫醇(alkanethiols)在其3′-末端或5′-末端功能化的寡核苷酸容易附着到金纳米颗粒上。参见Whitesides,Proceedings of the Robert A.Welch Foundation 39th Conference On ChemicalResearch Nanophase Chemistry,Houston,TX,第109-121页(1995)。也可参见,Mucic等,Chem.Commun.555-557(1996)(描述了将3′巯基DNA附着到扁平金表面的方法;该方法可用于将寡核苷酸附着到纳米颗粒上)。该链烷硫醇方法也可用于将寡核苷酸附着到其它金属,半导体和磁性胶体和上文所列的其它纳米颗粒上。将寡核苷酸附着到固体表面的其它官能团包括硫代磷酸基团(参见,例如,用于将寡核苷酸-硫代磷酸结合到金表面的美国专利号5,472,881),取代的烷基硅氧烷(参见,例如,用于将寡核苷酸结合到硅石和玻璃表面的Burwell,Chemical Technology,4,370-377(1974)和Matteucci和Caruthers,J.Am.Chem.Soc.,103,3185-3191(1981),和用于氨烷基硅氧烷结合及用于巯基烷基硅氧烷的相似结合的Grabar等,Anal.Chem.,67,735-743)。末端具有5′硫核苷(thionucleoside)或3′硫核苷的寡核苷酸也可用于将寡核苷酸附着到固体表面上。下面的参考文献描述了可用于将寡核苷酸附着到纳米颗粒上的其它方法:Nuzzo等,J.Am.Chem.Soc.,109,2358(1987)(二硫化物附着到金上);Allara和Nuzzo,Langmuir,1,45(1985)(羧酸附着到铝上);Allara和Tompkins,J.Colloid Interface Sci.,49,410-421(1974)(羧酸附着到铜上);Iler,The Chemistry Of Silica,第6章,(Wiley 1979)(羧酸附着到硅石上);Timmons和Zisman,J.Phys.Chem.,69,984-990(1965)(羧酸附着到铂上);Soriaga和Hubbard,J.Am.Chem.Soc.,104,3937(1982)(芳环化合物附着到铂上);Hubbard,Acc.Chem.Res.,13,177(1980)(环丁砜,亚砜和其它功能化溶剂附着到铂上);Hickman等,J.Am.Chem.Soc.,111,7271(1989)(异腈附着到铂上);Maoz和Sagiv,Langmuir,3,1045(1987)(硅烷附着到硅石上);Maoz和Sagiv,Langmuir,3,1034(1987)(硅烷附着到硅石上);Wasserman等,Langmuir,5,1074(1989)(硅烷附着到硅石上);Eltekova和Eltekov,Langmuir,3,951(1987)(芳香羧酸,醛,醇和甲氧基附着到二氧化钛和硅石上);Lec等,J.phys.Chem.,92,2597(1988)(刚性磷酸盐附着到金属上)。
在本发明的该实施方案的一个方面,提供了与用至少两种类型的寡核苷酸标记的树突体连接的纳米颗粒。树突体分子是由多个分支单位单体组成的结构,且可用于各种应用。参见,例如,Barth等,Bioconjugate Chemistry5:58-66(1994);Gitsov & Frechet,Macromolecules 26:6536-6546(1993);Hawker & Frechet,J.Amer.Chem.Soc.112:763 8-7647(1990a);Hawker &Frechet,Macromolecules 23:4726-4729(1990b);Hawker等,J.Chem.Soc.Perkin Trans.1:1287-1297(1993);Lochmann等,J.Amer.Chem.Soc.115:7043-7044(1993);Miller等,J.Amer.Chem.Soc.114:1018-1025(1992);Mousy等,Macromolecules 25:2401-2406(1992);Naylor等,J.Amer.Chem.Soc.111:2339-2341(1989);Spindler & Frechet,Macromolecules Macromolecules 26:4809-4813(1993);Turner等,Macromolecules 26:4617-4623(1993);Wiener等,Magnetic Resonance Med.31(1):1-8(1994);Service,267:458-459(1995);Tomalia,Sci.Amer.62-66(1995);和Tomalia的美国专利号4,558,120;4,507,466;4,568,737;4,587,329;4,857,599;5,527,524;5,338,532,和Nilsen的美国专利6,274,723,所有这些文献在此以其整体引用。树突状分子相对于其它类型的超分子结构提供了重要的优势,例如最小结构单位接触最大体积,更容易控制大小,重量,和生长特性的能力,可衍生化多个末端以便产生在标记之间具有规定空隙的高度标记的分子,或者或者为其它分子,或其混合物提供附着位点。一般参见美国专利6,274,723和上文合成方法引证的参考文献。
用于本发明方法的核酸树突体是可用核酸功能化或者可由核酸/寡核苷酸产生的本领域已知的任何核酸树突体。该树突体可按照诸如Hudson等,“核酸树突体:新生物聚合物结构”,Am.Chem.Soc.115:2119-2124(1993);美国专利6,274,723;和Cantor的美国专利号5,561,043的公开内容合成。
在本发明的该实施方案的另一方面,提供了一种通用纳米颗粒-寡核苷酸连接物。通用探针可用于测定包含至少两部分的任何靶核酸。该“通用探针”包括(i)与其附着的与报道寡核苷酸(例如,条形码DNA)的至少一部分,和与靶识别寡核苷酸的一部分互补的单个“捕捉”序列的寡核苷酸(通用探针的一个实施方案在图16A和16B中描述)。靶识别寡核苷酸包含具有至少两部分的序列;第一部分包含与纳米颗粒附着的捕捉序列的互补序列,第二部分包含特定靶核酸序列的第一部分的互补序列。可使用各种类型的靶识别寡核苷酸以极大地便利该通用探针,使得可以开关或交换靶识别寡核苷酸文库以选择特定试验溶液中的特定靶核酸序列。包含与靶核酸的第二部分互补的序列的第二种类型的寡核苷酸附着到支持物表面,例如磁性颗粒或玻璃片上。
通用探针与包含报道寡核苷酸(条形码DNA)和靶识别寡核苷酸的溶液在允许杂交的条件下接触产生“活化的”通用探针用于与可能含有靶核酸的溶液接触(图16A,上部反应图)。待测溶液可在允许杂交的条件下与附着到支持物上的“活化的”通用探针或第二种类型的寡核苷酸之一或两者依次或合并接触。一旦经过允许复合物形成的足够时间,将未复合的试验溶液成份与复合物分离,检测该报道寡核苷酸。该测定的一个实施方案在图16B中描述。
可根据需要实施的具体测定法对这些通用探针进行操作以增强其优势。通过简单取代或交换靶识别寡核苷酸使得第二部分包含感兴趣的靶核酸的互补序列,可“调节”该探针适应各种单靶核酸序列。同样,如果在单个试验溶液中需要测定多种靶核酸序列,该报道寡核苷酸可包含对各靶核酸特异性的序列。因此,对具有已知和特异性序列的报道寡核苷酸的检测结果可表明在试验溶液中存在特定靶核酸。
在本发明的该实施方案的另一方面,使用含硫官能团将寡核苷酸结合到纳米颗粒上。美国专利申请号09/760,500和09/820,279和国际申请号PCT/US01/01190和PCT/USO1/10071描述了用环状二硫化物(cyclicdisulfides)功能化的寡核苷酸,它可用于实施本发明。该环状二硫化物优选在其环中具有5或6个原子,包括两个硫原子。合适的环状二硫化物可通过商品途径获得或者可通过已知方法合成。也可使用环状二硫化物的还原形式。
优选的是,该接头还包含连接到环状二硫化物上的烃基。合适的烃可从商品途径获得并连接到环状二硫化物上。优选的烃基是类固醇残基。意外地发现了使用含有连接到环状二硫化物上的类固醇残基的接头制备的寡核苷酸-纳米颗粒连接物比使用链烷硫醇或无环二硫化物作为接头制备的连接物对硫醇(例如,在聚合酶链反应(PCR)溶液中使用的二硫苏糖醇)明显更稳定。事实上,已发现本发明的寡核苷酸-纳米颗粒连接物稳定300倍。该意想不到的稳定性很可能是由于这样的事实,即各寡核苷酸通过两个硫原子而不是单个硫原子锚着到纳米颗粒上。具体地说,认为环状二硫化物的两个相邻硫原子可能具有螯合作用,这可能有利于稳定寡核苷酸-纳米颗粒连接物。该接头的大型疏水类固醇残基通过屏蔽纳米颗粒与接近纳米颗粒表面的水溶性分子也似乎有助于该连接物的稳定性。
综上所述,环状二硫化物的两个硫原子应优选足够靠近在一起以便两个硫原子能够同时附着到纳米颗粒上。最优选的是,两个硫原子彼此相邻。另外,烃基应当足够大以便提供较大的疏水表面屏蔽纳米颗粒的表面。
采用环状二硫化物接头的寡核苷酸-环状纳米颗粒连接物可按美国专利号09/760,500和09/820,279和国际申请号PCT/US01/01190和PCT/US01/10071所述在检测样品中靶分析物的诊断测定中用作探针。已经发现这些连接物可提高使用它们的诊断测定的灵敏度。具体地说,已经发现使用以包含附着到环状二硫化物上的类固醇残基的接头制备的寡核苷酸-纳米颗粒连接物的测定法比采用以链烷硫醇或无环二硫化物作为接头制备的连接物的测定法灵敏大约10倍。
各纳米颗粒具有多种寡核苷酸与其附着。结果,各纳米颗粒-寡核苷酸连接物可与多种具有互补序列的寡核苷酸或核酸结合。
规定序列的寡核苷酸在本发明的实践中用于各种目的。制备具有预定序列的寡核苷酸的方法是熟知的。参见,例如,Sambrook等,MolecularCloning:A Laboratory Manual(1989年第二版)和F.Eckstein(编)Oligonucleotides and Analogues,第一版(Oxford University Press,New York,1991)。优选固相合成方法用于寡聚核糖核苷酸和寡聚脱氧核糖核苷酸(也可使用合成DNA的熟知方法合成RNA)。也可酶促制备寡聚核糖核苷酸和寡聚脱氧核糖核苷酸。对于具有与其结合的靶分析物的特异性结合补体的寡核苷酸,可使用任何合适的方法将诸如蛋白质的特异性结合补体附着到寡核苷酸上。
可使用任何合适的方法将寡核苷酸附着到颗粒,纳米颗粒,或纳米球体表面上。用于将寡核苷酸附着到表面的特别优选的方法基于1999年6月25日申请的美国申请号09/344,667,2000年6月26日申请的09/603,830;2001年1月12日申请的09/760,500;2001年3月28日申请的09/820,279;2001年8月10日申请的09/927,777;和1997年7月21日申请的国际申请号PCT/US97/12783;2000年6月26日申请的PCT/USOO/17507;2001年1月12日申请的PCT/US01/01190;2001年3月28日申请的PCT/US01/10071中所述的老化方法(aging process),这些文献的公开内容以其整体作为参考文献引用。老化方法给纳米颗粒-寡核苷酸连接物提供了意外增强的稳定性和选择性。
该方法包括提供优选具有与其共价结合的半分子的寡核苷酸,该半分子包含可与纳米颗粒结合的官能团。该半分子和官能团是允许寡核苷酸与纳米颗粒结合(即,通过化学吸附或共价结合)的那些半分子和官能团。例如,可使用具有与其5′或3′端共价结合的链烷硫醇,链烷二硫化物或环状二硫化物的寡核苷酸将该寡核苷酸与包括金纳米颗粒的各种纳米颗粒结合。
将寡核苷酸与水中的纳米颗粒接触足够的时间以允许至少一些寡核苷酸与纳米颗粒借助于官能团结合。可凭经验测定该时间。例如,已经发现大约12-24小时的时间可产生较好的结果。寡核苷酸结合的其它合适的条件也可凭经验测定。例如,大约10-20nM的纳米颗粒浓度和在室温下温育可产生较好的结果。
接着,向水中加入至少一种盐以形成盐溶液。盐可以是任何合适的水溶性盐。例如,盐可以是氯化钠,氯化镁,氯化钾,氯化铵,乙酸钠,乙酸铵,两种或多种这些盐的组合,或一种这些盐的磷酸盐缓冲液。优选的是,该盐以浓溶液加入,但也可作为固体加入。盐可以全部一次加入水中或者可在一段时间内逐渐加入盐。“在一段时间内逐渐”是指以一段时间间隔开的以至少两部分加入盐。合适的时间间隔可凭经验确定。
盐溶液的离子强度必需足以克服寡核苷酸相互之间的至少部分静电排斥,和带负电荷的寡核苷酸对带正电荷的纳米颗粒的静电吸引,或带负电荷的寡核苷酸对带负电荷的纳米颗粒的静电排斥。已经发现通过在一段时间内逐渐加入盐来逐渐降低静电吸引和排斥可在纳米颗粒上产生最高表面密度的寡核苷酸。对于每种盐或组合盐的合适离子强度可凭经验测定。已经发现在磷酸盐缓冲液中从大约0.1M到大约1.0M的氯化钠终浓度,优选氯化钠的浓度在一段时间内逐渐增加,可产生较好的结果。
加入盐后,将寡核苷酸和纳米颗粒在盐溶液中再温育一段足够的时间以允许足够的其它寡核苷酸结合到纳米颗粒上产生稳定的纳米颗粒-寡核苷酸连接物。正如下面将要描述的,已经发现纳米颗粒上寡核苷酸的表面密度增加可稳定连接物。温育的时间可凭经验确定。已经发现总共温育大约24-48,优选40小时可产生较好的结果(这是温育的总时间;如上所述,在这段总时间内可逐渐增加盐浓度)。在盐溶液中温育的第二段时间本文称为“老化”步骤。该“老化”步骤的其它合适条件也可凭经验确定。例如,在室温下和pH 7.0中温育可产生较好的结果。
已经发现使用“老化”步骤产生的连接物比未经“老化”步骤产生的连接物稳定得多。如上所述,稳定性增加是由于通过“老化”步骤实现的纳米颗粒表面的寡核苷酸密度增加引起。通过“老化”步骤实现的表面密度依赖于纳米颗粒的大小和类型,和寡核苷酸的长度,序列和浓度。足以使得纳米颗粒稳定的表面密度和对于纳米颗粒和寡核苷酸的所需组合获得该表面密度所必需的条件可凭经验确定。一般来说,至少10picomoles/cm2的表面密度足以提供稳定的纳米颗粒-寡核苷酸连接物。优选的是,表面密度是至少15 picomoles/cm2。由于如果该表面密度太大可减小连接物的寡核苷酸与核酸和寡核苷酸靶杂交的能力,因此表面密度优选不大于大约35-40picomoles/cm2。
本文使用的“稳定的”是指在连接物制备后至少6个月的期间内,大多数寡核苷酸仍然附着在纳米颗粒上且寡核苷酸能够在检测核酸的方法和纳米构建的方法中遇到的标准条件下与核酸和寡核苷酸靶杂交。
已经发现通过使用包含识别部分和间隔区部分的识别寡核苷酸可显著增加纳米颗粒-寡核苷酸连接物的杂交效率。“识别寡核苷酸”是包含与核酸或寡核苷酸靶的至少一部分序列互补的序列的寡核苷酸。在该实施方案中,识别寡核苷酸包含识别部分和间隔区部分,且与核酸或寡核苷酸靶杂交的是识别部分。可设计识别寡核苷酸的间隔区部分使其可与纳米颗粒结合。例如,该间隔区部分可具有与其共价结合的半分子,该半分子包含可与纳米颗粒结合的官能团。它们是与上述相同的半分子和官能团。由于识别寡核苷酸的间隔部分与纳米颗粒结合,因此识别部分与纳米颗粒表面分隔开且更易接近以便与其靶杂交。提供识别部分与纳米颗粒良好间隔的间隔区部分的长度和序列可凭经验确定。已经发现包含至少大约10个核苷酸,优选10-30个核苷酸的间隔区部分可产生良好的效果。间隔区部分可具有不干扰识别寡核苷酸与纳米颗粒或与核酸或寡核苷酸靶结合的能力的任何序列。例如,间隔区部分不应具有彼此互补,与识别寡核苷酸互补,或与识别寡核苷酸的核酸或寡核苷酸靶互补的序列。优选的是,间隔区部分的核苷酸碱基都是腺嘌呤,都是胸腺嘧啶,都是胞嘧啶,或者都是鸟嘌呤,除非它会引起刚才所述的一个问题。更优选的是,该碱基都是腺嘌呤,或者都是胸腺嘧啶。最优选的是该碱基都是胸腺嘧啶。
还已经发现除识别寡核苷酸之外,使用稀释寡核苷酸可提供剪裁(tailoring)连接物的工具以产生所需水平的杂交。发现稀释和识别寡核苷酸在与纳米颗粒接触制备连接物时以与其在溶液中的比率大约相同的比例附着到纳米颗粒上。因此,可控制结合到纳米颗粒上的稀释与识别寡核苷酸的比率使得该连接物参与所需数目的杂交事件。稀释寡核苷酸可具有不干扰识别寡核苷酸与纳米颗粒结合或与核酸或寡核苷酸靶结合的能力的任何序列。例如,稀释寡核苷酸不应具有与识别寡核苷酸或与识别寡核苷酸的核酸或寡核苷酸靶互补的序列。稀释寡核苷酸还优选比识别寡核苷酸的长度更短使得该识别寡核苷酸可结合其核酸或寡核苷酸靶。如果识别寡核苷酸包含间隔区部分,稀释寡核苷酸最优选的是与间隔区部分大约一样长。这样,稀释寡核苷酸就不会干扰识别寡核苷酸的识别部分与核酸或寡核苷酸靶杂交的能力。甚至更优选的是,稀释寡核苷酸与识别寡核苷酸间隔区部分的序列具有相同的序列。
在本发明的另一实施方案中,提供了颗粒复合物探针。每种类型的颗粒复合物探针含有特定靶分析物的预定报道寡核苷酸或条形码。在靶分析物存在的条件下,由于颗粒复合物与靶分析物之间的结合相互作用而产生聚集物。可分离这些聚集物并通过诸如热变性的任何合适的方式进行分析以检测一种或多种不同类型的报道寡核苷酸的存在。在实施本发明时,优选纳米颗粒复合物探针。
因此,在本发明的一个方面,颗粒复合物探针包含一种具有寡核苷酸与其结合的颗粒,一种或多种DNA条形码,和具有与其结合的特定靶分析物的特异性结合补体的寡核苷酸,其中(i)DNA条形码具有至少两部分的序列;(ii)附着到颗粒上的至少一些寡核苷酸具有与DNA条形码第一部分互补的序列;(iii)具有特异性结合补体与其结合的寡核苷酸具有与DNA条形码第二部分互补的序列;和(iv)每种类型的颗粒复合物探针中的DNA条形码具有不同的序列且用作特定靶分析物的标识符。
在该实施方案的另一方面,颗粒复合物探针包含具有至少两种类型的寡核苷酸与其结合的颗粒,一种或多种DNA条形码,具有靶分析物的特异性结合补体与其结合的寡核苷酸,其中与探针结合的第一种类型的寡核苷酸具有与DNA条形码的至少一部分互补的序列,与探针结合的第二种类型的寡核苷酸具有的序列与具有特异性结合补体的寡核苷酸的至少一部分序列互补。
在该实施方案的另一方面,颗粒复合物探针包含具有寡核苷酸与其结合的颗粒,一种或多种DNA条形码,和靶分析物的特异性结合补体,其中与颗粒结合的寡核苷酸的至少一部分具有与DNA条形码的至少一部分序列互补的序列且其中该DNA条形码用作特异性靶分析物的标识符。
在本发明的另一实施方案中,提供了颗粒复合物探针。因此在本发明的一个实施方案中,提供的颗粒复合物探针包含具有寡核苷酸与其结合的颗粒,DNA条形码,和具有特定靶分析物的特异性结合补体与其结合的寡核苷酸,其中(i)该DNA条形码具有至少两部分序列;(ii)附着到颗粒上的至少一些寡核苷酸具有与DNA条形码的第一部分互补的序列;(iii)具有特异性结合补体与其结合的寡核苷酸具有与DNA条形码的第二部分互补的序列;和(iv)在每种类型的颗粒复合物探针中的DNA条形码具有不同的序列且用作特定靶分析物的标识符。
在本发明的另一实施方案中,提供的颗粒复合物探针包含具有至少两种类型的寡核苷酸与其结合的颗粒,DNA条形码,和具有靶分析物的特异性结合补体与其结合的寡核苷酸,其中与探针结合的第一种类型的寡核苷酸具有与DNA条形码的至少一部分互补的序列,与探针结合的第二种类型的寡核苷酸具有的序列与具有特异性结合补体的寡核苷酸的至少一部分序列互补。
在本发明的另一实施方案中,提供的颗粒复合物探针包含具有寡核苷酸与其结合的颗粒,DNA条形码,和靶分析物的特异性结合补体,其中与颗粒结合的至少一部分寡核苷酸具有与DNA条形码的至少一部分序列互补的序列且其中DNA条形码用作特定靶分析物的标识符。
在本发明的另一实施方案中,提供了一种检测探针,它包含纳米颗粒;与纳米颗粒结合的特异性结合对的一个成员;与纳米颗粒结合的至少一种类型的寡核苷酸;和分别具有预定序列的至少一种类型的DNA条形码,其中每种类型的DNA条形码与至少一种类型的寡核苷酸的至少一部分杂交。
优选的颗粒包含上述纳米颗粒,例如金属,半导体,绝缘体,或磁性纳米颗粒。优选的颗粒是金纳米颗粒。特异性结合补体或结合对成员与靶分析物是特异性结合对的成员,它包括核酸,寡核苷酸,肽核酸,多肽,抗体,抗原,糖类,蛋白质,肽,氨基酸,激素,类固醇,维生素,药物,病毒,多糖,脂类,脂多糖,糖蛋白,脂蛋白,核蛋白,寡核苷酸,抗体,免疫球蛋白,白蛋白,血红蛋白,凝血因子,肽和蛋白质激素,非肽类激素,白介素,干扰素,细胞因子,包含肿瘤特异性表位的肽,细胞,细胞表面分子,微生物,微生物的碎片,部分,组份,或产物,小有机分子,核酸和寡核苷酸,任何上述物质的代谢产物或抗体。
在本发明的另一实施方案中,提供了用于检测样品中是否存在一种或多种靶分析物的方法,该靶分析物具有至少两个结合位点。在本发明的该实施方案的一个方面,提供的方法包括步骤:
提供一种基质;
提供一种或多种类型的颗粒探针,每种类型的探针包含具有特定靶分析物的一个或多个特异性结合补体的颗粒和与其结合的一个或多个DNA条形码,其中每种类型的颗粒探针的特异性结合补体对一个特定的靶分析物具有特异性,且每种类型的颗粒探针的DNA条形码用作该特定靶分析物的标记;
将该靶分析物固定到该基质上;
在允许靶分析物与该分析物的特异性结合补体之间结合且在靶分析物存在的条件下形成复合物的有效条件下将固定的靶分析物与一种或多种类型的颗粒探针接触;
洗涤该基质以去掉未结合的颗粒探针;和
任选扩增该DNA条形码;和
检测是否存在扩增的DNA条形码,其中是否存在该标记是样品中是否存在特定靶分析物的指标。
在本发明的该实施方案的一个方面,该靶分析物是蛋白质或半抗原且其特异性结合补体是包含单克隆或多克隆抗体的抗体。
在本发明的另一方面,可使用任何合适的基质。该基质可排列有一种或多种类型的靶分析物的捕捉探针。
在本发明的该方面,可分离条形码。通过以诸如DNA芯片的任何合适的方式确定报道寡核苷酸或条形码的存在来间接进行分析物测定。
DNA条形码任选可通过包括PCR扩增的任何合适的方式进行扩增,然后使用任何合适的检测探针通过任何合适的DNA检测系统进行检测。颗粒优选用足够量的DNA条形码进行标记以提供足够的信号放大且消除对DNA条形码扩增的需求。在实施本发明时,优选通过PCR方法进行扩增。DNA条形码的PCR扩增(本文也称为BPCR)允许检测attomolar水平的蛋白质靶。图6所示的测定法使用了用杂交的寡核苷酸(生物条形码)36严重功能化的新型纳米颗粒和多克隆检测抗体来识别靶分析物,即前列腺特异性抗原(PSA)(实施例5)。另外,具有磁性氧化铁核心的聚胺微颗粒(直径1μm)用PSA单克隆抗体功能化(图6和实施例5)。金纳米颗粒和聚胺微颗粒夹住PSA靶,产生条形码DNA与蛋白质靶具有高比率的复合物(对于13nm的颗粒,每个颗粒可携带200条DNA链;这代表了该大小颗粒的上限)。应用磁场瞬间将磁性颗粒拉到反应器壁上,使得人们能够将反应和未反应的微颗粒但只有反应的纳米颗粒从反应混合物中分离出来。在Nanopure水(18MOhms)中洗涤聚集物结构使得条形码DNA与纳米颗粒固定的补体去杂交。使用磁性分离器可容易地将聚集物从测定溶液中取出,留下条形码DNA,可使用PCR对它进行扩增,接着用标准DNA检测方法(扫描测定11,凝胶电泳,或荧光团标记方法)迅速鉴定。选择PSA作为这些试验的起始靶是因为其在前列腺癌,即美国男人最常见的癌症之一且是癌症死亡的第二大诱因,47,48的早期检测中的重要性。重要的是,使用作为低水平(10个拷贝)标记的PSA鉴定前列腺癌手术治疗后的疾病复发极其有利且使得能够进行治疗性辅助疗法的给药。46,49
实施例5-6证实了BPCR是在背景蛋白质存在的条件下使用凝胶电泳或扫描测量微阵列检测法检测低attomolar浓度的蛋白质分析物,即PSA的极其有效的方法。该研究证实了相对于目前的蛋白质检测法的一些优势。首先,该测定法的靶结合蛋白是同质的。因此,可向反应器中加入大量磁性颗粒以有利于检测抗体与靶分析物之间的结合动力学。这导致该测定比异质系统更快且由于捕捉步骤更有效也使得能够增加灵敏度。其次,使用纳米颗粒生物条形码提供了PCR可扩增的DNA与标记抗体的高比率,导致显著增加测定灵敏度。例如,本文报道的BPCR测定法能够检测3aM浓度的PSA,而基于PCR的免疫测定法据报道对于相同的靶分析物检测极限为3fM。43第三,该测定法避免了连接DNA与标记抗体所需的复杂结合化学过程。条形码DNA在标记反应开始时通过杂交结合到纳米颗粒探针上且使用简单的洗涤步骤释放出来用于PCR扩增。另外标记抗体和DNA存在于相同的颗粒上,在PCR扩增条形码DNA前不需要加入其它抗体或DNA-蛋白质连接物。另外,从检测试验中取出条形码DNA,对游离于PSA,大多数生物学样品,微颗粒和纳米颗粒的条形码DNA样品进行PCR。这极大地降低了背景信号。最后,该蛋白质检测方法具有大规模多重使用和在一种溶液中同时检测许多分析物的潜力。尽管PSA系统用于概念的证实,但是该方案对于具有已知结合配偶体的几乎任何靶都应普遍适用,且通过使用基于纳米颗粒的生物条形码方法36,可制备特有的可鉴定的条形码用于几乎所有感兴趣的靶。
实施例9证实了本发明的探针可用于检测和直接测量样品中靶分析物的量。因此,包含BPCR以扩增条形码DNA的步骤不是实现极好的灵敏度和检测极限所必需的(图6B(步骤4),9(插图),和12)。
可使用任何合适的洗涤溶液从复合物形成后的基质表面去掉未结合的探针。代表性的例子包括,但不限于,PBS(磷酸盐缓冲溶液)。
在靶分析物存在的条件下,由于纳米颗粒复合物探针与靶分析物之间的结合相互作用而产生纳米颗粒聚集物复合物。可分离这些聚集物并在该聚集物去杂交并释放报道寡核苷酸的有效条件下进行处理。然后分离报道寡核苷酸。如果需要,可通过包括PCR扩增的任何合适的方式扩增报道寡核苷酸。以诸如DNA芯片的任何合适的方式通过确定报道寡核苷酸或生物条形码的存在间接进行分析物的检测。
然后可通过任何合适的方式检测DNA条形码或报道寡核苷酸。一般来说,在检测前通过与复合物去杂交释放出DNA条形码。可使用任何合适的溶液或介质进行去杂交并从复合物中释放DNA条形码。代表性的介质是水。
通过聚集物的去杂交释放的DNA条形码可使用具有捕捉寡核苷酸与其结合的基质直接检测。该寡核苷酸具有与报道寡核苷酸的至少一部分互补的序列。检测DNA条形码的方法的一些实施方案使用具有互补寡核苷酸与其结合的基质来捕捉报道寡核苷酸。然后以任何合适的方式检测这些捕捉的报道寡核苷酸。通过采用基质,可检测的变化(信号)被放大且测定的灵敏度增加。
可使用任何合适的方法将寡核苷酸附着到基质上。例如,可按例如,Chrisey等,Nucleic Acids Res.,24,3031-3039(1996);Chrisey等,Nucleic AcidsRes.,24,3040-3047(1996);Mucic等,Chem.Commun.,555(1996);Zimmermann和Cox,Nucleic Acids Res.,22,492(1994);Bottomley等,J.Vac.Sci.Technol.A,10,591(1992);和Hegner等,FEBS Lett.,336,452(1993)所述将寡核苷酸附着到基质上。
附着到基质上的寡核苷酸具有与待检测的报道寡核苷酸序列的第一部分互补的序列。在允许基质上的寡核苷酸与报道寡核苷酸杂交的有效条件下将报道寡核苷酸与基质接触。这样报道寡核苷酸结合到基质上。在加入诸如纳米颗粒-寡核苷酸连接物的检测探针前优选从基质上洗去任何未结合的报道寡核苷酸。
在本发明的一个方面,与基质上的寡核苷酸结合的报道寡核苷酸与第一种类型的具有寡核苷酸与其附着的纳米颗粒接触。该寡核苷酸具有与报道寡核苷酸序列的第二部分互补的序列,且在允许纳米颗粒上的寡核苷酸与报道寡核苷酸杂交的有效条件下进行接触。这样第一种类型的纳米颗粒结合到基质上。纳米颗粒-寡核苷酸连接物结合到基质上后,洗涤基质去掉任何未结合的纳米颗粒-寡核苷酸连接物。
在第一种类型的纳米颗粒上的寡核苷酸可全部具有相同的序列或者可具有与待测报道寡核苷酸的不同部分杂交的不同序列。当使用具有不同序列的寡核苷酸时,各纳米颗粒可具有全部不同的寡核苷酸与其附着或者,优选不同的寡核苷酸附着到不同的纳米颗粒上。作为选择,在各第一种类型的纳米颗粒上的寡核苷酸可具有多种不同的序列,其中至少一种能与待测报道寡核苷酸的一部分杂交。
任选的是,结合到基质上的第一种类型的纳米颗粒-寡核苷酸连接物与具有寡核苷酸与其附着的第二种类型的纳米颗粒接触。这些寡核苷酸具有与附着到第一种类型的纳米颗粒上的寡核苷酸序列的至少一部分互补的序列,且在允许第一种类型的纳米颗粒上的寡核苷酸与第二种类型的纳米颗粒上的寡核苷酸杂交的有效条件下进行接触。纳米颗粒结合后,优选洗涤基质去掉任何未结合的纳米颗粒-寡核苷酸连接物。
组合杂交产生可检测的改变。除了多重杂交导致可检测的改变放大外,该可检测的改变与上述相同。具体地说,由于各第一种类型的纳米颗粒具有多种寡核苷酸(具有相同或不同的序列)与其附着,各第一种类型的纳米颗粒-寡核苷酸连接物可与多种第二种类型的纳米颗粒-寡核苷酸连接物杂交。同样,第一种类型的纳米颗粒-寡核苷酸连接物可与一部分以上的待测报道寡核苷酸杂交。多重杂交引起的放大可使得改变第一次可检测或者可提高可检测的改变值。这种放大作用提高了测定的灵敏度,允许检测少量的报道寡核苷酸。
如果需要,通过连续加入第一和第二种类型的纳米颗粒-寡核苷酸连接物可构建更多层的纳米颗粒。这样,可进一步增加每个靶核酸分子固定的纳米颗粒数目,从而相应地增加信号的强度。
另外,作为使用设计成互相直接杂交的第一和第二种类型的纳米颗粒寡核苷酸连接物的替代,可使用携带寡核苷酸的纳米颗粒,作为与结合的寡核苷酸杂交的结果它用于将纳米颗粒结合在一起。
当使用基质时,可将多种起始类型的纳米颗粒-寡核苷酸连接物或寡核苷酸以阵列的形式附着到基质上用于检测靶报道寡核苷酸的多个部分,用于检测多种不同的报道寡核苷酸,或者两者都检测。例如,基质上可具有成排的点,每点含有设计成与靶报道寡核苷酸的一部分结合的不同类型的寡核苷酸。向各点加上含有一种或多种报道寡核苷酸的样品,使用合适的寡核苷酸纳米颗粒连接物以上述的一种方式进行剩下的测定。
在另一方面,可修改通过BPCR,以及直接检测的分析物检测方法,便于与包含在诸如玻璃,金,硅,镍,塑料,等基质上检测分析物的方法一起使用。也可修改这些方法以检测其它生物学和化学识别事件,例如DNA-蛋白质结合事件,生理学蛋白质-蛋白质结合或二聚化,和上述已知的其它生物分子相互作用。
在该方面的一个实施方案中,该方法包含将各靶分析物的一种或多种类型的捕捉探针附着到基质上,将基质与待测溶液接触,任选从基质上洗去待测溶液,随后将基质与各靶分析物的一种或多种类型的检测探针接触,去掉任何未结合的检测探针,并检测可观察的信号,其中可观察到的信号的检测结果表示待测溶液中存在靶分析物。
在本发明的该方面,可使用本文所述的任何方法检测可观察到的信号。例如,直接检测条形码DNA,检测BPCR-扩增的条形码DNAs,检测一种或多种类型的检测探针的聚集(例如,通过肉眼观察,荧光,比色,电化学,电子,光密度测定法,放射性,等等),或者通过使用包含与条形码DNAs的至少一部分互补的序列的报道核苷酸和可检测的信号半分子(例如,荧光标记)。
当使用基质时,通过诸如银染或金染的染色法可产生或进一步增强可检测的改变。对于催化银还原的任何类型的纳米颗粒都可采用银染法。优选纳米颗粒由贵金属(例如,金和银)制成。参见Bassell,等,J.Cell Biol,126,863-876(1994);Braun-Howland等,Biotechniques,13,928-931(1992)。如果用于检测核酸的纳米颗粒不能催化银还原,那么可将银离子与核酸络合以催化还原。参见Braun等,Nature,391,775(1998)。另外,已知银染料可与核酸上的磷酸基团反应。
在包括上述基质的基质上进行的任何测定中可使用银染料产生或增强可检测的改变。具体地说,发现银染料可大量提高采用单一类型的纳米颗粒的测定中的灵敏度,从而可消除通常对多层纳米颗粒的使用。
在基质上进行的检测报道寡核苷酸的测定中,用光学扫描器可观察到可检测的改变。合适的扫描器包括能够以反射方式(reflective mode)操作的用于将文件扫描进计算机的那些扫描器(例如,平板扫描器),能够完成该功能或者利用相同类型光学的其它装置,任何类型的灰度等级(greyscale)-灵敏性测量装置,和改良为扫描根据本发明的基质的标准扫描器(例如,改良为包含基质夹持器的平板扫描器)(至今,尚未发现可以使用以透射方式(transmissive mode)操作的扫描器)。扫描器的分辨率必需足够大以便基质上的反应区大于扫描器的单个像素。该扫描器可用于任何基质,前提是在基质上可观察到试验产生的可检测的变化(例如,灰色斑点,例如银染产生的灰色斑点,可在白色背景上观察到,但是不能在灰色背景上观察到)。扫描器可以是黑-白扫描器,或者,优选彩色扫描器。最优选的是,扫描器是用于将文件扫描进计算机的标准彩色扫描器类型。该扫描器便宜且容易以商品形式买到。例如,可使用Epson Expression 636(600×600dpi),UMAXAstra 1200(300×300dpi),或Microtec 1600(1600×1600dpi)。扫描器与装载有软件的计算机连接用于加工通过扫描基质获得的图像。该软件可以是容易以商品形式买到的标准软件,例如Adobe Photoshop 5.2和Corel Photopaint8.0。使用该软件计算灰度等级测量值提供了定量测定结果的方法。该软件还可提供色斑的颜色数目并可产生扫描图像(例如,打印输出),可对其进行浏览以提供存在核酸的定性测定结果,核酸的定量,或者两者都测定。计算机可以是容易以商品形式买到的标准个人计算机。因此,使用与装载有标准软件的标准计算机相连的标准扫描器可提供在基质上进行测定时检测和定量核酸的方便,简易,便宜的工具。也可将扫描贮存在计算机中以维持该结果的记录用于进一步参考或使用。当然,如果需要,可使用更高级的仪器和软件。
在本发明的另一实施方案中,提供了一种检测样品中是否存在一种或多种靶分析物的方法,每种靶分析物具有至少两个结合位点,该方法包括:
提供结合于基质上的一种或多种类型的捕捉探针,每种类型的捕捉探针包含特异性靶分析物的第一结合位点的特异性结合补体;
提供一种或多种类型的检测探针,每种类型的检测探针包含具有寡核苷酸与其结合的纳米颗粒,该特异性靶分析物的第二结合位点的一个或多个特异性结合补体,和用作特定靶分析物标记的一个或多个DNA条形码,其中该DNA条形码序列的至少一部分与结合到纳米颗粒上的至少一些寡核苷酸杂交;
在允许靶分析物和探针之间发生特异性结合相互作用且在存在靶分析物时形成聚集复合物的有效条件下接触样品,捕捉探针,和检测探针;
洗涤基质以去掉未结合的检测探针;
检测基质上的聚集复合物中是否存在该DNA条形码,其中是否存在该DNA条形码的检测结果是样品中是否存在靶分析物的指标。
在本发明的该实施方案的一个方面,该检测探针包含(i)特异性靶分析物的第二结合位点的一个或多个特异性结合补体,(ii)与纳米颗粒结合的至少一种类型的寡核苷酸,和具有与至少一种类型的寡核苷酸的至少一部分互补的预定序列的DNA条形码,该DNA条形码与各类型的检测探针结合用作特异性靶分析物的标记;
在该实施方案的另一方面,在所述的检测步骤之前,该方法还包括步骤:
在使复合物去杂交且释放该DNA条形码的有效条件下处理该聚集复合物;和
任选在所述检测前扩增该DNA条形码。
在本发明的另一方面,捕捉探针结合到诸如磁性颗粒的磁性基质上,例如,具有磁性氧化铁的聚苯乙烯MMP。这允许从溶液中容易地除去复合物。然后使用上述基于基质的检测技术直接检测或者在检测技术前通过扩增间接检测DNA条形码。在下面实施例中,描述了基于寡核苷酸-修饰的纳米颗粒(NPs),磁性微颗粒(MMPs)的方法,和随后检测作为一种或多种靶核酸序列的放大器的条形码DNA。优选的是,寡核苷酸修饰的纳米颗粒包含金纳米颗粒。检测是否存在靶DNA信号(通过检测条形码DNA)优选使用上述基于基质的检测方法进行。
在一个方面,本发明提供了不依赖于PCR方法的靶核酸扩增方法,且它以寡核苷酸修饰的纳米颗粒(NPs),磁性微颗粒(MMPs)为基础,并检测以条形码DNA的形式扩增的靶核酸。在该方面的一个实施方案中,寡核苷酸修饰的纳米颗粒(NPs)包含金纳米颗粒。在该方面的另一实施方案中,使用基于芯片的检测方法进行放大DNA信号(靶序列特异性的条形码DNA)的检测。在该方面的另一实施方案中,条形码DNA包含对各感兴趣的靶核酸分子特异性的序列,它允许特异性检测待测溶液中的多种靶核酸序列。
在本发明的另一方面,该条形码DNA包含对检测样品中各感兴趣的特定靶分析物特异性的序列,它允许检测单个测定/检测溶液中的多种特异性靶。如实施例所示,可达到低至大约500 zeptomolar(zM)的检测极限(“zepto”数量级为10-21;例如在整个20μL样品中有10个拷贝)。该检测极限表示靶核酸分子的无PCR检测的灵敏度显著增大。
在这一方面,提供了两种类型的探针用于靶DNA检测(DNA-BCA)。在某些实施方案中,第一种类型的探针是具有磁性氧化铁核心的聚苯乙烯MMP,用与靶序列的至少一部分互补的寡核苷酸功能化。MMP的寡核苷酸的互补部分可具有各种长度,这取决于具体测定条件(例如,缓冲液系统,靶核酸序列,温度,等)。
在另一实施方案中,第二种探针包含用两种类型的寡核苷酸修饰的纳米颗粒,一种包含与不同于被MMP识别的靶区域的至少一部分靶序列互补的序列;另一种包含与至少一部分条形码DNA序列互补的序列,该条形码DNA提供了特定靶序列的特有鉴定标记。在某些实施方案中,该纳米颗粒是金纳米颗粒。在另一实施方案中,金纳米颗粒包含13,20,或30nm的金纳米颗粒。
纳米颗粒表面上的条形码DNA与靶结合序列的比率可以变化以适应各单独的测定法。为了提供条形码DNA的无PCR检测,条形码DNA与靶结合DNA的比率应当大于1∶1,优选至少大约25∶1,更优选至少大约50∶1,最优选至少大约100∶1。更高的比率可提供无PCR靶扩增,因为在DNA-BCA方法中鉴定和检测条形码DNA而不是靶序列。例如,13nm金纳米颗粒的每个颗粒可容纳至少100条硫醇化的DNA链。73对于20和30nm的纳米颗粒,假定有相当的寡核苷酸装载且每个颗粒为球形,则该颗粒可分别容纳大约240和530条固定的寡核苷酸。
在该实施方案的另一方面,与纳米颗粒结合的特异性结合补体是单克隆或多克隆抗体。
在该实施方案的另一方面,与捕捉探针结合的特异性结合补体是单克隆抗体。
在该实施方案的另一方面,该抗体是抗-PSA抗体。
在该实施方案的另一方面,在所述洗涤步骤前,该方法还包含步骤:
通过对结合到磁性颗粒上的聚集复合物使用磁场在洗涤前分离该聚集复合物。
在该实施方案的另一方面,该方法还包含步骤:在去杂交聚集复合物并释放DNA条形码的有效条件下处理该分离的聚集复合物。
在该实施方案的另一方面,通过诸如PCR的任何合适的技术扩增释放的DNA条形码。
在该实施方案的另一方面,靶分析物是具有至少两部分的核酸。
在该实施方案的另一方面,该靶分析物是具有至少两部分序列的靶核酸,检测探针包含具有与DNA条形码互补的序列的寡核苷酸的纳米颗粒,检测探针的特异性结合补体包含具有与靶核酸的第一部分互补的序列的第一靶识别寡核苷酸,且捕捉探针的特异性结合补体包含具有与靶核酸的至少第二部分互补的序列的第二靶识别寡核苷酸。
在该实施方案的另一方面,靶分析物是具有至少两部分序列的靶核酸,检测探针包含具有寡核苷酸与其结合的纳米颗粒,DNA条形码具有与结合到检测探针上的寡核苷酸的至少一部分互补的序列,特异性结合补体包含具有至少第一和第二部分序列的靶识别寡核苷酸,第一部分与靶核酸的第一部分互补且第二部分与结合到纳米颗粒上的寡核苷酸的至少一部分互补,基质的特异性结合补体包含具有与靶核酸的第二部分互补的至少一部分的靶识别寡核苷酸。
在该实施方案的另一方面,检测探针包含上述树突体纳米颗粒。
在本发明的另一实施方案中,提供了一种检测样品中是否存在一种或多种靶分析物的方法,每种靶分析物具有至少两个结合位点,该方法包括:
提供一种或多种类型的捕捉探针,每种类型的捕捉探针包含(i)磁性颗粒;和(ii)附着到磁性颗粒上的第一特异性结合对的第一成员,其中第一特异性结合对的第一成员与特异性靶分析物的第一结合位点结合;
提供用于每种靶分析物的一种或多种类型的检测探针,每种类型的检测探针包含(i)纳米颗粒;(ii)附着到纳米颗粒上的第二特异性结合对的第一成员,其中第二特异性结合对的第一成员与靶分析物的第二结合位点结合;(iii)与纳米颗粒结合的至少一种类型的寡核苷酸;和(iv)至少一种类型的DNA条形码,各种类型的DNA条形码具有与特定类型的寡核苷酸的至少一部分互补的预定序列且用作特异性靶分析物的标记;
在允许靶分析物和探针之间发生特异性结合相互作用且在存在靶分析物时形成与磁性颗粒结合的聚集复合物的有效条件下接触样品与捕捉探针和检测探针;
从磁性颗粒上洗去未结合的检测探针;和
检测复合物中是否存在该DNA条形码,其中该DNA条形码的检测结果是存在靶分析物的指标。
在该实施方案的一个方面,该方法在所述的检测步骤之前还包括步骤:
通过使用磁场分离聚集复合物;
在去杂交且从聚集复合物释放该DNA条形码的有效条件下处理该聚集复合物;
分离释放的DNA条形码。
在该实施方案的另一方面,该方法还包含扩增释放的DNA条形码。
在该实施方案的另一方面,该方法还包括:
提供具有寡核苷酸与其结合的基质,该寡核苷酸具有与DNA条形码序列的至少一部分互补的序列;
提供包含与其结合的寡核苷酸的纳米颗粒,其中结合到纳米颗粒上的寡核苷酸的至少一部分具有与DNA条形码的至少一部分互补的序列;和
在允许DNA条形码的至少第一部分与结合到基质上的互补寡核苷酸之间和DNA条形码的第二部分与结合到纳米颗粒上的一些寡核苷酸之间杂交的有效条件下接触DNA条形码,结合到基质上的寡核苷酸,和纳米颗粒。
在该实施方案的另一方面,在检测前通过PCR扩增该DNA条形码。
在该实施方案的另一方面,该方法还包含在分析聚集复合物前分离该聚集复合物。
在该实施方案的另一方面,通过对聚集复合物使用磁场来分离该聚集复合物。
在该实施方案的另一方面,该纳米颗粒是诸如金纳米颗粒的金属纳米颗粒或半导体纳米颗粒。
在该实施方案的另一方面,特异性结合对是抗体和抗原;受体和配体;酶和底物;药物和靶分子;抗体核酸(aptamer)和抗体核酸靶;两条至少部分互补的寡核苷酸链。
在该实施方案的另一方面,该DNA条形码可用生物素标记,放射性标记,或荧光标记。
在任一实施方案中,提供了至少两种类型的颗粒复合物探针,第一种类型的探针具有靶分析物上第一结合位点的特异性结合补体且第二种类型的探针具有探针上第二结合位点的特异性结合补体。可提供多种颗粒复合物探针,每种类型的探针具有靶分析物上不同结合位点的一种特异性结合补体。
特异性结合补体和靶分析物是特异性结合对的成员,它包括核酸,寡核苷酸,肽核酸,多肽,抗体,抗原,糖类,蛋白质,肽,氨基酸,激素,类固醇,维生素,药物,病毒,多糖,脂类,脂多糖,糖蛋白,脂蛋白,核蛋白,寡核苷酸,抗体,免疫球蛋白,白蛋白,血红蛋白,凝血因子,肽和蛋白质激素,非肽类激素,白介素,干扰素,细胞因子,包含肿瘤特异性表位的肽,细胞,细胞表面分子,微生物,微生物的碎片,部分,组份,或产物,小有机分子,核酸和寡核苷酸,任一上述物质的代谢产物或抗体。
核酸和寡核苷酸包括基因,病毒RNA和DNA,细菌DNA,真菌DNA,哺乳动物DNA,cDNA,mRNA,RNA和DNA片断,寡核苷酸,合成寡核苷酸,修饰的寡核苷酸,单链和双链核酸,天然和合成核酸,和抗体核酸。
靶分析物是核酸且特异性结合补体是寡核苷酸。作为选择,靶分析物是蛋白质或半抗原且特异性结合补体是包含单克隆或多克隆抗体的抗体。作为选择,靶分析物是来自基因组DNA样品的序列且特异性结合补体是寡核苷酸,该寡核苷酸具有与该基因组序列的至少一部分互补的序列。该基因组DNA可以是真核,细菌,真菌或病毒DNA。
特异性结合补体和靶分析物是抗体-配体对的成员。
除了其第一结合位点外,靶分析物可修饰成包含第二结合位点。
该方法可进一步包含过滤步骤以除去聚集复合物,其中过滤在分析聚集复合物之前进行。过滤步骤包括去掉不包含DNA条形码的样品成份的膜。
在本发明的另一实施方案中,提供了检测样品中是否存在一种或多种靶分析物的方法,该方法包括:
提供至少一种或多种类型的颗粒复合物探针,每种类型的探针包括与其结合的寡核苷酸,特异性靶分析物的一种或多种特异性结合补体,用作特定靶分析物标记的一种或多种DNA条形码,其中该DNA条形码序列的至少一部分与结合到纳米颗粒上的至少一些寡核苷酸杂交;
在允许靶分析物和颗粒复合物探针之间发生特异性结合相互作用且在存在靶分析物的条件下形成聚集复合物的有效条件下接触该样品与颗粒复合物探针;和
观察是否出现聚集复合物形成。
在本发明的该方面,可使用本文所述的任何方法检测可观察到的信号。例如,直接检测条形码DNA,检测BPCR-扩增的条形码DNAs,检测一种或多种类型的检测探针的聚集(例如,通过肉眼观察,荧光,比色,电化学,电子,光密度测定法,放射性,等等),或者通过使用包含与条形码DNAs的至少一部分互补的序列的报道核苷酸和可检测的信号半分子(例如,荧光标记)。
如果存在足够的复合物,在存在或没有背景基质的条件下可肉眼观察该复合物。可使用允许观察可检测的改变的任何基质。合适的基质包括透明固体表面(例如,玻璃,石英,塑料和其它聚合物),不透明的固体表面(例如,白色固体表面,例如TLC硅石板,滤纸,玻璃纤维滤器,硝酸纤维素膜,尼龙膜),和传导性固体表面(例如,铟-锡-氧化物(ITO))。该基质可以是任何形状或厚度,但一般是平板和薄片。优选透明基质,例如玻璃(例如,载玻片)或塑料(例如,微量滴定板孔)。
在本发明的一个方面,提供了一种检测样品中存在靶分析物,例如,抗体的方法。诸如下面实施例所示的免疫球蛋白E(IgE)或免疫球蛋白G1(IgG1)的抗体可用与合适的半抗原(对于IgG1用生物素,对于IgE用二硝基苯基(DNP),图1A)修饰的寡核苷酸链预杂交的寡核苷酸修饰的探针进行检测。13,14在下面实施例中提供的概念验证测定中的DNA序列以这样的方式设计,即保证探针与IgGI和IgE反应形成的两个不同聚集物在不同温度下解链,图1B。IgG1的探针比IgE具有更长的序列和更高的G,C碱基含量。因此,前者序列比后者序列在更高温度下解链。这些序列差异允许人们制备具有不同解链标记的探针,该标记用作代码以鉴定与它们反应形成纳米颗粒聚集物的靶。已经研究了三种不同的系统:(1)提供两种探针与一种靶抗体(IgG1或IgE);(2)提供两种探针与两种不同的靶抗体,和(3)提供无靶抗体的对照。
在本发明的该方面,提供了一种检测样品中存在靶分析物,例如,抗体的方法,包括将具有寡核苷酸与其结合的纳米颗粒探针与含有靶分析物的样品接触。附着到纳米颗粒上的至少一些寡核苷酸由于杂交与报道寡核苷酸的第一部分结合。报道寡核苷酸的第二部分由于杂交结合到具有分析物特异性的结合补体(例如,抗原)与其结合的寡核苷酸上。在允许分析物与纳米颗粒探针之间发生特异性结合相互作用的有效条件下进行接触。存在靶分析物时,可产生纳米颗粒聚集物。可通过任何合适的方式检测这些聚集物。
在本发明的另一方面,可使用颗粒复合物探针,优选纳米颗粒复合物探针。这些颗粒复合物可在进行实际测定之前产生或者在进行测定时原位产生。这些复合物包含具有寡核苷酸与其结合的一种颗粒,优选纳米颗粒,与结合到纳米颗粒上的寡核苷酸的至少一部分结合的报道寡核苷酸,和靶分析物的特异性结合补体。该特异性结合补体可直接或间接与纳米颗粒结合。例如,特异性结合补体可与接头或寡核苷酸结合,然后该标记的接头或寡核苷酸结合到纳米颗粒上。在一个实施方案中,DNA条形码或报道寡核苷酸具有至少两部分序列且通过杂交具有寡核苷酸与其结合的纳米颗粒和具有特异性结合补体与其结合的寡核苷酸来连接。结合到纳米颗粒上的寡核苷酸具有与报道寡核苷酸的一部分互补的序列且具有特异性结合补体与其结合的寡核苷酸具有与报道寡核苷酸的第二部分互补的序列。报道寡核苷酸具有至少两部分且通过杂交具有寡核苷酸与其结合的纳米颗粒和具有特异性结合补体与其结合的寡核苷酸来连接。当在含有靶分析物的样品中使用时,纳米颗粒复合物与靶分析物结合并发生聚集。可分离该聚集物并进行进一步的解链分析以鉴定特定靶分析物,其中可存在如上所述的多种靶。另外,聚集物可去杂交以释放报道寡核苷酸。可任选扩增这些报道寡核苷酸,或DNA条形码,然后使用任何合适的检测探针通过任何合适的DNA检测系统进行检测。
在实施本发明时,通过将具有寡核苷酸与其结合的纳米颗粒与用靶分析物的特异性结合补体修饰的寡核苷酸,和报道寡核苷酸进行杂交可制备纳米颗粒复合物探针。附着到纳米颗粒上的至少一些寡核苷酸具有与报道寡核苷酸的第一部分互补的序列。具有特异性结合补体与其结合的寡核苷酸具有与报道寡核苷酸的第二部分互补的序列。报道寡核苷酸与附着到纳米颗粒上的至少一些寡核苷酸和与具有特异性结合补体与其结合的寡核苷酸在足以允许该成份之间杂交的条件下杂交,形成纳米颗粒复合物探针。在制备允许该成份充分杂交的纳米颗粒复合物溶液时可使用任何合适的溶剂介质和杂交条件。优选的是,该成份在由0.3M NaCl和10mM磷酸盐缓冲液(pH 7)组成的磷酸盐缓冲液(PBS)中在室温下杂交大约2-3小时。杂交混合物中纳米颗粒-寡核苷酸连接物的浓度在大约2nM和大约50nM之间变化,优选大约13nM。半抗原修饰的寡核苷酸的浓度一般在大约50和大约900nM之间变化,优选大约300nM。报道寡核苷酸的浓度一般在大约50和大约900nM之间变化,优选大约300nM。未反应的半抗原修饰的寡核苷酸和报道寡核苷酸任选,但优选可通过任何合适的方式除去,优选通过离心(12,000rpm,20分钟)杂交混合物且随后倾析该上清。制备的混合物于4-6℃贮存在0.3M NaCl和10mM磷酸盐缓冲液(pH7-7.4),0.01%叠氮化物溶液中。
检测样品中存在靶分析物,例如抗体的典型测定法如下:将含有纳米颗粒复合物探针的溶液与相信含有靶蛋白的含水样品溶液混合,该纳米颗粒复合物探针包含具有寡核苷酸与其结合的纳米颗粒,报道寡核苷酸,和具有靶分析物的特异性结合补体的寡核苷酸。在含水样品溶液中的总蛋白含量一般在大约5到大约100ug/ml之间变化,通常为大约43ug/ml。反应混合物中纳米颗粒的浓度一般在大约2nM和大约20nM之间变化,通常为大约~13nM。所得混合物的总体积一般在大约100uL和大约1000uL之间变化,优选大约400uL。在制备相信含有靶分析物的含水样品溶液时可采用任何合适的溶剂,优选含有0.3M NaCl和10mM磷酸盐缓冲液(pH 7-7.4)的PBS。
然后所得的测定混合物在大约35到大约40℃之间变化,优选在37℃的温度下温育在大约30到大约60分钟之间变化,优选大约50分钟的足够时间以促进特异性结合对,例如,蛋白质-半抗原,的复合作用。如果存在靶蛋白,则发生颗粒聚集,导致随着沉淀作用金纳米颗粒质谱带(plasmonband)转移和由红到紫的颜色改变。离心杂交产物(例如,3000rpm 2分钟),分析前倾析含有未反应成份的上清。
如果需要,通过混合所有具有寡核苷酸与其结合的纳米颗粒,报道寡核苷酸,和半抗原修饰的寡核苷酸与怀疑含有靶分析物的样品在测定混合物内原位制备纳米颗粒复合物探针。为了确保所有成份,特别是互补DNA链之间的完全杂交,测定混合物可在-15℃温育20分钟(Boekel TropicoolerHot/Cold Block Incubator)并在4℃下贮存24小时以促进杂交。然而,在实施本发明时,优选在进行测定反应之前制备纳米颗粒复合物探针以增加纳米颗粒复合物探针内的DNA条形码总量。
为了测定存在哪一种蛋白质,可在溶液中进行聚集物的解链分析,监测260nm下的消光作为温度的函数。参见,例如,实施例3中的图2,它描绘了含有一种或两种已知靶分析物:即IgG1和IgE的样品分析。如实施例3所述,当通过上述方法用探针处理IgG1时,溶液变成略带桃红色的蓝色,表明形成了纳米颗粒聚集物。在没有靶但存在背景蛋白的对照实验中,没有可识别的沉淀。溶液的解链分析表明在55℃的解链温度(Tm)下出现突然转变。这是IgG1靶的预期转变,图2A(---)。如果向新的探针溶液中加入IgE,可观察到相同的颜色变化但解链分析提供了Tm为36℃的曲线,即该靶的预期转变,图2A(-)。值得注意的是,当向探针溶液中加入两种蛋白质靶时,溶液变为暗紫色,且解链分析显示出两个不同的转换(transactions)。该曲线的第一个导数(derivative)显示出中心分别在36和55℃下的两个峰,图2B。这证实了可使用从寡核苷酸条形码产生的两种不同的装配形式及其解链特性来区分两种蛋白质靶。
在本发明的另一方面,可使用各种上述聚集方法策略以提高上述系统的灵敏度和增加可在一种溶液中检测的靶数目。参见,例如,实施例4中的图3。用该策略,可通过给特定靶分析物指定的DNA条形码或特有报道寡核苷酸间接检测该蛋白质靶。一般来说,用于靶分析物的合适长度,GC含量,和序列,以及报道寡核苷酸的选择在测定前预定。例如,12-聚体的寡核苷酸有412种不同的序列,其中许多可用于制备图1A所示的感兴趣的多价蛋白质的条形码。在这种测定法中,其形成的聚集物的解链特性在溶液中不能测量,而应当通过离心(例如,3000rpm 2分钟)将聚集物内的报道寡核苷酸或DNA条形码与未反应的探针和靶分子分离。然后通过任何合适的方式,例如,通过向溶液中加水,使得该聚集物变性,以释放报道寡核苷酸或生物条形码。如果报道寡核苷酸以少量存在,可通过本领域已知的方法扩增。参见,例如,Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第二版1989)和B.D.Hames and S.J.Higgins,Eds.,Gene Probes 1(IRL Press,New York,1995)。优选聚合酶链式反应(PCR)扩增。可通过任何合适的工具,例如,离心过滤装置(Millipore Microcon YM-100,3500rpm 25分钟)将颗粒和蛋白质与报道寡核苷酸分离。一旦分离了报道寡核苷酸,可在寡核苷酸阵列上捕捉它们并使用许多合适的DNA检测试验之一来鉴定它们(图3)。对于本文所述的涉及IgG1和IgE的例子,在用与感兴趣的条形码的一半互补的寡核苷酸功能化(直径为250μm的点)的载玻片上捕捉报道寡核苷酸(图1中A3和B3)。如果条形码被寡核苷酸阵列捕捉,与条形码剩余部分互补的DNA-修饰的颗粒可与该阵列杂交(见实验部分)。当通过标准扫描测定方法[11](它涉及用照相显影液处理)显影时,可使用平板扫描器定量该结果,图4。11如果存在IgG1,则仅有针对IgG1设计的点显示出可测量的信号。同样,如果IgE是仅有的蛋白质,则仅有针对它设计的点显示出信号。最后,如果两种蛋白质都存在,则两种点都表现出强信号。
在该实施方案的一个方面,在各种类型的颗粒复合物探针中的DNA条形码具有不同的序列且用作特定靶分析物的标识符。
在该实施方案的另一方面,该方法还包含如下步骤:
分离聚集复合物;和
分析该聚集复合物以测定具有不同序列的一种或多种DNA条形码的存在。
在该实施方案的另一方面,该方法还包括如下步骤:
分离该聚集复合物;
在该聚集复合物去杂交且释放DNA条形码的有效条件下处理该聚集复合物;
分离该DNA条形码;和
检测具有不同序列的一种或多种DNA条形码的存在,其中各DNA条形码是样品中存在特定靶分析物的指标。
在该实施方案的另一方面,该方法还包括如下步骤:
分离聚集复合物;
在该聚集复合物去杂交且释放DNA条形码有效的条件下处理该聚集复合物;
分离该DNA条形码;
扩增分离的DNA条形码;和
检测具有不同序列的一种或多种扩增的DNA条形码的存在,其中各DNA条形码是样品中存在特定靶分析物的指标。
在该实施方案的另一方面,靶具有两个以上的结合位点且提供至少两种类型的颗粒复合物探针,第一种类型的探针具有靶分析物上第一结合位点的特异性结合补体,第二种类型的探针具有探针上第二结合位点的特异性结合补体。可提供许多颗粒复合物探针,每种类型的探针具有靶分析物上不同结合位点的一种特异性结合补体。
在该实施方案的另一方面,特异性结合补体和靶分析物是特异性结合对的成员,它包括核酸,寡核苷酸,肽核酸,多肽,抗体,抗原,糖类,蛋白质,肽,氨基酸,激素,类固醇,维生素,药物,病毒,多糖,脂类,脂多糖,糖蛋白,脂蛋白,核蛋白,寡核苷酸,抗体,免疫球蛋白,白蛋白,血红蛋白,凝血因子,肽和蛋白质激素,非肽类激素,白介素,干扰素,细胞因子,包含肿瘤特异性表位的肽,细胞,细胞表面分子,微生物,微生物的碎片,部分,组份,或产物,小有机分子,核酸和寡核苷酸,任一上述物质的代谢产物或抗体。
核酸和寡核苷酸包括基因,病毒RNA和DNA,细菌DNA,真菌DNA,哺乳动物DNA,cDNA,mRNA,RNA和DNA片断,寡核苷酸,合成寡核苷酸,修饰的寡核苷酸,单链和双链核酸,天然和合成核酸,和抗体核酸。
在一个方面,靶分析物可以是核酸且特异性结合补体可以是寡核苷酸。作为选择,靶分析物是蛋白质或半抗原且特异性结合补体是包含单克隆或多克隆抗体的抗体。
在该实施方案的另一方面,靶分析物是来自基因组DNA样品的序列且特异性结合补体是寡核苷酸,该寡核苷酸具有与该基因组序列的至少一部分互补的序列。
在该实施方案的另一方面,该基因组DNA可以是真核,细菌,真菌或病毒DNA。
在另一方面,特异性结合补体和靶分析物是抗体-配体对的成员。
在该实施方案的另一方面,用于检测存在一种或多种DNA条形码的步骤包括:
提供具有寡核苷酸与其结合的基质,该寡核苷酸具有与DNA条形码序列的至少一部分互补的序列;
提供包含寡核苷酸与其结合的纳米颗粒,其中结合到纳米颗粒上的寡核苷酸的至少一部分具有与DNA条形码的至少一部分互补的序列;和
在允许DNA条形码的至少第一部分与结合到基质上的互补寡核苷酸之间和DNA条形码的第二部分与结合到纳米颗粒上的一些寡核苷酸之间杂交的有效条件下接触DNA条形码,结合到基质上的寡核苷酸,和纳米颗粒;和
观察可检测的变化。
在该实施方案的另一方面,基质包含以阵列方式附着其上的许多类型的寡核苷酸以便允许检测一种或多种不同类型的DNA条形码。
在该实施方案的另一方面,可检测的改变是在基质上形成暗区域。
在该实施方案的另一方面,可检测的变化用光学扫描器观察。
在该实施方案的另一方面,基质与银染剂接触以产生可检测的变化。
在该实施方案的另一方面,DNA条形码在允许DNA条形码与结合到基质上的互补寡核苷酸杂交的有效条件下与基质接触,且随后将结合到基质上的DNA条形码在允许结合到纳米颗粒上的至少一些寡核苷酸与基质上的DNA条形码序列的一部分杂交的有效条件下与具有寡核苷酸与其结合的纳米颗粒接触。
在该实施方案的另一方面,DNA条形码在允许DNA条形码与结合到纳米颗粒上的至少一些寡核苷酸杂交的有效条件下与具有寡核苷酸与其结合的纳米颗粒接触;且随后将结合到纳米颗粒上的DNA条形码在允许结合到纳米颗粒上的DNA条形码序列的至少一部分与结合到基质上的互补寡核苷酸杂交的有效条件下与基质接触。
在该实施方案的另一方面,在接触步骤前扩增DNA条形码。
在该实施方案的另一方面,提供至少两种类型的颗粒复合物探针,第一种类型的探针具有靶分析物第一结合位点的特异性结合补体,第二种类型的探针具有靶分析物第二结合位点的特异性结合补体。
如上所述,核酸和寡核苷酸包括基因,病毒RNA和DNA,细菌DNA,真菌DNA,哺乳动物DNA,cDNA,mRNA,RNA和DNA片断,寡核苷酸,合成寡核苷酸,修饰的寡核苷酸,单链和双链核酸,天然和合成核酸,和抗体核酸。
在本发明的另一实施方案中,提供了包含上述颗粒复合物探针的试剂盒。
在该实施方案的另一方面,提供了一种检测样品中是否存在一种或多种靶分析物的试剂盒,每种靶分析物具有至少两个结合位点,该试剂盒包含:
用于每种靶分析物的至少一种类型的检测探针,每种类型的检测探针包含(i)纳米颗粒;(ii)结合到纳米颗粒上的特异性结合对的一个成员;(iii)与纳米颗粒结合的寡核苷酸;和(iv)具有与该寡核苷酸的至少一部分互补的预定序列的DNA条形码。
在该实施方案的另一方面,该试剂盒包含:
至少一种类型的捕捉探针,它包含(i)基质;和(ii)附着到基质上的第一特异性结合对的第一个成员,其中第一特异性结合对的第一成员结合到靶分析物的第一结合位点上;
至少一种类型的检测探针,它包含(i)纳米颗粒;(ii)附着到纳米颗粒上的第二特异性结合对的第一个成员,其中该第二特异性结合对的第一个成员与靶分析物的第二结合位点结合;(iii)与纳米颗粒结合的至少一种类型的寡核苷酸;和(iv)至少一种类型的DNA条形码,每种类型具有与特定类型的寡核苷酸的至少一部分互补的预定序列。
在该试剂盒中可使用任何合适的基质。优选的是,基质是诸如磁性微颗粒的磁体。
在该实施方案的另一方面,该试剂盒包含:
至少一种类型的捕捉探针,它包含(i)磁性颗粒;(ii)附着到磁性颗粒上的第一特异性结合对的第一个成员,其中第一特异性结合对的第一成员结合到靶分析物的第一结合位点上;
至少一种类型的检测探针,它包含(i)纳米颗粒;(ii)附着到纳米颗粒上的第二特异性结合对的第一个成员,其中该第二特异性结合对的第一个成员与靶分析物的第二结合位点结合;(iii)与纳米颗粒结合的至少一种类型的寡核苷酸;和(iv)至少一种类型的DNA条形码,每种类型具有与特定类型的寡核苷酸的至少一部分互补的预定序列。
在该实施方案的另一方面,该试剂盒包含:
包含颗粒复合物探针的至少一种容器,该探针包含具有寡核苷酸与其结合的颗粒,DNA条形码,和具有与其结合的靶分析物的特异性结合补体的寡核苷酸,其中该DNA条形码具有至少两个部分的序列,附着到颗粒上的至少一些寡核苷酸具有与DNA条形码的第一部分互补的序列,具有与其结合的特异性结合补体的寡核苷酸具有与DNA条形码的第二部分互补的序列,且其中该DNA条形码与附着到颗粒上的至少一些寡核苷酸和与具有与其结合的特异性结合补体的寡核苷酸杂交,和任选一种基质用于观察可检测变化。
在该实施方案的另一方面,该试剂盒包含:
至少一种或多种容器,容器内含有一种类型的颗粒复合物探针,该探针包含具有寡核苷酸与其结合的颗粒,DNA条形码,和具有与其结合的特定靶分析物的特异性结合补体的寡核苷酸,其中(i)该DNA条形码具有至少两个部分的序列,(ii)附着到颗粒上的至少一些寡核苷酸具有与DNA条形码的第一部分互补的序列,(iii)具有与其结合的特异性结合补体的寡核苷酸具有与DNA条形码的第二部分互补的序列,和(iv)每种类型的颗粒复合物探针中的DNA条形码具有不同的序列且用作特定靶分析物的标识符;其中该试剂盒任选包含一种基质用于观察可检测变化。
在该实施方案的另一方面,该试剂盒包含:
至少一对容器和任选用于观察可检测的变化的基质,
该对中的第一容器含有颗粒探针,该探针包含具有寡核苷酸与其结合的颗粒和具有至少两个部分序列的DNA条形码,其中附着到颗粒上的至少一些寡核苷酸具有与DNA条形码的第一部分互补的序列;
该对中的第二容器包含具有与DNA条形码的第二部分互补的序列的寡核苷酸,该寡核苷酸具有可用于共价连接靶分析物的特异性结合对补体的半分子。
在该实施方案的另一方面,该试剂盒包含:
至少两对或更多对容器,
每对中的第一容器含有颗粒复合物探针,该探针包含具有寡核苷酸与其结合的颗粒和具有至少两个部分序列的DNA条形码,其中结合到颗粒上的至少一些寡核苷酸具有与具有至少两个部分的DNA条形码的第一部分互补的序列;和
每对中的第二容器包含具有与DNA条形码的第二部分互补的序列的寡核苷酸,该寡核苷酸具有可用于共价连接靶分析物的特异性结合对补体的半分子,
其中每种类型的颗粒复合物探针的DNA条形码具有不同的序列且用作靶分析物的标识符且其中该试剂盒任选包含一种基质用于观察可检测变化。
在该实施方案的另一方面,该试剂盒包含:
第一容器和至少两对或更多对容器,
第一容器含有颗粒复合物探针,该探针包含具有寡核苷酸与其结合的颗粒;
每对中的第一容器包含具有至少两个部分序列的DNA条形码,其中结合到颗粒上的至少一些寡核苷酸具有与DNA条形码的第一部分互补的序列;和
每对中的第二容器包含具有与DNA条形码的第二部分互补的序列的寡核苷酸,该寡核苷酸具有可用于共价连接靶分析物的特异性结合对补体的半分子,
其中每对容器的第一容器中的DNA条形码用作靶分析物的标识符且具有与另一对容器中的DNA条形码不同的序列,且其中该试剂盒任选包含一种基质用于观察可检测变化。
在该实施方案的另一方面,该试剂盒包含:
用作特定靶分析物存在的标识符的寡核苷酸序列。
上述试剂盒可包含用于组装该测定和用于进行该测定的说明书。
应当注意术语“一”或“一个”实体是指一个或多个该实体。例如,“一个特征”是指一个或多个特征或者至少一个特征。因此,术语“一”(或“一个”),“一个或多个”和“至少一个”在本文中可交换地使用。还应注意术语“包含”,“包括”,和“具有”被可交换地使用。下面的实施例仅用于例证的目的,而不应以任何方式构成对本发明实质或范围的限制。
实施例
实施例1:制备寡核苷酸修饰的金纳米颗粒
A.制备金纳米颗粒
寡核苷酸修饰的13nm Au颗粒按文献记载的方法制备(~110个寡核苷酸/颗粒)18-20。金胶体(直径13nm)按Frens,Nature Phys.Sci.,241,20(1973)和Grabar,Anal.Chem.,67,735(1995)所述通过用柠檬酸盐还原HAuCl4来制备。简单的说,所有玻璃器具在王水(3份HCl,1份HNO3)中清洁,用NanopureH2O漂洗,然后在使用前烤箱干燥。HAuCl4和柠檬酸钠从Aldrich化学公司购买。将HAuCl4的水溶液(1mM,500mL)边搅拌边回流,然后迅速加入50mL 38.8mM的柠檬酸三钠溶液,导致溶液颜色由浅黄变为深红。颜色改变后,将溶液再回流15分钟,冷却到室温,随后通过Micron Separations Inc.的0.45微米尼龙滤器过滤。Au胶体使用Hewlett Packard 8452A二极管阵列分光光度计通过UV-vis分光术和使用日立8100透射电子显微镜通过透射电子显微镜检(TEM)来鉴定。13nm直径金颗粒的典型溶液表现出集中在518-520nm的特征性表面质谱带。当与靶和10-72个核苷酸范围的探针寡核苷酸序列聚集时13nm直径的金颗粒产生可见的颜色变化。
B.寡核苷酸的合成
使用氨基磷酸化学(phosphoramidite chemistry)以单柱方式使用Milligene Expedite DNA合成仪在1微摩尔(micromole)规模上合成寡核苷酸。Eckstein,F.(ed.)Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach(IRLPress,Oxford,1991)。所有溶液从Milligene购买(DNA合成级)。平均偶连效率范围从98到99.8%,最终的二甲氧基三苯甲基(DMT)保护基团不与寡核苷酸分离以便于纯化。
对于3′-巯基-寡核苷酸,巯基修饰剂C3 S-S CPG载体从Glen Research购买且在自动合成仪中使用。最终二甲氧基三苯甲基(DMT)保护基团不除去以便于纯化。合成后,将载体上的寡核苷酸放入1mL浓氨水中在55℃下处理16小时将寡核苷酸与固体载体分离并去掉碱基上的保护基团。
蒸发氨水后,通过制备型反相HPLC使用HP ODS Hypersil柱(5um,250×4mm)用0.03M三乙基乙酸铵(TEAA),pH7和1%/分钟的95%CH3CN/5%0.03M TEAA的梯度以1mL/分钟的流速,同时监测254nm下的DNA紫外信号来纯化该寡核苷酸。DMT保护修饰的12-碱基寡聚体的滞留时间为30分钟。随后通过在80%乙酸溶液中浸泡纯化的寡核苷酸30分钟,接着蒸发可去掉DMT;将寡核苷酸再分散于500uL水中,溶液用乙酸乙酯(3×300uL)萃取。溶剂蒸发后,将寡核苷酸(10 OD′s)再分散于100uL的0.04M DTT,0.17M磷酸盐缓冲液(pH 8)中50℃下过夜以去掉3′二硫化物。该溶液的等分试样(<10 OD′s)通过脱盐NAP-5柱纯化。通过在260nm下的吸光度测定寡核苷酸的含量。通过离子交换HPLC使用DionexNucleopac PA-100柱(250×4mm)用10mM NaOH(pH 12)和2%/分钟的10mMNaOH,1M NaCl梯度以1mL/分钟的流速同时在254nm下监测DNA的紫外信号来评估纯度。观察到滞留时间(Tr)为18.5,18.9和22分钟的3个峰。Tr=22.0分钟的主要单峰占79%的面积,它属于二硫化物。具有18.5和18.9分钟的较短滞留时间的两个峰分别占~9%和12%的面积,它们属于氧化杂质和残留的巯基寡核苷酸。
5′-烷基硫醇修饰的寡核苷酸使用下列方法制备:1)CPG-结合的,脱三苯甲基寡核苷酸使用标准方法在自动DNA合成仪(Expedite)上合成;2)取出CPG-药筒且将一次性注射器与末端相连;3)将200uL在干乙腈(dryacetonitrile)中含20umole 5-巯基-修饰剂C6-氨基磷酸(Glen Research)的溶液与200uL标准“四唑活化剂溶液”混合,且通过一个注射器导入含有寡核苷酸-CPG的药筒中;4)将该溶液通过药筒缓慢来回抽吸10分钟,然后排出,接着用干乙腈(2×1mL)洗涤;5)中间体亚磷酸盐用700uL THF/吡啶/水中的0.02M碘氧化(30秒),接着用乙腈/吡啶(1∶1;2×1mL)和干乙腈洗涤。然后按对于3′-烷基硫醇寡核苷酸所述分离纯化三苯甲基寡核苷酸衍生物;然后通过向干寡核苷酸样品中加入15uL(对于10 OD′s)50mM AgNO3溶液20分钟去掉三苯甲基保护基团,该反应产生乳白色悬液。通过加入20uL 10mg/mL的DTT溶液(5分钟的反应时间)去掉过量的硝酸银,该反应立即形成可通过离心去掉的黄色沉淀。然后将寡核苷酸溶液(<10 OD′s)的等分试样转移到脱盐NAP-5柱上进行纯化。使用上文对于3′烷基硫醇寡核苷酸所述的技术评估所得的5′烷基硫醇寡核苷酸的最终含量和纯度。通过离子交换HPLC观察到两个主要的峰,其滞留时间为19.8分钟(硫醇峰,占16%的面积)和23.5分钟(二硫化物峰,占82%的面积)。
C.将寡核苷酸连接到金纳米颗粒上
将1mL金胶体(17nM)的水溶液与过量(3.68uM)硫醇-寡核苷酸(22个碱基长)的水溶液混合,混合物在室温下静置12-24小时。然后,将溶液加入0.1M NaCl,10mM磷酸盐缓冲液(pH 7)中并使其静置40小时。设计该“老化”步骤用于提高硫醇寡核苷酸的表面覆盖度并置换金表面的寡核苷酸碱基。接着将该溶液在Eppendorf离心管5414中以14,000rpm离心大约25分钟以产生含有大多数寡核苷酸(以260nm下的吸光度表示)以及7-10%的胶体金(以520nm下的吸光度表示)的极浅的粉红色上清,和在管底的致密灰色胶状残留物。去掉上清,将残留物重悬于大约200μL的缓冲液(10mM磷酸盐,0.1M NaCl)中并再离心。去掉上清溶液后,将残留物吸入1.0mL缓冲液(10mM磷酸盐,0.3M NaCl,0.01%NaN3)中。所得的红色为主的溶液在室温下静置几个月,点样到二氧化硅薄层色谱(TLC)平板上(见实施例4),和加入1M NaCl,10mM MgCl2,或含有高浓度鲑精DNA的溶液中时具有稳定性(即,保持红色且不聚集)。
实施例2:制备半抗原修饰的寡核苷酸
半抗原修饰的寡核苷酸使用标准固相DNA合成法对于A1用生物素-三甘醇氨基磷酸(triethylene glycol phosphoramidite)且对于B1用2,4-二硝基苯基-三甘醇氨基磷酸(Glen research)来制备。21
生物素修饰的寡核苷酸使用如下方法来制备:CPG-结合的,脱三苯甲基寡核苷酸使用标准方法21在自动DNA合成仪(Expedite)上合成。然后取出CPG-药筒且将一次性注射器与末端相连。将200uL在干乙腈中含20umole生物素-三甘醇氨基磷酸的溶液与200uL标准“四唑活化剂溶液”混合,且通过一个注射器导入含有寡核苷酸-CPG的药筒中。然后将该溶液通过药筒缓慢来回抽吸10分钟,然后排出,接着用干乙腈(2×1mL)洗涤。随后,中间体亚磷酸盐用700uL THF/吡啶/水中的0.02M碘氧化(30秒),接着用乙腈/吡啶(1∶1;2×1mL)和干乙腈洗涤,随后用氮蒸气干燥柱子。不去掉三苯甲基保护基团,它有助于纯化。将载体上的寡核苷酸放入1mL浓氨水中在55℃下处理16小时将寡核苷酸与固体载体分离并去掉碱基上的保护基团。蒸发氨水后,通过制备型反相HPLC使用HP ODS Hypersil柱(5um,250×4mm)用0.03 M三乙基乙酸铵(TEAA),pH7和1%/分钟的95%CH3CN/5%0.03M TEAA的梯度以1mL/分钟的流速,同时监测254nm下的DNA紫外信号来纯化该寡核苷酸。DMT保护的寡核苷酸的滞留时间为~32分钟。随后通过在80%乙酸溶液中浸泡纯化的寡核苷酸30分钟,接着蒸发可去掉DMT;将寡核苷酸再分散于500uL水中,溶液用乙酸乙酯(3×300uL)萃取并干燥。可使用相同的方法用2,4-二硝基苯基-三甘醇氨基磷酸合成DNP修饰的寡核苷酸。
实施例3:使用纳米颗粒复合物探针的测定法
寡核苷酸修饰的13nm金颗粒按实施例1所述制备。半抗原修饰的寡核苷酸按实施例2所述对于A1用生物素-三甘醇氨基磷酸且对于B1用2,4-二硝基苯基-三甘醇氨基磷酸(Glen research)使用标准固相DNA合成方法来制备21。用于该研究的PBS缓冲液由0.3M NaCl和10mM磷酸盐缓冲液(pH7)组成。IgE和IgG1从Sigma Aldrich(Milwaukee,WI)购买并在使用前溶于含0.05%Tween 20(最终浓度:4.3×10-8b/μl)和背景蛋白(10ug/ml溶菌酶,1%牛血清白蛋白,和5.3ug/ml的抗-地高辛;各10uL)的0.3M PBS缓冲液中。
为了制备该探针,将寡核苷酸修饰的颗粒(13nM,300μl)与半抗原修饰的互补寡核苷酸(10μL 10μM)和生物条形码DNA(10μL 10μM)在室温下杂交2-3h,序列在图1中给出。通过离心(12,000rpm,20分钟)纳米颗粒探针且随后倾析上清去掉未反应的半抗原修饰的寡核苷酸和生物条形码。
在IgE和/或IgG1的典型测定法中,将靶蛋白(各40μl 43μg/ml)加入含探针(~13nM)的溶液中,混合物在37℃下温育50分钟以帮助蛋白质-半抗原复合。为了确保所有成份,特别是互补DNA链之间的完全反应,溶液在-15℃温育20分钟(Boekel Tropicooler Hot/Cold Block Incubator)并在4℃下贮存24小时以促进杂交。如果存在靶蛋白,则发生颗粒聚集,导致随着沉淀作用金纳米颗粒质谱带转移和由红到紫的颜色改变。离心杂交产物(3000rpm 2分钟),分析前倾析含有未反应成份的上清。为了测定存在哪一种蛋白质,可在溶液中进行解链分析,监测260nm下的消光作为温度的函数,图2。当通过上述方法用探针处理IgG1时,溶液变成略带桃红色的蓝色,表明形成了纳米颗粒聚集物。在没有靶但存在背景蛋白的对照实验中,没有可识别的沉淀。溶液的解链分析表明在55℃的解链温度(Tm)下出现突然转变。这是IgG1靶的预期转变,图2A(---)。如果向新的探针溶液中加入IgE,可观察到相同的颜色变化但解链分析提供了Tm为36℃的曲线,即该靶的预期转变,图2A(-)。值得注意的是,当向探针溶液中加入两种蛋白质靶时,溶液变为暗紫色,且解链分析显示出两个不同的转换(transactions)。该曲线的第一个导数(derivative)显示出中心分别在36和55℃下的两个峰,图2B。这证实了可使用从寡核苷酸条形码产生的两种不同的装配形式及其解链特性来区分两种蛋白质靶。
实施例4:使用纳米颗粒复合物探针的测定法
可使用一种该策略以提高上述系统的灵敏度和增加可在一种溶液中检测的靶数目(图3)。用该策略,可通过DNA条形码间接检测该蛋白质靶。12-聚体的寡核苷酸有412种不同的序列,其中许多可用于制备图1A所示的感兴趣的多价蛋白质的条形码。在这种测定法中,其形成的聚集物的解链特性在溶液中不能测量,而应当通过离心(3000rpm 2分钟)将聚集物内的DNA条形码与未反应的探针和靶分子分离。然后通过向溶液中加水使得该聚集物变性,以释放复合的DNA。可用离心过滤装置(Millipore MicroconYM-100,3500rpm 25分钟)将颗粒和蛋白质与DNA条形码分离。一旦分离了DNA条形码,可在寡核苷酸阵列上捕捉它们并可使用许多DNA检测试验之一来鉴定它们(图3)。对于本文所述的涉及IgG1和IgE的例子,在用与感兴趣的条形码的一半互补的寡核苷酸功能化(直径为250μm的点)的载玻片上捕捉该条形码(图1中A3和B3)。如果条形码被寡核苷酸阵列捕捉,与条形码剩余部分互补的DNA-修饰的颗粒可与该阵列杂交(见实验部分)。当通过标准扫描测定方法[11](它涉及用照相显影液处理)显影时,可使用平板扫描器定量该结果,图4。11如果存在IgG1,则仅有针对IgG1设计的点显示出可测量的信号。同样,如果IgE是仅有的蛋白质,则仅有针对它设计的点显示出信号。最后,如果两种蛋白质都存在,则两种点都表现出强信号。
对于扫描测量DNA条形码检测,将DNA/Au纳米颗粒装配物在聚苯乙烯1.5mL小瓶中离心(3000rpm 2分钟),去掉上清。向聚集物中加入PBS缓冲液(700μl)并重复该操作以确保聚集物与未反应的蛋白质和测定成份分离。然后,向含有该聚集物的小瓶中加入500μl水使其变性。制备微阵列并按文献所述的方法使用DNA杂交方法。11,22将分离的DNA条形码与A2-修饰的纳米颗粒或B2-修饰的纳米颗粒(2nM)预混合,与DNA微阵列接触,并在杂交室(GRACE BIO-LABS)中室温下温育3小时。然后用0.3M NaN03和1OnM NaH2P04/Na2HP04缓冲液(pH 7)洗涤该阵列并浸没在银染增强溶液(Sigma)中室温下3分钟。用水洗涤载玻片,然后用平板扫描器分析。
实施例5:使用纳米颗粒复合物探针的测定法
实施生物条形码PCR(BPCR)方案以3aM的灵敏度检测蛋白质靶,即游离前列腺特异性抗原(PSA)(图6),它比目前常规的检测PSA的临床测定法灵敏度高6个数量级(46)。通过向pH 9.0的13nmAu纳米颗粒水溶液(10ml的13nM溶液存在于柠檬酸盐(~38mM)稳定的胶体悬液)中加入多克隆抗-PSA抗体(7μg)来制备纳米颗粒检测探针。20分钟后,将抗-PSA修饰的纳米颗粒与烷基硫醇加帽(alkylthiol-capped)的条形码DNA捕捉链(0.2 OD;5′CAA CTT CAT CCA CGT TCA ACG CTA GTG AAC ACA GTT GTGT-A10-SH 3′SEQ ID NO:9)反应12小时,然后在0.1M NaCl/0.01M磷酸盐缓冲液,pH 7中盐稳定。接着,该溶液用1ml的10%BSA溶液处理20分钟以钝化和稳定金纳米颗粒。最终溶液在4℃下离心1小时(20,000g),去掉上清。重复该离心操作进一步纯化。然后将PSA-特异性的条形码DNA链(1OD;5′ACA CAA CTG TGT TCA CTA GCG TTG AAC GTG GAT GAA GTT G3′SEQ ID NO:10)与连接到纳米颗粒上的条形码DNA捕捉链杂交并使用相似的离心方法纯化。
氨基-功能化的1μm直径磁性颗粒从Polysciences,Inc获得。然后使用商品戊二醛-胺偶连化学将它们连接到蛋白质上。以UV-vis分光术通过比较蛋白质与颗粒偶连前后在270nm下的吸光度测定偶连效率达90%。将该颗粒,磁性捕捉探针在使用前悬浮于40ml的0.1M PBS缓冲液(pH 7.4)中。
在典型的PSA检测实验(图6B)中,将用单克隆抗-PSA抗体功能化的磁性捕捉探针的水分散体(50μl 3mg/ml的磁性探针溶液)与游离PSA(10μl的PSA)的水溶液(0.1M PBS)混合并在37℃下搅拌30分钟(图6B的步骤1)。通过使用磁场可容易地将PSA结合的磁性检测探针与未结合的PSA分离。为了完成磁性分离,将含有测定溶液的1.5ml管在室温下放置在微量离心管分离器(Polysciences,Inc.)中。15秒后,磁性捕捉探针-PSA杂交体集中在管壁上。去掉上清(未结合PSA分子的溶液),在管壁上以沉淀形式存在的磁性捕捉探针重悬于50μl的0.1M PBS中(重复2次)。然后加入用多克隆抗-PSA抗体和杂交体条形码DNA链功能化的纳米颗粒检测探针(50μ l1nM)。将检测探针与固定在捕捉探针上的PSA反应并提供用于信号放大和蛋白质鉴定的DNA链(图6B步骤2)。溶液在37℃下剧烈搅拌30分钟。然后使用磁性分离器用0.3M PBS洗涤磁性颗粒以分离磁性颗粒。该步骤重复4次,每次需要1分钟,仅留下磁性捕捉探针(与PSA结合的纳米颗粒检测探针一起)。最后一次洗涤步骤后,将磁性捕捉探针重悬于Nanopure(18M Ohm)水(50μl)中,将条形码DNA链与纳米颗粒检测探针表面去杂交2分钟。然后使用磁性分离器可容易地将去杂交的条形码DNA与探针分离并收集(图6B步骤3)。
对于条形码DNA扩增(步骤4,图6B),将分离的条形码DNA加入含合适引物的PCR反应混合物(20μl,最终体积)中,然后按照下列方法对该溶液进行热循环。将游离条形码DNA的等分试样(8.9μl)与0.3μl合适的引物(分别为25μM,引物1:5′CAA CTT CAT CCA CGT TCA AC 3′SEQ ID NO:11,引物2:5′ACA CAA CTG TGT TCA CTA GC 3′SEQ ID NO:12),0.4μl DMSO(2%终浓度),和0.1μl Taq DNA聚合酶,即显示出与EasyStartTM系统(5U/μl,Fisher Scientific)相容的聚合酶一起以20μl的最终体积加入EasyStartTMMicro 20 PCR Mix-in-a-Tube(Molecular Bio-Products,San Diego,CA)的顶部蜡层中。PCR反应混合物的终浓度如下:引物1和2,0.37μM;dNTP混合物,0.2mM;PCR缓冲液,1X;和MgCl2,2mM。然后将PCR管装载进热循环仪(GeneAmp 9700,Applied Biosystems)中并在94℃下进行7分钟“热起动”,以94℃30秒,58℃30秒和72℃ 1分钟循环25次,在72℃最后延伸7分钟,接着进行4℃浸泡。
首先进行对照实验评估PCR扩增后的引物二聚体形成。加入二甲亚砜(DMSO)以降低伪杂交引物的解链温度并最小化引物二聚体形成和扩增的可能性(图7,在泳道1-5,和泳道6-10中以0.5%的增量从0至2%)。另外,热循环的次数设定为25次。如图7所示,有条形码DNA扩增子的清楚带(泳道1-5),而在Taq聚合酶存在下当仅有引物进行热循环时没有可观察到的带(泳道6-10)。因此,向所有BPCR反应中加入2%DMSO,因为在该浓度下没有可观察到的痕量带(图7,泳道10)而维持对条形码DNA的扩增。
用溴化乙锭染色条形码DNA扩增子并与凝胶上样染料混合。然后进行凝胶电泳以测定是否发生扩增(图8,A和C组)。对于所有的电泳实验,PCR混合物的等分试样(15μl)用溴化乙锭(1mg)染色,与凝胶电泳上样染料(3μl,6X,Promega,Madison,WI)混合,在1 X TAE流动缓冲液中进行凝胶电泳(2%琼脂糖凝胶,110V,35分钟)。将生物条形码标准(1μl,6μM生物条形码双螺旋)加入凝胶中用作对照。通过将生物条形码DNA加入0.3M PBS中的其互补链中制备生物条形码标准(40-聚体)。使用Kodak DC-120数码照相机和Kodak ID 2.0.2成像软件进行所有凝胶照相和带强度测定。电泳后通过将凝胶浸泡在溴化乙锭中35分钟(0.5μg/ml在1 X TAE流动缓冲液中)也用溴化乙锭染色凝胶带并获得了与电泳前将溴化乙锭加入PCR反应物中相似的定性结果。
溴化乙锭染色带的相对强度允许用于评估PSA的相对浓度(图8,B和D组)。PCR扩增子的染色强度代表了PSA浓度,在泳道3-8中分别为300aM,3fM,30fM,300fM,3pM,和30pM。纳米颗粒探针与磁性探针的非特异性结合可忽略不计,因为当没有PSA时BPCR产生很小的信号(图8,A组,泳道1和2,C组,泳道1)。对于B组,对照带的强度比存在PSA的带低至少8倍。在表示低浓度(图8,B组,泳道2-7分别为3aM至300fM)的PSA检测的图中,相应于3aM的凝胶带(泳道2)比阴性对照(泳道1)的相对强度高2.5倍。
实施例6:使用纳米颗粒复合物探针的测定法
尽管凝胶电泳通常用于分析测定结果,一般来说,扫描测定法提供了更高的灵敏度且比基于凝胶的方法更容易实施。因此,本文报道了扫描测定法的结果。芯片固定的DNA 20-聚体与靶条形码序列(40-聚体)的一半互补,它用于捕捉扩增的条形码DNA序列,且金纳米颗粒用于以夹心测定法形式标记该序列的另一半。扩增的双螺旋条形码DNA必须首先变性以实现在条形码DNA,芯片表面,和金纳米颗粒探针之间的杂交。因此,将条形码DNA扩增子从原始PCR管中取出并加入(5μl)金纳米颗粒探针溶液(5μl,10nM存在于0.3M PBS中)中。该溶液在洁净的0.2ml PCR管中用0.3MPBS(90μl)稀释至最终体积100μl。为了将条形码DNA单链(40-聚体)与纳米颗粒结合的互补体(20-聚体)杂交,将PCR管加入热循环仪中95℃加热3分钟以变性条形码DNA双螺旋,然后冷却到45℃的杂交温度2分钟以便纳米颗粒探针与其互补的条形码DNA序列结合。将该混合物从PCR管中取出并加入固定有捕捉链(20-聚体)的微阵列(GMC 417 Arrayer,GeneticMicrosystems)芯片上。将用于各实验的检测溶液限制在具有100μl杂交孔的阵列(Grace BioLabs,Bend,OR)活性区在湿度控制室中杂交45分钟。杂交后,芯片用0.1M NaNO3/0.01M磷酸盐缓冲液,pH 7.0在45℃下漂洗以去掉过量的金颗粒(重复2次)。然后用银增强溶液对具有杂交纳米颗粒探针的芯片进行银放大(6分钟反应时间,Ted Pella Inc.,Redding,CA),用Nanopure(18MOhm)水漂洗,并使用台式离心机干燥。金纳米颗粒结合后的银放大产生可用Verigene ID系统(Nanosphere,Inc.)读取的灰色斑点,该系统测量从形成的斑点分散的光。11,51通过该方法可容易地检测从300fM到3aM的靶PSA浓度(图9)。3aM的样品相应于在全部样品中有18个蛋白质分子。含有非互补捕捉DNA(5′SH-C6-A10-GGCAGCTCGTGGTGA-3′,SE0 ID NO:13)的对照点没有信号(图9,点样模板)且没有PSA时很少有可识别的信号的观察结果(图9,对照)证实了条形码DNA序列的选择性极佳。
实施例7:使用BPCR检测蛋白质的理论极限
为了检查使用BPCR检测蛋白质的理论更低极限,对用于PCR扩增的系列稀释的条形码DNA浓度进行PCR/凝胶电泳(图10)。存在条形码DNA扩增子时的信号可从对照带中完全识别出来(泳道10),即使向PCR反应物中仅加入30拷贝的条形码DNA(泳道9)。假定每个纳米颗粒探针具有大约50个条形码DNA链,则理论上BPCR可用单个结合的纳米颗粒探针产生检测信号。
实施例8:检测复杂介质中的PSA
为了证实在更相当于临床背景的样品溶液中BPCR扩增方法的适用性,通过将PSA靶溶于山羊血清中进行实施例5和6所述的测定法,在BPCR扩增步骤后检测条形码。将PSA在0.1M PBS中连续稀释,然后加入未稀释的山羊血清(ICN Biomedicals,Inc.,Aurora,Ohio)中。山羊血清可有效地模拟1X生理盐水,(例如,在离子强度和pH方面的任何生物学系统)。
该数据证实了在复杂介质中本发明的方法可检测浓度低到30aM的靶分析物(这里为PSA)。在该浓度下产生的信号可与对照实验清楚地识别(图11)。通过引入用可去掉大多数污染成份的膜过滤条形码DNA样品的任选步骤可降低背景信号。该任选的过滤步骤可用任何已知的方法分离条形码DNA与杂质,例如,通过大小(分子量),形状,电荷,或疏水性/亲水性的分离方法。
实施例9:条形码DNA的直接检测和测量(无-BPCR扩增)
基本上按上文实施例5所述制备金纳米颗粒(NP)探针。简单的说,将抗PSA的多克隆抗体(Abs)(3.5μg)加入pH 9.0的30nm金NPs水溶液(1ml 40pM NP溶液)中。20分钟后,将Ab修饰的NPs与烷基硫醇加帽的条形码DNA捕捉链(30nm的金颗粒为1 OD;5′-CAA CTT CAT CCA CGT TCAACGCTA GTG AAC ACA GTT GTGT-A10-(CH2)3-SH 3′)反应16小时,然后用0.1MNaCl进行盐稳定。该溶液用0.3ml 10%BSA溶液处理30分钟以钝化和稳定金NPs。最终溶液在4℃下离心1小时(20,000g),去掉上清。重复该离心步骤进一步纯化。将最终的NP探针再分散于pH 7.4的0.1M NaCl/0.01M磷酸盐缓冲液中。然后将PSA-特异性条形码DNA链(1 OD;5′-ACA CAACTG TGT TCA CTA GCG TTG AAC GTG GAT GAA GTT G-3′)与连接到NPs上的生物条形码DNA捕捉链杂交并使用相似的离心操作纯化。寡核苷酸装载率通过Demers等的方法测定,参见:L.M.Demers等,Anal.Chem.72,5535(2000)。氨基功能化的1μm直径的MMPs从Polysciences,Inc.获得。使用商品戊二醛-胺偶连化学将MMPs连接到抗PSA的mAbs上。使用UV-vis分光术通过比较蛋白质与MMPs偶连前后在270nm下的吸光度测定偶连效率达90%。使用前将MMPs悬浮于40ml 0.1M PBS缓冲液(pH 7.4)中。
一般按实施例6所述使用基于芯片的测定法直接测量溶液中条形码DNA的量,但是不使用通过BPCR的扩增步骤。由于没有使用PCR,该方法排除了对PCR扩增期间形成的双螺旋DNA进行变性的需要。因此,在蛋白质检测和条形码DNA分离后,将分离的条形码样品的等分试样(10μl)与0.6M PBS(85μl)和13nm的金检测探针(5μl,500pM终浓度,序列同上)混合。将该混合物加入按上述排列有合适的捕捉链的芯片杂交室上的Verigene孔中。将该样品在42℃下温育2小时。温育后,去掉反应混合物,芯片用0.5M NaN03/0.01M磷酸盐缓冲液洗涤以去掉过量的金纳米颗粒。固定于表面的金颗粒用银增强溶液(Ted Pella)染色6分钟,用Nanopure水洗涤,并用Verigene ID系统成像,均按上文所述。
尽管在该情况下使用了30nm金NPs,但是预期13nm金NPs也可用于该方法以直接检测条形码DNA。然而,通过增大蛋白质检测步骤中NP探针的大小,可显著增加每个NP上的DNA链数目,有助于直接检测(理论上,假定100条DNA链附着到一个13nm金NP上,则在每个30nm金NP上有多达532条DNA链)。可调节特定纳米颗粒探针的大小以优化某些方面。
该结果(图12)证实了在无BPCR扩增的条件下使用30nm金NP(20pM)可直接检测浓度低到30attomolar的PSA靶。尽管这表示相对于BPCR扩增方法其灵敏度损失了一个数量级,但是该方法仍然非常灵敏且通过取消PCR步骤显著减少了花费,劳动,和时间。
实施例10:直接检测ZeptoMolar浓度的靶核酸序列
对于该实验,选择与炭疽致死因子相关的DNA序列(5′-GGA TTA TTGTTA AAT ATT GAT AAGGAT-3′;SEQ ID NO:14)作为起始靶,因为该序列对于生物-恐怖主义和生物-战争应用具有重要意义且在文献中有充分的研究。63,67-69向每个20μL检测样品中加入2个对照DNA序列[1μL 10pM(5′-CTATTA TAA TAA AAT ATT TAT ATA GCA-3’;SEQ ID N0:15)和1μL 10pM的对照2(5′-GAA TTA TAG TTA ACT ATA GCT AAG GAT-3′;SEQ ID NO:16)]。使用前,通过杂交将条形码DNA装载到纳米颗粒探针上(400pM的20nm探针;200pM的30nm探针)。条形码DNA以10μM的浓度导入以便在合适的杂交缓冲液中完成杂交。随后离心该颗粒并用PBS缓冲液洗涤。然后将该探针悬浮于合适的贮存缓冲液中,贮存备用。
对于MMPs,聚胺功能化的聚苯乙烯颗粒与烷基硫醇加帽的DNA通过将它们与磺基琥珀酰亚胺基4-[p-马来酰亚胺基苯基]丁酸酯(sulfo-SMPB)双官能接头反应进行连接,该接头与MMPs上的伯胺和形成靶序列的特异性识别结合位点的寡核苷酸上的巯基反应。MMPs在使用前通过向含有它们的溶液中加入10%BSA用牛血清白蛋白钝化。然后离心该探针,用PBS缓冲液洗涤,并以2mg/mL重悬浮以产生活性探针(图13A)。
通过向含有单链形式的靶DNA的溶液中加入50μL MMP探针(2mg/mL)进行该测定。该系统在室温下静置10分钟。10分钟静置后,向溶液中加入50μl NP探针[50μL 400pM(20nm NP探针溶液)或50μl 200pM(30nm NP探针溶液)]并使其杂交50分钟。杂交后,对反应管施加磁场(BioMag multi-6微量离心管分离器,Polysciences,Incorporated,Warrington,PA),它将MMPs和NPs夹持的靶DNA链,以及未反应的MMPs拉到反应管壁上。用PBS缓冲液洗涤几次洗去任何剩下的未反应溶液成份,特别是未与MMPs特异性杂交的NPs。然后去掉磁场并向反应管中加入50μl NANOpure水(Barnstead International,Dubuque,IA),将该系统加热到55℃3分钟以释放条形码DNA。再引入磁场从溶液中去掉所有的MMPs,留下条形码DNA用于检测。
为了分析最终反应溶液中的条形码DNA的量和身份,使用扫描测量法。67扫描测量法是基于芯片的DNA检测法,它依赖于寡核苷酸修饰的金NP探针(5′-TCT CAA CTC GTA GCT-A10-SH-3′-Au;SEQ ID NO:17)和NP-启动的银还原(I)进行信号放大。对于该具体测定法,使用DNA微阵列仪用5′捕捉DNA链(5′-SH-A10-CGT CGC ATT CAG GAT-3′;SEQ ID NO:18)在马来酰亚胺修饰的玻璃芯片上点样(样点直径为175μm,两个样点之间的距离为375μm;GMS 417 Arrayer,Genetic MicroSystems,Woburn,Massachusetts)。表面的无样点区域用A10序列(10μM 5′-SH-AAA AAA AAA A-3′;SEQ IDNO:19)钝化过夜。一旦将芯片表面与条形码DNA溶液接触,向条形码/捕捉DNA修饰的芯片上加入与靶序列溶液混合的NP探针。芯片上的样点用NP探针和靶DNA链标记。然后将点样的芯片与银增强溶液(Ted Pella,Redding,CA)接触进一步增强信号。然后用Verigene ID(识别)系统(Nanosphere,Incorporated,Northbrook,IL)读取显影斑点。Verigene ID系统测量显影斑点的分散光并提供用于分析的永久记录。图14A显示了在“扩增”的条形码DNA检测中使用的20-nm NP探针。从5fM到50aM的靶DNA浓度的斑点强度明显比对照斑点更强。为了测量各浓度的斑点强度,将三个斑点分布在芯片上并用Verigene ID系统成像。用图像软件(AdobePhotoshop)计算斑点的灰度水平且斑点强度照片在图15中显示。该照片显示20-nm NP探针可清楚地检测到大约50aM的靶DNA,但是在5aM浓度下不能与背景信号区分开来。
当使用30nm NP探针进行DNA-BCA检测时,可检测到低到500zM的靶DNA浓度(图14B)。20与30nm NP探针在检测极限上的该区别可能是由于不同表面积的NP探针上条形码DNA链的绝对数目有区别。强度照片表明30-nm NP探针系统在所有样品浓度下比20-nm NP探针系统斑点信号更强(图15)。500zM的20μL样品体积代表了大约10个靶DNA链的总样品数,其灵敏度比得上采用与分子荧光探针偶连的基于PCR方法的测定法。58-60
实施例11
简化的基于报道分子的生物条形码测定法
前列腺特异性抗原(PSA)的检测用作举例性例子,与实施例8一致。本实施例选择PSA是因为PSA的临床有意义水平接近目前用于该癌症标记的检测法的检测极限,因此,需要灵敏度增加的方法。通过将基质与按下文所述制备的检测探针混合以形成随后按下文所述使用的相应试剂“鸡尾酒”可将本实施例推广到检测相同介质中的多个靶分析物。可供选择的实施方案,例如在相同基质上形成针对不同靶分析物的空间分隔的结合区也是在本发明的具体用途中实用且需要的。磁性基质的描述与前面的实施例一致,但其它类型的基质更适合于本发明的具体用途。
a)基质的制备
通过使用标准戊二醛-胺偶连化学将对PSA的一个表位特异性的单克隆抗体(Maine Biotechnologies,Maine,MA)连接到氨基功能化的磁性微粒(Polysciences,Inc.,Warrington,PA)上来制备磁性微粒检测探针(MMPs)。氨基功能化的MMPs(5mg)用5ml含5%戊二醛的吡啶洗涤缓冲液(PWB)在室温下活化3小时。然后磁分离活化的MMPs,并去掉上清。重复该磁分离步骤两次,并将MMPs重悬于PWB中。然后将单克隆抗体(750μg)加入MMPs中,溶液在室温下混合10小时。通过向MMP溶液中加入1mg牛血清白蛋白(BSA)并在室温下再混合10小时封闭非特异性结合位点。重复磁分离步骤两次,并将MMPs重悬于5ml PWB中。然后向所得溶液中加入3ml甘氨酸溶液(1M pH 8.0)消除所有未反应的戊二醛并搅拌30分钟。在磁分离步骤(重复两次)后,将5ml洗涤缓冲液与单克隆抗体功能化的MMPs剧烈混合并再次磁分离MMPs(该洗涤步骤重复3次)。最后,将MMP探针重悬于0.15M磷酸盐缓冲液(PBS)中。通过UV-Vis分光术通过比较蛋白质与MMPs偶连前后在280nm下的吸光度测定偶连效率达到90%。
b)探针的制备
使用1微米直径的氨基功能化的聚苯乙烯微粒(Polysciences,Inc.,Warrington,PA)制备检测探针。1毫升含1.25%氨基功能化聚苯乙烯微粒的水悬液以10,000rpm离心5分钟,并去掉上清。然后将沉淀重悬于PBS中并再次重复该离心步骤。所得的聚苯乙烯颗粒沉淀重悬于1ml pH 7.4的含8%戊二醛的PBS中并在摇床中混合5小时。然后以10,000rpm沉淀颗粒5分钟,并弃去上清(重复该步骤两次)。将所得的沉淀重悬于PBS中并加入10μg PSA的多克隆抗体(Maine Biotechnologies,Maine,MA),使其在摇床中室温下反应过夜。加入的抗体量比完全修饰颗粒表面所需的抗体量少20-30倍,使得在下一步骤中可获得用于将大量寡核苷酸附着在同一颗粒上的表面位点。这些颗粒以10,000 RPM沉淀5分钟并按前面所述通过悬浮和沉淀用PBS洗涤两次。
通过将前一步骤沉淀的活化微粒重悬于1ml 100μM合适的3′氨基功能化的寡核苷酸溶液中并使其在摇床中室温下反应过夜来制备寡核苷酸功能化的微粒。使用下面段落所述的寡核苷酸和方法制备类似于前面发明的“条形码”检测探针。对于靶分析物的鉴定特征没有在核苷酸序列中编码的检测探针,使用荧光标记的3′氨基功能化的具有任意序列的30个碱基的寡核苷酸。反应颗粒以10,000 RPM沉淀5分钟并通过前面所述的悬浮和沉淀用PBS洗涤两次。所得的沉淀重悬于1ml 0.2M乙醇胺中室温下30分钟以钝化微粒上所有未反应的戊二醛位点,以10,000 RPM沉淀5分钟,通过倾析去掉上清。随后加入牛血清白蛋白(10%BSA)溶液以进一步钝化颗粒表面的蛋白质无活性区域。重复两次离心步骤以去掉上清,沉淀重悬于1ml 0.15MPBS溶液中。二硫键连接的可化学裂解的荧光标记的寡核苷酸以相同方式附着到活化微粒上,除了省去与氨基功能化的寡核苷酸的起始反应;用硫代乙醇胺代替钝化步骤中的乙醇胺;和荧光标记的3′硫醇功能化的寡核苷酸通过氧化成二硫键与所得的巯基偶连。
对于前一步骤中戊二醛活化的微粒通过将沉淀的微粒重悬于1ml100μM 3′氨基功能化的寡核苷酸5′CGTCGCATTCAGGATTCTCAACTCGTAGCT-A10-C6-胺3′(SEQ ID NO:20)的溶液中并使其在摇床中室温下反应过夜制备类似于前面发明的“条形码”检测探针。对于所有靶分析物可使用相同寡核苷酸对或单个寡核苷酸。以10,000 RPM沉淀这些颗粒5分钟并按前面所述通过悬浮和沉淀用PBS洗涤两次。所得的沉淀重悬于1ml 0.2M乙醇胺中室温下30分钟以钝化所有未反应的戊二醛位点,以10,000 RPM沉淀5分钟,通过倾析去掉上清。随后加入牛血清白蛋白(10%BSA)溶液进一步钝化颗粒表面的蛋白质无活性区。重复两次离心步骤以去掉上清,将沉淀重悬于1ml 0.15M PBS溶液中。然后将200μl 5mg/ml的聚苯乙烯探针颗粒悬液与200μl 33μM的互补Alexa647-标记(Molecular Probes,Eugene OR)标记的寡核苷酸5′AGCTACGAGTTGAGAATCCTGA-ATGCGACG 3′(SEQ ID NO:21,从Integrated DNA Technologies,Coralville,IA购买,或使用文献记载的方法合成和纯化。35)混合并与聚苯乙烯颗粒上的互补寡核苷酸链杂交。然后在使用前通过悬浮和沉淀洗涤该颗粒。通过沉淀100μl500μg/ml颗粒悬液,弃去上清并通过将沉淀重悬于100μl NANOpure水中去杂交来测定各颗粒上携带的寡核苷酸。通过沉淀去掉颗粒并使用SPEXFluorolog-3光谱荧光计(JOBIN YVON)在50μl荧光微量比色杯(Starna Cells,Inc.,Atascadero,CA)中测量溶液中释放的寡核苷酸的荧光。通过比较测量的样品荧光与纯Alexa647-标记的条形码DNA溶液的校准曲线进行定量。各聚苯乙烯颗粒条形码DNA链的平均数目为~1.1×105。
c)PSA检测(反应)
将10μl临床样品或含PSA的校准标准品(Sigma Chemical Company,Milwaukee,WI)加入1.5mL微量离心管中的50μl用单克隆抗-PSA抗体(500μg/ml)功能化的MMP探针中,溶液在轨道摇床中37℃下摇动23分钟(图18中步骤1)。然后将含测定溶液的试管放在室温下的微量离心管分离器(Polysciences,Inc.)上。15秒后,MMP-PSA杂合体集中在试管壁上。去掉上清,将MMPs重悬于50μl 0.1M PBS中(重复两次)。然后将上述任一类型的检测探针(50μl 1.25mg/ml)加入溶液中(图18中步骤1)并在37℃下剧烈搅拌23分钟。然后将磁性颗粒与反应混合物分离并按上文所述使用磁性分离器用0.15M PBS洗涤两次(图18步骤2)。
d)PSA检测(条形码检测形式)
将磁性颗粒重悬于NANOpure(18MΩ)水(50μl)中使得荧光标记的条形码寡核苷酸与聚苯乙烯探针表面的互补寡核苷酸去杂交。使用磁性分离器从悬液中去掉磁性颗粒(图18步骤3)并使用SPEX Fluorolog-3光谱荧光计(650nm激发/665nm发射用于Alexa647)测量在660-670nm光谱范围内释放的寡核苷酸的总体荧光发射强度。测定在660-670nm光谱范围内的总体发射强度并用作起始介质中PSA浓度的测量值。
e)PSA检测(化学释放形式)
将磁性颗粒重悬于含二硫苏糖醇(DTT)的PBS(50μl)中并加热10分钟达到50℃以便从聚苯乙烯探针表面释放荧光标记的寡核苷酸。使用磁性分离器从悬液中去掉磁性颗粒(图18步骤3)并使用SPEX Fluorolog-3光谱荧光计(650nm激发/665nm发射用于Alexa647)测量在660-670nm光谱范围内释放的寡核苷酸的总体荧光发射强度。测定在660-670nm光谱范围内的总体发射强度并用作起始介质中PSA浓度的测量值。
f)PSA检测(原位检测形式)
将磁性颗粒重悬于PBS中并使用SPEX Fluorolog-3光谱荧光计(650nm激发/665nm发射用于Alexa647)测量颗粒结合的寡核苷酸的总体荧光发射强度。磁性颗粒的荧光也可按照标准程序在流式细胞计中测定。
g)PSA检测(结果)
在30aM到300fM浓度范围内检测的所有靶分析物浓度可容易地与相应的阴性对照区分开(图19A)。重要的是,上述本发明的改进保留了前面发明的30aM靶浓度的灵敏度,但是使得总测定时间从超过4小时减少到不超过50分钟且明显减少了步骤的数目和所需仪器操作的复杂性。
实施例12
化学释放颗粒结合的分子
如图20至22所示设计荧光测定法。信使RNA(mRNA)用作检测的靶分析物。Poly-T-标记的磁珠捕捉3′-Poly A靶分析物使其固定在磁性支持物上并与样品溶液分离。使用的检测试剂由与mRNA靶5’端互补的寡核苷酸功能化的金纳米颗粒组成。互补寡核苷酸同时充当报道分子和选择性结合化合物且通过金硫醇键结合到金纳米颗粒上。向溶液中加入检测试剂使得mRNA靶与互补报道分子结合形成Poly-T-标记珠-靶mRNA分析物-互补寡核苷酸结合化合物-金纳米颗粒的夹心产物。洗涤后,向形成的含水夹心结构中加入二硫苏糖醇(DTT)并加热10分钟达到50℃。水和加热使得通过靶mRNA分子固定在一起的磁性和金纳米颗粒结构去杂交。DTT与13nm金纳米颗粒表面的硫醇化DNA报道分子交换将后者释放进溶液中用于在去掉磁性和金颗粒后的随后检测。与巯基相邻加入荧光分子(Alexa 488)使得溶液释放的探针序列可使用荧光计检测。如图23所示,检测到低至6pM的靶mRNA浓度,它代表了以大约1nM浓度释放的Alexa 488-标记的-mRNA探针链;即在50微升体积中荧光计检测Alexa 488染料的极限。本实施例证实了该要求保护的检测方法在核酸靶检测中的用途与聚合酶链式反应一样灵敏,而不需对靶序列进行酶扩增。
应当明白上面的说明书强调了本发明的某些具体实施方案且对其进行的所有修改或者等同替代都在所提交的权利要求书阐述的本发明的实质和范围内。
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Claims (50)
1.检测样品中存在的一种或多种靶分析物的方法,样品中的各靶分析物具有与特异性结合补体发生特异性结合相互作用的至少两个结合位点,该方法包括步骤:
a)提供至少一种类型的捕捉基质,该捕捉基质具有与其结合的与特异性靶分析物的至少第一结合位点结合的该特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体;
b)提供至少一种类型的微粒检测探针,该微粒检测探针包含具有下列成份与其结合的微粒:(i)特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体和(ii)多个DNA条形码,该DNA条形码任选用报道标记进行标记,其中与微粒检测探针结合的特异性结合补体与该靶分析物的至少一个第二结合位点结合;
c)将捕捉基质与相信含有靶分析物的样品在允许特异性靶分析物与结合到捕捉基质上的特异性结合补体结合的有效条件下接触以便将该靶分析物固定到捕捉基质上;
d)将固定的靶分析物与至少一种类型的微粒检测探针在允许靶分析物与结合到微粒检测探针上的该分析物的特异性结合补体之间结合并在存在靶分析物时在捕捉基质上形成复合物的有效条件下进行接触;
e)任选分离和洗涤捕捉基质以去掉未结合的微粒检测探针;和
f)检测DNA条形码的存在,其中存在该DNA条形码表示样品中存在特异性靶分析物。
2.权利要求1的方法,其中该靶分析物是蛋白质或半抗原且其特异性结合补体是包含单克隆抗体或多克隆抗体的抗体。
3.权利要求1的方法,其中该靶分析物是核酸分子。
4.权利要求1的方法,其中各DNA条形码用可检测的报道基团标记。
5.权利要求1的方法,其中可检测的报道基团包括荧光团,发色团,氧化还原活性基团,具有电标记的基团,放射性基团,催化基团,或拉曼(Raman)标记。
6.权利要求1的方法,其中该微粒用多个DNA条形码标记。
7.权利要求1的方法,还包括在靶分析物固定在其上之后和在捕捉基质与微粒检测探针接触之前洗涤捕捉基质的步骤。
8.权利要求1的方法,其中在所述的检测步骤之前和所述的分离和洗涤步骤之后,还包含步骤:
a)在从微粒检测探针释放DNA条形码的有效条件下处理该复合物;和
b)任选在所述的检测之前扩增该DNA条形码。
9.权利要求8的方法,其中在所述的检测之前将释放的DNA条形码固定在基质上。
10.权利要求1的方法,其中该DNA条形码可直接结合到微粒上。
11.权利要求10的方法,其中该DNA条形码可通过化学释放剂从微粒检测探针上释放出来。
12.权利要求1的方法,其中该微粒还包含与其结合的寡核苷酸且该DNA条形码与结合到微粒上的寡核苷酸的至少一部分杂交。
13.权利要求12的方法,其中该DNA条形码通过去杂交释放出来。
14.权利要求1的方法,其中该捕捉基质是磁性基质。
15.权利要求14的方法,其中所述的分离包括用磁场处理该磁性基质。
16.权利要求15的方法,其中在所述的分离和洗涤步骤之后和所述的检测步骤之前,还包含在释放DNA条形码的有效条件下处理该复合物。
17.权利要求1的方法,其中所述的分离包括过滤,沉淀,浮集,或流体力学。
18.权利要求17的方法,其中该过滤步骤包括去掉不包含DNA条形码的样品成份的膜。
19.权利要求1的方法,其中该微粒是聚合物,玻璃,金属,半导体,或陶瓷。
20.权利要求19的方法,其中该聚合物包含聚苯乙烯。
21.权利要求1的方法,其中该特异性结合对是抗体和抗原。
22.权利要求1的方法,其中该特异性结合对是受体和配体。
23.权利要求1的方法,其中该特异性结合对是酶和竞争性抑制剂。
24.权利要求1的方法,其中该特异性结合对是药物和靶分子。
25.权利要求1的方法,其中该特异性结合对是两条至少部分互补的寡核苷酸链。
26.权利要求1的方法,其中该DNA条形码是生物素标记的。
27.权利要求1的方法,其中该DNA条形码是放射性标记的。
28.权利要求1的方法,其中该DNA条形码是荧光标记的。
29.权利要求1的方法,其中该靶具有超过2个的结合位点。
30.权利要求1的方法,其中提供至少两种类型的微粒检测探针,第一种类型的探针具有靶分析物上第一结合位点的特异性结合补体,第二种类型的探针具有靶分析物上第二结合位点的特异性结合补体。
31.权利要求30的方法,其中提供多个微粒检测探针,每种类型的探针具有靶分析物上不同结合位点的一种特异性结合补体。
32.权利要求1的方法,其中特异性结合补体和靶分析物是特异性结合对的成员。
33.权利要求32的方法,其中特异性结合对的成员包括核酸,寡核苷酸,肽核酸,多肽,抗体,抗原,糖类,蛋白质,肽,氨基酸,激素,类固醇,维生素,药物,病毒,多糖,脂类,脂多糖,糖蛋白,脂蛋白,核蛋白,寡核苷酸,抗体,免疫球蛋白,白蛋白,血红蛋白,凝血因子,肽和蛋白质激素,非肽类激素,白介素,干扰素,细胞因子,包含肿瘤特异性表位的肽,细胞,细胞表面分子,微生物,微生物的碎片,部分,组份,或产物,小有机分子,核酸和寡核苷酸,任何上述物质的代谢产物或抗体。
34.权利要求33的方法,其中核酸和寡核苷酸包括基因,病毒RNA和DNA,细菌DNA,真菌DNA,哺乳动物DNA,cDNA,mRNA,RNA和DNA片断,寡核苷酸,合成寡核苷酸,修饰的寡核苷酸,单链和双链核酸,和天然和合成核酸。
35.根据权利要求1的方法,其中靶分析物是核酸且特异性结合补体是寡核苷酸。
36.根据权利要求1的方法,其中靶分析物是蛋白质或半抗原且特异性结合补体是包含单克隆或多克隆抗体的抗体。
37.根据权利要求1的方法,其中靶分析物是来自基因组DNA样品的序列且特异性结合补体是寡核苷酸,该寡核苷酸具有与该基因组序列的至少一部分互补的序列。
38.权利要求37的方法,其中该基因组DNA是真核,细菌,真菌或病毒DNA。
39.根据权利要求1的方法,其中靶分析物是来自游离DNA样品的序列且特异性结合补体是寡核苷酸,该寡核苷酸具有与该游离DNA序列的至少一部分互补的序列。
40.根据权利要求1的方法,其中该特异性结合补体和靶分析物是抗体-配体对的成员。
41.根据权利要求1的方法,其中除了其第一结合位点外,该靶分析物被修饰成包含第二个结合位点。
42.检测样品中存在的一种或多种靶分析物的方法,样品中的各靶分析物具有与特异性结合补体发生特异性结合相互作用的至少两个结合位点,该方法包括步骤:
a)提供至少一种类型的捕捉基质,该捕捉基质具有与其结合的与特异性靶分析物的至少第一结合位点结合的特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体;
b)提供至少一种类型的微粒检测探针,该微粒检测探针包含具有下列成份与其结合的微粒:(i)特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体和(ii)多个DNA条形码,该DNA条形码用荧光标记,其中与微粒检测探针结合的特异性结合补体与该靶分析物的至少一个第二结合位点结合;
c)将捕捉基质与相信含有靶分析物的样品在允许特异性靶分析物与结合到捕捉基质上的特异性结合补体结合的有效条件下接触以便将该靶分析物固定到捕捉基质上;
d)任选洗涤捕捉基质以去掉未结合的物质;和
e)将固定的靶分析物与至少一种类型的微粒检测探针在允许靶分析物与结合到微粒检测探针上的该分析物的特异性结合补体之间结合并在存在靶分析物时在捕捉基质上形成复合物的有效条件下进行接触;
f)任选分离和洗涤捕捉基质以去掉未结合的微粒检测探针;和
g)检测DNA条形码中荧光信号的存在,其中存在荧光信号表示样品中存在特异性靶分析物。
43.检测样品中存在的一种或多种靶分析物的方法,样品中的各靶分析物具有与特异性结合补体发生特异性结合相互作用的至少两个结合位点,该方法包括步骤:
a)提供至少一种类型的捕捉基质,该捕捉基质具有与其结合的与特异性靶分析物的至少第一结合位点结合的特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体;
b)提供至少一种类型的微粒检测探针,该微粒检测探针包含具有下列成份与其结合的微粒:(i)特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体和(ii)多个DNA条形码,该DNA条形码用荧光标记,其中与微粒检测探针结合的特异性结合补体与该靶分析物的至少一个第二结合位点结合;
c)将捕捉基质与相信含有靶分析物的样品在允许特异性靶分析物与结合到捕捉基质上的特异性结合补体结合的有效条件下接触以便将该靶分析物固定到捕捉基质上;
d)任选洗涤捕捉基质以去掉未结合的物质;和
e)将固定的靶分析物与至少一种类型的微粒检测探针在允许靶分析物与结合到微粒检测探针上的该分析物的特异性结合补体之间结合并在存在靶分析物时在捕捉基质上形成复合物的有效条件下进行接触;
f)任选分离和洗涤捕捉基质以去掉未结合的微粒检测探针;
g)在有效释放该DNA条形码的条件下处理该分离的洗涤捕捉基质;和
h)检测DNA条形码中荧光信号的存在,其中存在DNA条形码的荧光信号表示样品中存在特异性靶分析物。
44.检测样品中存在的一种或多种靶分析物的方法,样品中的各靶分析物具有与特异性结合补体发生特异性结合相互作用的至少两个结合位点,该方法包括步骤:
a)提供至少一种类型的捕捉基质,该捕捉基质具有与其结合的与特异性靶分析物的至少第一结合位点结合的特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体;
b)提供至少一种类型的微粒检测探针,该微粒检测探针包含具有下列成份与其结合的微粒:(i)特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体和(ii)多个DNA条形码,该DNA条形码包含报道标记,其中与微粒检测探针结合的特异性结合补体与该靶分析物的至少一个第二结合位点结合;
c)将捕捉基质与相信含有靶分析物的样品在允许特异性靶分析物与结合到捕捉基质上的特异性结合补体结合的有效条件下接触以便将该靶分析物固定到捕捉基质上;
d)任选洗涤捕捉基质以去掉未结合的物质;和
e)将固定的靶分析物与至少一种类型的微粒检测探针在允许靶分析物与结合到微粒检测探针上的该分析物的特异性结合补体之间结合并在存在靶分析物时在捕捉基质上形成复合物的有效条件下进行接触;
f)任选分离和洗涤捕捉基质以去掉未结合的微粒检测探针;
g)在释放该DNA条形码有效的条件下处理分离的洗涤捕捉基质;和
h)检测DNA条形码报道标记的存在,其中存在DNA条形码的报道标记表示样品中存在特异性靶分析物。
45.检测样品中存在的一种或多种靶分析物的方法,样品中的各靶分析物具有与特异性结合补体发生特异性结合相互作用的至少两个结合位点,该方法包括步骤:
a)提供至少一种类型的捕捉基质,该捕捉基质具有与其结合的与特异性靶分析物的至少第一结合位点结合的特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体;
b)提供至少一种类型的颗粒检测探针,该颗粒检测探针包含具有下列成份与其结合的颗粒:(i)特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体和(ii)多个DNA条形码,该DNA条形码任选用报道标记进行标记,其中与颗粒检测探针结合的特异性结合补体与该靶分析物的至少一个第二结合位点结合;
c)将捕捉基质与相信含有靶分析物的样品在允许特异性靶分析物与结合到捕捉基质上的特异性结合补体结合的有效条件下接触以便将该靶分析物固定到捕捉基质上;
d)任选洗涤捕捉基质以去掉未结合的物质;和
e)将固定的靶分析物与至少一种类型的颗粒检测探针在允许靶分析物与结合到颗粒检测探针上的该分析物的特异性结合补体之间结合并在存在靶分析物时在捕捉基质上形成复合物的有效条件下进行接触;
f)任选分离和洗涤捕捉基质以去掉未结合的颗粒检测探针;
g)通过化学释放剂从该颗粒检测探针释放该DNA条形码;和
h)检测DNA条形码的存在,其中存在DNA条形码表示样品中存在特异性靶分析物。
46.权利要求45的方法,其中该颗粒是纳米颗粒或微粒。
47.检测样品中存在的一种或多种靶分析物的方法,样品中的各靶分析物具有与特异性结合补体发生特异性结合相互作用的至少两个结合位点,该方法包括步骤:
a)提供至少一种类型的可与样品分离的捕捉基质,该捕捉基质具有与其结合的与特异性靶分析物的至少第一结合位点结合的特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体;
b)将捕捉基质与相信含有靶分析物的样品在允许特异性靶分析物与结合到捕捉基质上的特异性结合补体结合的有效条件下接触以便将该靶分析物固定到捕捉基质上;
c)任选从样品中分离捕捉基质和与其结合的靶分析物;
d)提供至少一种类型的颗粒检测探针,该颗粒检测探针包含具有下列成份与其结合的颗粒:(i)特异性靶分析物的至少一个特异性结合补体和(ii)任选用报道标记进行标记的多个寡核苷酸,其中与颗粒检测探针结合的特异性结合补体与该靶分析物的至少一个第二结合位点结合;
e)将固定的靶分析物与至少一种类型的颗粒检测探针在允许靶分析物与结合到颗粒检测探针上的该分析物的特异性结合补体之间结合并在存在靶分析物时在捕捉基质上形成复合物的有效条件下进行接触,其中该复合物包含靶分析物和捕捉基质和颗粒检测探针;
f)任选分离该复合物与未结合的颗粒检测探针;和
g)检测该复合物的存在,其中存在该复合物表示样品中存在特异性靶分析物。
48.权利要求47的方法,其中相应于两个或多个靶分析物的第一结合位点的特异性结合补体结合在相同基质上。
49.权利要求48的方法,其中与基质结合的相应于一个靶分析物的第一结合位点的特异性结合补体与相应于不同靶分析物的第一结合位点的特异性结合补体定位于基质的不同物理区域。
50.权利要求49的方法,其中该寡核苷酸在所述的检测之前从该检测探针上释放出来。
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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