CN111801350A - 用于组织和细胞的多重分析的顺序染色 - Google Patents
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Abstract
提供了包括复数个分析物检测剂的组合物和方法，每个分析物检测剂包括可操作地连接至分析物检测剂的不稳定标签，每个不稳定标签包括与另一个不稳定标签不同的信号，每个分析物检测剂靶向不同分析物。
Description
相关申请
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序列表
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技术领域
本公开涉及与用于对样品中的多种分析物进行顺序染色和分析的检测试剂有关的组合物，以及使用该组合物的方法，尤其涉及用于检测样品中的多种分析物的的试剂和方法，包括不稳定标签。
背景技术
需要通过成像来标签和分析细胞、组织，和生物样本上的多种分析物。当前可用的技术具有缺点，包括在单个样品中可标记和识别的分析物的数量。
当前，基于光学显微镜的技术通常用于探测样本(细胞、组织，和其它生物样本)中的分析物。通常，将这些样品放置在平面基板(例如载玻片)上，并用试剂(例如荧光标记的抗体)探测。但是，样品上只能分辨出几种不同的荧光标记，因此限制了每个样品中可以测定的独立的测量或分析物的数量。常用的技术只能对单个样品中的一到四种分析物进行测量，而最近的一些报告建议最多测量10种分析物(Remark et al.,Science Immunology,2016；Carstens et al,Nature Comm.,2017)。
需要用于分析同一样品上的更多分析物的试剂和方法。
发明内容
在一方面，提供了组合物。所述组合物包括复数个分析物检测剂，每个分析物检测剂包含可操作地连接至所述分析物检测剂的不稳定标签，每个不稳定标签包括与另一个不稳定标签不同的信号，每个分析物检测剂靶向不同分析物。每个不稳定标签是可移除的或可淬灭的，而不会破坏施加了所述复数个分析物检测剂的样品，并允许使用第二复数个分析物检测剂对样品进行进一步分析。
在另一方面，提供了一种用于分析样品的方法。所述方法包括用复数个分析物检测剂标记样品，每个分析物检测剂包括可操作地连接所述分析物检测剂的不稳定标签，每个不稳定标签包括与另一个不稳定标签不同的信号，每个分析物检测剂靶向不同分析物。该方法还包括检测由样品上的复数个分析物检测剂中的每一个所产生的信号，从每种分析物检测剂中去除所述信号；以及重复步骤a-c。
附图说明
图1A示出了根据本公开的SeqProbe的实施例的图。
图1B示出了根据本公开的SeqProbe的替代实施例的图。
图2示出了具有基于金属的交联剂的SeqProbe的实施例的图。
图3A-3D示出了根据本发明的带有不同标签剂的SeqStain探针的实施例的图。
图4A-4D示出了根据本发明的带有不同标签剂的SeqStain探针的实施例的图。
图5A-5B示出了具有用于标签剂的不同附接手段的SeqStain探针的实施例的图。
图6示出了根据本公开的从分析物识别剂去除标签剂的方法的实施例。
图7A-7D示出了根据本公开的去除标签剂的方法。
图8示出了用于减少SeqProbe的信号的方法的实施例。
图9示出了用根据本公开的SeqStain探针对样品进行顺序染色的方法的实施例。
图10示出了可以用根据本公开的SeqStain探针探测的样品的实施例。
图11A-11H示出了用抗体-链霉亲和素-寡核苷酸1偶联物染色的RAW细胞。
图12A和12B示出了寡核苷酸连接(oligo-attached)的抗体。
图13A-13D示出了用两轮SeqStain抗体对同一样品进行染色、脱色和重染色，每轮中有两种抗体。
图14示出了SeqStain探针的分支DNA设计。
图15示出了电场的使用。
图16示出了铰链探针(hinged probe)设计。
图17示出了可用于SeqStain探针的寡核苷酸序列的例子。
图18示出了抗体的马来酰亚胺标记的例子。
图19示出了显示三轮SeqStain的实施例。
图20示出了SeqStain工作流程的实施例。
图21A-21D示出了用SeqStain抗体对细胞进行流式细胞术染色。
图22A-22B和23A-23B示出了SeqStain试剂的实施例。
图24A-24B示出了用SeqStain抗体对细胞进行流式细胞术染色。
图25A-25C示出了三轮染色。
图26示出了根据本公开的SeqStain探针的实施例。
图27A-27B示出了SeqStain工作流程的实施例。
图28示出了SeqStain工作流程的实施例。
图29示出了根据本公开的SeqStain探针的实施例。
图30A-30B示出了用于制备SeqStain抗体的序列。
具体实施方式
除非另有定义，否则与本公开内容结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。总体而言，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学，以及蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学以及杂交有关的术语和技术是本领域众所周知的和常用的。使用标准技术进行重组DNA、寡核苷酸合成，以及组织培养和转化(例如电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书或如本领域所通常完成的或如本文所述进行。前述技术和步骤通常根据本领域公知的常规方法来执行，并且如本公开全文所引用和讨论的各种一般性和更具体的参考文献中所述。参见，例如，Sambrook et al.MolecularCloning:A Laboratory Manual(第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1989))。本文描述的与分析化学、合成有机化学以及药物和药物化学结合使用的命名法以及实验室程序和技术是本领域众所周知的和常用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、制剂、递送，和患者治疗。通常，化学元素根据元素周期表(CAS版本)和《化学与物理手册(theHandbook of Chemistry and Physics)》(第75版，1994)进行标识。另外，有机化学的一般原理在《有机化学》，Thomas Sorrell，University Science Books，Sausalito：1999，和《March's Advanced Organic Chemistry》，第5版，Smith，M.B和J.March主编，John Wiley&Sons，纽约：2001中描述，其全部内容通过引用合并于此。如根据本发明所使用的，除非另外指出，否则本发明所定义的术语应理解为具有本文所定义的含义。
公开了用于检测相同样品上的更多分析物的组合物和方法。该组合物包括顺序探针，在本文中也称为SeqStain探针，其可用于检测同一样品中的多种分析物。该方法使用通过顺序探针检测样品中的分析物并对样品成像的方案。
顺序探针组成
用于检测样品中的分析物的顺序探针(SeqProbe)组合物可以包括分析物识别剂和标签剂/标记。当将顺序探针组合物添加至样品中以进行分析物检测时，标签剂可操作地连接至分析物识别剂。在一些实施方案中，如下文更详细地描述的，标签剂可从分析物识别剂中去除。在去除初始的标签剂后，可以将具有相同类型或不同类型的标签剂和不同的分析物识别剂的其它顺序探针添加到样品中。在一些实施方案中，顺序探针组合物可以包含一种或多种功能化的接头。在一些实施方案中，顺序探针组合物可以包含交联剂。
分析物识别剂
分析物识别剂可包含能够与要检测的分析物结合以相互作用的任何有机或无机分子。分析物识别剂的非限制性实例包括蛋白质、肽、抗体、酶底物、过渡态类似物、辅因子、核苷酸、多核苷酸、适配体、凝集素、小分子、配体、抑制剂、药物，包括能够结合待检测分析物的小分子和其它生物分子以及非生物分子。“抗体”具有其标准含义，并意指本领域已知的全长抗体片段，包括Fab、Fab2、单链抗体(例如scFv)、纳米抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体，或能够特异性结合抗原的抗体的任何其它部分，其可以通过修饰整个抗体或通过使用重组DNA技术从头合成来产生。本文使用的抗体对例如在本文公开的测定中检测到的蛋白质(即生物学样品中的分析物)或用于检测的蛋白质(即结合剂或探针)具有免疫反应性或免疫特异性，因此与之特异性和选择性结合。本文所用的抗体可以对本文所公开的任何分析物、结合剂或表位或其任何组合具有特异性。在某些实施方案中，本公开的分析物本身可以是抗体或其片段。在这种语境中，“特异性结合”是指分析物识别剂基于对分析物上结合区域或表位的识别而与分析物结合。分析物识别剂优选以比结合样品中其它分子更高的结合亲和力识别并结合到分析物。优选地，分析物识别剂唯一地识别并结合到分析物。
标签剂/标记
组合物的标签剂/标记是指可检测的部分。在一些实施方案中，在将顺序探针添加至待测试样品之前，可以将标签剂/标记可操作地连接至分析物识别剂。在一些实施方案中，如下所述，标签剂/标记易于从样品中去除。
合适的标签剂/标记涵盖多种可能的部分。作为非限制性实例，标签剂/标记包括但不限于：a)光学染料，包括有色或荧光染料；b)免疫标记，可以是抗体或抗原；c)酶，诸如碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶；d)同位素标记，可以是放射性同位素或重同位素，e)颗粒，例如胶体、磁性颗粒等，及其组合，例如荧光标记的抗体和化学发光标记的抗体。
在一些实施方案中，标签剂包括寡核苷酸(单链或双链)，例如DNA、RNA、混合物，或肽(例如PNA)，或另一种类型的聚合物。聚合物可以包含一种或多种标记，例如荧光标记，它们可以在相同或不同的链上(如果多于一条)。在一些实施方案中，标签剂还可包含荧光猝灭剂。可选地，该试剂可以包含可酶释放的基团，例如核酸内切酶的识别位点、转录因子(例如ZFP)等。聚合物链也可以是化学惰性的或可伸展的，例如通过DNA聚合酶。聚合物链也可以是直链或支链的，例如支链DNA(bDNA)、树状聚合物或DNA折纸(使用例如M13mp18单链DNA)。
在一些实施方案中，标签剂包括荧光染料。荧光染料可以包括提供荧光信号并且可以根据本文描述的方法和设备使用的任何实体。通常，荧光染料包括共振离域系统(resonance-delocalized system)或芳香环系统，其吸收第一波长的光，并响应该吸收事件发射第二波长的荧光。一系列的此类荧光染料分子是本领域已知的。例如，荧光染料可以选自多种荧光化合物类别中的任何一种，非限制性实例包括呫吨(xanthenes)、罗丹明、荧光素、花青苷(cyanines)、酞菁素、方酸、bodipy染料、香豆素、噁嗪(oxazines)，和carbopyronines。在一些实施例中，例如，在标签剂包含荧光团(例如荧光染料)的情况下，通过用适当的光源激发它们，并用对特征性荧光发射波长敏感的检测器监测它们的荧光，从而检测它们的荧光。在一些实施方案中，标签剂包括荧光染料标记的抗体。
作为非限制性实例，合适的荧光报告染料可包括AlexaFluor染料、6-羧基荧光素(FAM)、四氯-6-羧基荧光素(TET)、2,7-二甲氧基-4,5-二氯6-羧基荧光素(JOE)、六氯-6-羧基荧光素(HEX)、VIC、Cy3、ROX、德克萨斯红(Texas Red)和俄勒冈州绿(Oregon Green)。当如下所述包括时，合适的淬灭剂分子包括6-羧基-四甲基-罗丹明(TAMRA)和黑洞淬灭剂。这些染料可从宾夕法尼亚州费城的Perkin-Elmer、加利福尼亚州福斯特城，的AppliedBiosystems，以及加利福尼亚州瓦伦西亚的Qiagen商购获得。
荧光标签可以以许多不同的方式附接到分析物识别剂。例如，对于作为分析物识别剂的、用荧光标记的寡核苷酸所标签的抗体，可以使用共价键、非共价键(例如通过链霉亲和素)，或通过金属配位键(例如通过基于氯铂的交联剂)将荧光寡核苷酸连接至抗体。在一些实施方案中，标签剂可包括用荧光团(例如可裂解的荧光团)预先标记的DNA、可裂解的DNA，和/或ULS标记的DNA。
在一些实施例中，标签剂包括化学发光标记。化学发光标记可以包括提供光信号并且可以根据本文所述的方法和设备使用的任何实体。合适的标记包括能够与化学发光底物反应的酶，这种反应诱导通过化学发光的光子发射。这种酶通过酶促活性诱导其它分子的化学发光。这样的酶可以包括过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、磷酸酶，或其它具有化学发光底物的酶。在一些实施方式中，化学发光标记可以选自各种类型的鲁米诺标记、异鲁米诺标记等。在一些实施方式中，标签剂包括化学发光标记的抗体。
在一些实施方案中，标签剂可包含生物发光化合物。生物发光是在生物系统中发现的一种化学发光类型，其中催化蛋白提高化学发光反应的效率。通过检测发光的存在来确定生物发光化合物的存在。合适的生物发光化合物包括但不限于萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白。
“检测”(detect,detection)具有其标准含义，并且旨在涵盖包括分析物的存在或不存在、其测量，和/或其表征的检测。
接头
在一些实施方案中，顺序探针组合物可以包含一个或多个接头。接头可用于将标签剂/标记连接至分析物识别剂。接头可以直接连接到标签剂上，或如下所述通过另外的部分连接。接头可以用其它基团例如生物素、叠氮化物等官能化以连接到其它分子。接头也可以是化学或酶不稳定的或可裂解的。
交联剂
在一些实施方案中，顺序探针组合物可以包含一种或多种交联剂，以共价或非共价地连接多个分子。交联剂的非限制性实例包括抗生物素蛋白、链霉亲和素，和二硫化物。
在一些实施方式中，交联剂可用于将生物样品固定至底物，以检测分析物。可以使用双功能化学交联剂被覆底物，以固定样品。所述双功能化学交联剂为，例如，双NHS酯、NHS酯和马来酰亚胺交联剂(例如用于标记抗体/Fab的SMCC))、UV交联剂、连接到马来酰亚胺或NHS基团的UV交联剂、叠氮基团、在末端之一使用斯陶丁格反应(Staudinger’s reaction)进行交联等。也可以使用其它的交联剂。
样品
样品包含要检测的分析物。样品可以是异质的，包含多种成分，即不同的蛋白质。样品可以是天然存在的，是生物材料。例如，样品可以是单个细胞或多个细胞、血液样品、组织样品、皮肤样品、尿液样品、水样品，或土壤样品。在一些实施方案中，样品包含单个细胞的内容物或多个细胞的内容物。在一些实施例中，样品可以是例如来自活检的一个组织切片或多个组织切片。
在一些实施方式中，可以在检测分析物之前对样品进行处理。例如，可以对样品进行裂解步骤、变性步骤、加热步骤、纯化步骤、沉淀步骤、免疫沉淀步骤、柱层析步骤、离心等。在一些实施方案中，可以在天然底物(native substrates)，目标分析物(即蛋白质)，上进行样品的分离和固定化，或也可能经过变性以暴露其内部疏水基团。在一些实施方案中，可以在检测分析物之前将样品固定。在一些实施方案中，使用预先涂覆有试剂的底物，使样品化学黏附至底物。所述试剂为例如PLL(多聚L赖氨酸)或3-氨丙基三乙氧基硅烷(APES)。在某些方面，APES是优选的。为了可视化细胞内分析物和核分析物，使用诸如Triton-X的试剂进行通透作用(permeabilization)。在一些实施方案中，在将样品放置在底物上之后，将附于底物的样品进一步用含有带电分子的溶液处理，其中所述带电分子在样品附近产生带电的环境并减少或防止标签剂的非特异性结合。这种带电分子的例子包括合成的寡核苷酸、DNA样品、剪切的鲑鱼精子DNA、剪切的大肠杆菌DNA等。在一些实施方案中，应用含寡核苷酸/DNA的溶液。在另一个实施方案中，将这种处理多次施用于样品。
在一些实施例中，在电场或电磁场的存在下分析样品。这样的场为样品和标签剂之间结合提供增加的特异性。在每轮分析之后，这样的场还可以改善标签剂的去除。例子包括从灌注腔室的一端到另一端施加电场或使一个或多个表面导电。在一个实施方案中，进一步将离子分子添加到样品中以改善传导。实例包括组氨酸、咪唑，和其它试剂。在一些实施例中，可以将样品放置在氧化铟锡涂覆的玻璃载玻片和/或盖玻片上，以产生导电表面(Sigma Aldrich，编号703192)(Su等、Sosnowski等，另请参见US 20030119028、US6083763)。另外，缓冲液可以包含改善电导率的试剂，例如组氨酸和咪唑。
可以检测到的分析物的非限制性实例包括蛋白质、寡肽和肽、衍生物和类似物，包括含有非天然存在的氨基酸和氨基酸类似物的蛋白质。可以检测到的分析物的其它例子包括碳水化合物、多糖、糖蛋白、病毒、代谢产物、辅因子、核苷酸、多核苷酸、过渡态类似物、抑制剂、药物、营养物质、电解质、激素、生长因子、其它生物分子以及非生物分子，以及所有上述内容的片段和组合。也可以测量pH、离子、二价离子浓度等(Modi等、Saha等、Chakraborty等)。
检测方法
可以通过本领域已知的任何方法进行对分析物的检测，只要可以完成多次染色即可。可以通过使用常规方法和仪器监测信号，以执行分析物检测，非限制性示例包括光电检测器、光电检测器阵列、电荷耦合器件(CCD)阵列等。例如，可以实时、连续地监测信号，以允许使用者快速确定样品中是否存在分析物，以及可选地确定分析物的量或活性。在一些实施方案中，超级二抗(superclonal secondaries)可以用于检测单个分析物(2种或更多种DNA标签的单克隆二级mAb或二级Fab的混合物)。在一些实施方案中，红外染料可以用作附加的检测机制，以增加可以同时读取的mAb的数量。在一些实施例中，化学感测方法与多重成像(multiplex imaging)的组合可以一起使用以获得数据集(参见Kwak等、Baker等人)。在一些实施例中，连续组织切片的多于一个的切片可用于获取数据并改善多重结果的整体数据质量。在某些实施例中，单个组织切片可能不足以提供高质量的数据报告，因此可以使用连续切片来减少变率(variability)。
本文中的“多重”或“多重测定”可以指测定或其它分析方法，其中可以通过使用一种以上的标签剂/标记同时测定多个靶标(例如多种分析物)的存在和/或量；每个靶标均具有至少一个不同的检测特性，例如荧光特性(例如激发波长、发射波长、发射强度、FWHM(半峰全宽)，或荧光寿命)或独特的核酸或蛋白质序列特征。在实施方案中，使用两种或更多种不同的检测剂：一种检测剂(例如1°抗体)可以与一种或多种分析物结合或相互作用以形成检测剂-分析物复合物；第二种检测剂(例如2°抗体)可用于与检测剂-分析物复合物结合或相互作用。
在一些实施方案中，多种检测剂可以与多种底物一起使用以提供颜色多重复用(color-multiplexing)。例如，对所使用的不同的化学发光底物进行选择，使得它们发射不同颜色的光子。通过使用衍射光栅、棱镜、一系列彩色滤光片，或其它手段来实现对不同颜色的选择性检测，从而可以确定沿流体路径的任何位置处正在发射哪些色光子，因此可以确定在每个发射位置存在哪些检测剂。在一些实施方案中，可以顺序提供不同的化学发光试剂，从而允许顺序地检测不同的结合检测剂。
在一些实施方案中，可以检测第一组标签剂，然后将其去除或阻断(block)，然后可以检测一个或多个其它组标签剂。在一些实施方案中，可使用酶(例如核酸外切酶、核酸内切酶和限制酶)来完成第一组标签剂/标记和其它组标签剂的去除。
去除标签剂的试剂的非限制性实例包括：核酸外切酶和核酸内切酶，例如DNA聚合酶、RNA酶、T7核酸外切酶、λ核酸外切酶、大肠杆菌核酸外切酶、核酸外切酶T、核酸外切酶II、核酸外切酶III、核酸外切酶V、绿豆核酸外切酶、微球菌核酸酶、T5核酸外切酶、核酸酶S1、磷酸二酯酶、DNA酶I、T7核酸内切酶、FEN1核酸内切酶、切口核酸内切酶、限制酶(如EcoRV、SmaI、HindIII、BamHI等)、DNA酶II、benzonase、核酸酶P1、核糖核酸酶、核糖核酸酶A、核糖核酸酶H、核糖核酸酶T1。
金属离子依赖性酶可以通过使用螯合剂(例如EDTA)而失活。其它的则可以通过加热或改变pH值而失活。
在一些实施方案中，甲基化依赖性限制性内切酶仅裂解甲基化的DNA。去除标签剂的其它试剂包括核酶、脱氧核酶(DNAzyme)、DNA修复酶、RNA水解试剂，例如金属离子和碱性pH缓冲液。在一些实施方案中，也可以使用高碘酸氧化和断裂乙二醇键。也可以使用TCEP、β-巯基乙醇来还原和断裂二硫键。
在用诸如核酸酶的酶处理之后，可以用大量的酶底物短暂地处理样品，以便淬灭任何剩余的酶或用EDTA灌注以使酶失活，然后与新的顺序探针重新孵育。例如，如果使用DNA酶去除被标记的组织中的荧光标签，则在清洗后，可以用含有足量鲑鱼精子DNA的溶液处理样品，以淬灭并阻断任何剩余的酶。对于肽酶和蛋白酶(例如TEV蛋白酶)，可通过在约40摄氏度下加热或使用碘乙酰胺等方法淬灭该酶。一些酶可使用蛋白酶抑制剂(例如PMSF、AEBSF等)阻断。
另一种方法包括在循环之间使用不同类型的接头——例如在一个循环中使用DNA接头，在另一个循环中使用RNA接头。替代地或另外地，可以使用在一个循环中含有特定的限制酶识别序列的双链DNA，并在下一循环中含有不同的限制酶识别序列的DNA。
被探测的样本(例如细胞和组织切片)可以直接或在其它化学交联剂存在的情况下放置在透光表面(例如玻璃盖玻片或载玻片)上；该化学交联剂可以使样品更稳定地结合到表面。方法包括在放置组织样本之前使用预涂覆表面。可以使用诸如聚-1-赖氨酸的试剂以及双功能化学交联剂进行预涂覆，所述双功能化学交联剂为，例如，双NHS酯、NHS酯和马来酰亚胺交联剂、UV交联剂、连接到马来酰亚胺或NHS基团的UV交联剂、叠氮基团、在末端之一使用斯陶丁格反应进行交联等。在一些实施方案中，可以将样品置于玻璃盖玻片或载玻片上，并置于允许流体交换的腔室中。例子包括放置在灌注腔室的玻璃盖玻片上(例如Warner Instruments的RC-21BRW和RC-21BR)的组织样本(例如福尔马林固定的组织切片)。
使用顺序探针的样品染色方法的非限制性实例包括将组织和细胞放置在玻璃盖玻片上和灌注腔室中，并添加一种或多种荧光标记的抗体。通常，可以将用不同荧光团标签的三种不同的抗体用作一组标签剂，然后对样品进行成像。该方法包括从结合的抗体中除去荧光团，并且如果需要的话，重新阻断和重新制备样品，以用另外的抗体进行探测。可选地，该方法包括获取新图像以用作下一组染色和成像的背景。标记、成像、阻断、重新标记和重新成像步骤可以根据需要重复多次。在一些实施方案中，可以在同一样品上检测至少15种不同的分析物。在一些实施方案中，可以在同一样品上检测至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或超过100种(包括其间的所有整数)不同的分析物。
例子
SeqProbe(顺序探针)的示意图在图1A和1B中示出。顺序探针包括分析物识别剂和一个或多个可移除标签(例如荧光标签)的组合。使用接头将荧光标签附着到分析物识别剂上。接头可以直接连接至荧光标签，也可以通过其它部分连接。接头可以用其它基团(例如生物素)官能化。在接头中存在游离生物素的情况下，可以使用生物素结合剂(例如链霉亲和素)将荧光标签附着到试剂上。此外，接头可以是可裂解的，例如其可以含有可以使用高碘酸盐裂解的二硫键或乙二醇，或光可裂解基团，或可以使用肽酶(例如TEV蛋白酶)选择性裂解的肽序列。荧光标记的寡核苷酸(例如荧光标记的单链或双链DNA)可以通过接头连接到分析物识别剂上。在链霉亲和素连接剂的情况下，寡核苷酸的一端可用生物素功能化，以使其与分析物识别剂连接。因此，一个或多个荧光基团可以一次地连接到单个分析物识别剂上。可以通过用裂解剂(例如核酸外切酶和核酸内切酶)处理，以在这些顺序探针中除去附着的荧光标签。在该例子中，示出了双链DNA，其一条或两条链具有一个或多个荧光色素。图1A还描绘了含有限制酶识别序列(R)的区域。用核酸酶或限制酶处理将释放荧光标签，可以将该荧光标签从固定在待测样品上的顺序探针上洗掉。附着的寡核苷酸也可以用于滚环扩增(rolling circle amplification)或串联重复扩增(tandem repeat amplification)等。另外，寡核苷酸上的荧光标签可以通过可裂解的化学接头(如二硫键或乙二醇)连接。图26描绘了几种不同的SeqStain探针，每个探针具有不同的分析物识别剂和独立的限制位点。图28描绘了具有不同的分析物识别剂和不同的标签剂/标记的SeqStain探针。
SeqProbe的示意图在图2中示出。如图所示，分析物识别剂通过非共价金属配位化学方法与荧光标签连接，所述非共价金属配位化学方法为例如使用铂试剂(例如二氯铂(II)试剂，例如顺铂)。在该实例中，示出了双链DNA，每条链均用荧光团标记。图2还描绘了含有限制酶识别序列的区域。用核酸酶或限制酶的处理将释放荧光标签，可以将该荧光标签从固定在待测样品上的SeqProbe冲洗掉。
具有不同形式的荧光标签的其它SeqProbe设计的示意图示于图3A至图3D中。图3A。示出了荧光标记的寡核苷酸，该寡核苷酸非共价结合到双链寡核苷酸的单链上(例如通过碱基配对)。图3B。荧光标记的寡核苷酸组装成分支DNA(bDNA)系统，使得许多荧光团可以连接到每个接头上。每个寡核苷酸上可以具有一个或多个荧光团。图3C。使用了荧光标记的环状或多联体寡核苷酸。图3D。寡核苷酸用于将荧光标记的肽、蛋白质或其它聚合物附着到分子的其余部分。
具有变化形式的荧光标签的其它SeqProbe设计的示意图示于图4A-4D。图4A示出了荧光标记的单链寡核苷酸，其作为荧光标签。单链寡核苷酸可以采用另外的二级和三级折叠结构，例如发夹环等。其也可以被环化并用于滚环扩增或串联重复扩增等。图4B。荧光标记的肽、小分子、蛋白质或DNA小沟结合剂或DNA大沟结合剂将荧光标签给予与分子其余部分相连的未标记或淬灭剂标记的寡核苷酸。图4C。一种或多种荧光标记的寡核苷酸通过作为接头的另外的寡核苷酸(单链或双链)连接到抗原识别剂。图4D。寡核苷酸用于通过间插的生物素键结合至一种或多种荧光标记的蛋白质，例如链霉亲和素。
图5A和5B示出了另外的SeqProbe设计的示意图，其附着荧光标签的方式各不相同。图5A。荧光标签通过二硫键连接，该二硫键可以使用还原剂(例如TCEP)裂解。图5B。标签通过可使用高碘酸盐裂解的其它可裂解接头(例如乙二醇)或通过光可裂解基团，或通过可使用肽酶(例如TEV蛋白酶)选择性裂解的肽连接。另外，接头可以用荧光团或辣根过氧化物酶修饰。
图6示出了从SeqStain探针去除荧光标记的方法的示意图。
图7A-7D显示了寡核苷酸中的各种修饰的磷酸键，其使寡核苷酸对裂解敏感。示出了对pH变化敏感的磷酰胺键(phosphoramidate linkages)，使得小于6.0的pH令这些结合不稳定。该键可用于裂解荧光标签的寡核苷酸。
减少SeqStain探针中荧光信号的另一种方法的示意图描述于图8中。此处，通过引物延伸或通过寡核苷酸连接添加淬灭剂分子可导致SeqStain探针发出的荧光被淬灭，从而可在新的样品染色循环中获得新的荧光信号。
图9示出了使用与分析物检测剂连接的可裂解的荧光团的SeqStain方法的示意图。作为示例，将玻璃盖玻片上的组织切片放置在成像显微镜顶部的流动腔室中。接下来，将通过双链DNA与荧光标签连接的一组抗体(每个标签都标有独特的荧光团)引入腔室中，并孵育一定的时间。随后，对腔室进行清洗和成像，以记录每种抗体的位置。接下来，通过用DNA酶处理，移除抗体上的荧光团。随后对腔室进行清洗，如果需要，对腔室进行重新成像以获取组织的新初始图像。随后，可以开始新的抗体孵育周期。该连续的染色、成像和荧光标记去除步骤可以根据需要进行多次，以对生物样本进行多重分析。
在图10中示出了将样本放置在成像平面上的示意图。表面可以是任何形状和大小，例如圆形、正方形或矩形。另外，可以将一个或多个样本放置在单个表面上，以便可以在SeqStain方案(protocol)中处理一个或多个样本。
实施例：培养的RAW细胞的顺序染色：
用聚-L-赖氨酸被覆25mm的圆形玻璃盖玻片，并将盖玻片置于组织培养皿中，以在37℃培养箱中过夜培养盖玻片上的鼠RAW 264.7巨噬细胞。随后，用PBS洗涤细胞单层，并在室温下使用4％多聚甲醛溶液将细胞固定20分钟。将细胞用PBS洗涤两次，并在室温下用0.5％Triton-X透化15分钟。随后，将细胞用PBS洗涤两次，并将盖玻片安装到灌注腔室中以进行成像测定。通过在两个玻璃盖玻片之间放置一个橡胶垫圈来创建腔室。将腔室连接到用于灌注的入口管和出口管。随后，通过用含有在PBS中的4％BSA和100ug/ml的剪切的鲑鱼精子DNA的阻断缓冲液灌注该腔室，以阻断细胞，并在室温下孵育1小时。另外，通过在室温下以1：1：3的摩尔比将生物素化的抗CD11b抗体(20nM)与纯化的链霉亲和素和生物素化的双链DNA(dsDNA)寡核苷酸1(oligo1)混合来制备标记混合物。寡核苷酸1包含一个末端荧光团AlexaFlour488(AF488)和一个工程化的EcoRV限制位点。阻断后，通过用抗CD11b抗体-寡核苷酸AF488复合物(CD11b-oligoAF488)灌注，并在室温下孵育30分钟，对腔室进行染色。用PBS-T连续洗涤细胞5分钟，然后对其进行CD11b染色的成像(图11A)。结果显示这些细胞上CD11b的高荧光染色。随后，我们通过用限制性核酸内切酶处理样品，以移除连接抗体的荧光团。用含有EcoRV限制酶的PBS灌注腔室，以在EcoRV限制位点切割寡核苷酸(oligo)。我们通过成像监测了局部荧光信号的消失。此处，限制酶消化后每5分钟对细胞成像一次。出人意料的是，如通过每5分钟成像一次所示(图11B-11F)，仅以该浓度灌注酶即导致信号的逐渐消除。更令人惊讶的是，灌注和清洗导致荧光信号的完全去除(图11G)。随后，通过向腔室中灌注含有0.5M EDTA的溶液，使限制酶失活。为了确定细胞是否可以被重新染色，我们用抗CD11b抗体-寡核苷酸AF488复合物(CD11b-oligoAF488)重新灌注细胞，并在室温下孵育30分钟。更令人惊讶的是，成像结果表明该试剂能够重新染色细胞(图11H)，表明灌注方案和测定不会导致细胞丢失。可以使用针对其它分析物的抗体重复该过程多次。
抗体-寡核苷酸偶联物的示例设计：图12示出了分别使用纯化的链霉亲和素，使生物素化的抗CD11b和抗CD45抗体偶联至生物素化的寡核苷酸1AF488和寡核苷酸2AF594。寡核苷酸1包含EcoRV限制位点，而寡核苷酸2(寡核苷酸2)包含SmaI限制位点。
实施例：小鼠脾细胞的顺序多重染色：从新鲜分离的野生型C57BL/6小鼠的脾中制备脾细胞的单细胞悬液。使用BD pharmlyse缓冲液系统裂解红细胞，并用完全培养基将脾细胞洗涤两次。最后一次洗涤后，对细胞进行计数，并用4％多聚甲醛固定。将固定的细胞以每孔2x106个细胞铺在6孔组织培养板上的APES涂覆的玻璃盖玻片上，并在室温下孵育30分钟。然后将细胞用PBS洗涤两次，并用0.5％Triton-X透化15分钟。用PBS洗涤细胞两次，并固定在灌注腔室上。用含有4％BSA和100ug/ml剪切的鲑鱼精子DNA的阻断缓冲液灌注腔室，并孵育1小时。将生物素化的抗CD11b抗体分别以20nM的浓度与纯化的链霉亲和素和生物素化的dsDNA寡核苷酸1以1：1：3的摩尔比偶联。在另一个单独的反应中，将生物素化的抗CD45抗体以20nM的浓度与纯化的链霉亲和素和生物素化的dsDNA寡核苷酸2以1：1：3的摩尔比偶联。寡核苷酸1包含工程化的EcoRV限制位点和末端的Alexflour488，而寡核苷酸2包含工程化的SmaI限制位点和末端的Alexaflour594。阻断反应后，在包含位于玻璃盖玻片上的脾细胞的腔室中灌注含有与寡核苷酸偶联的抗CD11b和抗CD45抗体的溶液。对脾细胞进行CD11b和CD45染色的成像(图13A)，并显示良好的染色。成像后，向细胞灌注含有EcoRV和SmaI酶的双重消化混合物，每5分钟对细胞成像一次。出人意料的是，用限制酶消化20分钟后，局部荧光信号显著降低，洗涤完全移除了该信号(图13B)。接下来，通过灌注0.5M EDTA使限制酶失活，然后孵育10分钟。接下来，我们用一组新的抗体对这些细胞进行染色。对于这一轮染色，如上文所述，分别使用纯化的链霉亲和素和生物素化的寡核苷酸1AF488和生物素化的寡核苷酸2AF594制备生物素化的抗CD3抗体和生物素化的抗CD4抗体。用含有两种抗体的溶液灌注包含位于玻璃盖玻片上的脾细胞的腔室，并对细胞进行CD3和CD4染色的成像。结果显示出两者均高度染色(图13C)。成像后，用含有EcoRV和SmaI酶的双重消化混合物灌注细胞。每5分钟对细胞成像一次。再次，令人惊讶地，在核酸内切酶消化和洗涤之后，两种信号均减弱(图13D)。此处的结果清楚地表明，这一新技术可以对固定的样品进行顺序染色和荧光信号去除，而不会对这些试剂中的样品造成任何损失或伤害。令人惊讶地发现，核酸内切酶处理没有破坏固定的样品。
分支DNA(bDNA)的示例设计和序列(图14)。
示例：使用电场。样品可以多种方式施加到导电表面上。整个表面可以由导电材料制成(图15A)，也可以仅一部分导电(图15B)。或者，样品可以在不导电的表面上，而腔室的其它部分可以存在导电材料(图15C)。一个示例图示出了在存在电流的情况下如何检查样品(图15D)。在一个实施方式中，腔室还可包含温度控制模块，例如加热器或冷却器。
例子：可用于将多个荧光标记的标签或探针连接至分析物识别剂(例如抗体)的铰链探针设计的示意图(图16)。在一个实施方案中，使用包含可选的限制位点序列的多个连接的寡核苷酸制备此类可裂解的探针。多个寡核苷酸可使用一个或多个铰链探针连接在一起。示例的寡核苷酸序列如图17所示。
实施例：用于SeqStain方法的抗体制备。使用马来酰亚胺-巯基化学方法将抗体偶联至单克隆抗体接头DNA寡核苷酸(mab linker DNA oligo)。作为非限制性实例，所测试的抗体是抗CD45、抗CD11b、抗高尔基体97(anti-Golgin 97)、抗Ki67。对于这些实施例中使用的抗体的马来酰亚胺标记，将马来酰亚胺修饰的寡核苷酸或寡核苷酸混合物与抗体(或Fab)在作为二硫化物还原剂的TCEP的存在下共同孵育。这导致抗体与(标记的或未标记的)一个或多个寡核苷酸有效地交联。通过柱过滤除去未反应的试剂。替代地，可以通过顺序反应生成抗体-DNA偶联物：首先用TCEP还原抗体，然后使用过滤柱纯化，然后与一个或多个马来酰亚胺修饰的寡核苷酸反应。
通过使样品在变性的4-12％SDS凝胶上电泳来验证偶联。相对于非偶联抗体，对应于单克隆抗体接头分子量的结合的抗体的凝胶移位显示偶联。偶联后，将抗体退火至包含对接(docking)寡核苷酸和荧光染料(fluorochrome)寡核苷酸的复合物。对接寡核苷酸和荧光染料寡核苷酸以1：5的摩尔比进行了预退火。通过凝胶变动测定(gel shift assay)验证了成功退火，在该测定中，样品在4％琼脂糖凝胶上和40V下电泳3小时。
SeqStain实施例：RAW细胞用抗CD45抗体染色。使用马来酰亚胺-巯基化学法将抗CD45抗体缀合至含有限制位点和荧光染料AF488的DNA寡核苷酸。用该抗体(抗CD45SeqStain抗体)对RAW细胞进行染色，并使用限制酶EcoRV或DNA酶I进行脱色。作为对照，没有抗体的DNA寡核苷酸复合物用于染色RAW细胞。通过荧光成像检测了抗CD45SeqStain抗体对RAW细胞的成功染色，并且通过EcoRV和DNA酶I消化都可以去除信号。脱色后和洗涤后的图像均显示信号的去除。
在图21A-21D中示出了抗CD45和抗CD11 SeqStaining的流式细胞术验证。使用马来酰亚胺-巯基化学法将抗CD45抗体和抗CD11b抗体偶联至含有限制位点和分别含有荧光染料AF488和AF594的DNA寡核苷酸。RAW细胞通过抗CD45 SeqStain抗体的流进行染色。作为对照，使用了没有抗体的DNA寡核苷酸复合物(图21A)。染色的直方图显示在图21B中。类似地，在图21C和21D中示出用AF594染色抗CD11b SeqStain抗体。
使用SeqStain方法，用两轮抗体对RAW细胞进行染色。使用马来酰亚胺-巯基化学方法将抗CD45、抗CD11b、抗乙酰化微管蛋白，和抗黏着斑蛋白抗体偶联至含有限制位点和荧光染料AF488或AF594的DNA寡核苷酸。在第一轮中，RAW细胞用带有AF488的抗CD45SeqStain抗体和带有AF594的抗CD11b抗体染色，并通过荧光成像观察阳性染色。使用DNA酶I脱色，成功去除了染色，并且在脱色后和洗涤后观察到无染色。在第2轮中，同一样品分别用带有AF88的抗乙酰化微管蛋白SeqStain抗体和带有AF594的抗黏着斑蛋白SeqStain抗体染色，并通过荧光成像观察阳性染色。使用DNA酶I脱色，成功去除了染色，并且在第二轮染色后观察到了在脱色后和洗涤后的无染色。
SeqStain方法与常规方法的比较。使用马来酰亚胺-巯基化学法将抗乙酰化的微管蛋白和抗Ki-67抗体偶联到含有限制位点和荧光染料AF488的DNA寡核苷酸上。用SeqStain抗体或乙酰化微管蛋白或核Ki-67的常规方法对HeLa细胞进行染色，两种方法均观察到相似的荧光染色。
仅用DNA溶液阻断有助于减少背景。用带有AF488的抗乙酰化微管蛋白SeqStain抗体染色RAW细胞。在染色之前，阻断可一步完成，该步骤包含1％BSA和3纳摩尔/ml的阻断DNA混合物；或者通过两步进行阻断，使用包含1％BSA的PBS溶液处理45分钟，然后使用仅包含DNA混合物的阻断溶液(含0.5M NaCl的PBS中的100ug/ml鲑鱼精子DNA和3纳摩尔/ml阻断寡核苷酸)处理45分钟，之后染色。在两步法中，仅包含寡核苷酸的阻断溶液比用寡核苷酸和其它试剂(例如BSA)的混合物的阻断更好。
为SeqStain准备抗体不会干扰抗体功能。将没有荧光染料AF488的抗CD45SeqStain抗体用于两步间接免疫荧光法，以对RAW细胞进行染色；该两步间接免疫荧光法使用抗大鼠二次AF488抗体(anti-rat secondary AF488 antibody)。与未修饰的抗体相比，未观察到由于偶联的抗体修饰引起的染色损失。
DBCO-叠氮化物点击化学SeqStain抗体制备。如图22A所示，使用DBCO-叠氮化物点击化学方法，将抗大鼠Fab或抗小鼠Fab偶联至单克隆抗体接头DNA寡核苷酸。通过使样品在变性的4-12％SDS凝胶上电泳来验证偶联。对应于单克隆抗体接头分子量的凝胶移位显示成功的偶联。
DBCO-叠氮化物点击化学SeqStain方法与常规方法的比较。使用DBCO-叠氮化物点击化学方法将抗CD11b抗体偶联到含有限制位点和荧光染料AF488的DNA寡核苷酸上。RAW细胞用SeqStain抗体或CD11b的常规方法染色。作为对照，没有抗体的DNA寡核苷酸复合物用于染色RAW细胞。两种方法均观察到相似的荧光染色。
用抗CD11b SeqStain抗体染色并脱色的稳定表达CD11b的K562细胞。使用DBCO-叠氮化物点击化学方法将抗CD11b抗体与含有限制位点和荧光染料AF488的DNA寡核苷酸偶联。用抗CD11b SeqStain抗体对表达CD11b的K562细胞染色，并通过荧光成像观察阳性染色。使用限制酶EcoRV对细胞进行脱色。作为对照，亲本K562细胞用抗CD11b SeqStain抗体染色。
表达CD11b的K562细胞在有或没有激活的情况下的流式染色。使用DBCO-叠氮化物点击化学方法将抗小鼠Fab偶联至含有限制位点和荧光染料AF647的DNA寡核苷酸上。使用了抗CD11b的抗体的不同克隆，例如44A、mab24。在通过MnCl2激活整联蛋白后，CD11b表达抗CD11b(mab24)抗体的表位。表达CD11b的K562细胞在被激活时优先对以1：2的摩尔比与SeqStain Fab连接的抗CD11b(mab24)抗体进行染色(图24A，左图)。然而，无论激活状态如何，它们均可以很好地对以1：2的摩尔比与SeqStain Fab偶联的抗CD11b(44A)进行染色(图24A，右图)。图24B示出了单独与SeqStain Fab相比，与SeqStain Fab偶联的抗体的染色。图24B显示当未与抗体偶联时，SeqStain Fab显示无染色。
使用SeqStain方法，用三轮抗体染色表达CD11b的K562细胞。使用DBCO-叠氮化物点击化学方法将抗小鼠和抗大鼠Fab偶联到含有限制位点和荧光染料AF488或AF594的DNA寡核苷酸上。使用了抗CD11b的不同抗体的克隆，例如44A、IB4，和M1/70。抗体44A和M170分别以1：2的摩尔比与带有AF488的抗小鼠和抗大鼠SeqStain Fab偶联。而IB4抗体则以1：2的摩尔比与带有AF594的抗小鼠SeqStain Fab偶联。表达CD11b的K562细胞用与SeqStain Fab偶联的抗CD11b(44A)抗体染色，然后使用EcoRV限制酶脱色(图25A)。使用偶联至SeqStainFab的抗CD11b(IB4)(图25B)和偶联至SeqStain Fab的抗CD11b(M1/70)(图25C)进行另外两轮染色和脱色。在SeqStain中使用Fab的优点是Fab可以与抗体偶联并立即使用，从而无需为每种抗体准备SeqStain。在一些实施方案中，可以使用TCO-Tz点击化学。
用抗CD11b SeqStain抗体染色RAW细胞，并脱色。使用链霉亲和素，以抗体：链霉亲和素：DNA寡核苷酸为1：1：3的比例，将生物素化的抗CD11b抗体偶联至含有限制位点和荧光染料AF488的生物素化的DNA寡核苷酸。用抗CD11b SeqStain抗体染色RAW细胞，并通过荧光成像观察阳性染色。使用限制酶EcoRV对细胞进行脱色。
以上附图和公开内容是说明性的而非穷举的。说明书将向本领域普通技术人员提出许多变型和替代方案。所有这些变型和替代方案旨在被包含在所附权利要求的范围内。本领域技术人员可以认识到本文描述的特定实施例的其它等同方案，这些等同方案也意在被所附权利要求书所涵盖。
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序列表
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维尼特·古普塔
阿努格拉哈·拉贾戈帕兰
<120> 用于组织和细胞的多重分析的顺序染色
<130> 14904-446 R566
<150> 62/623,866
<151> 2018-01-30
<160> 27
<170> PatentIn 版本3.5
<210> 1
<211> 314
<212> DNA
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<223> 标记探针
<220>
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<213> 人造序列
<220>
<223> 接头寡核苷酸
<400> 9
acgggatatc agttacggga tatcagtt 28
<210> 10
<211> 135
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> clamp oligo1
<400> 10
aactgatatc ccgtaactga tatcccgttt tttttagcaa cagttatctc ggcaccattt 60
agcaacagtt atctcggcac catttagcaa cagttatctc ggcaccattt ttttgtatgc 120
cagaataatc atcgc 135
<210> 11
<211> 100
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> claimp oligo2
<400> 11
gtatgccaga ataatcatcg ctttttttag caacagttat ctcggcacca tttagcaaca 60
gttatctcgg caccatttag caacagttat ctcggcacca 100
<210> 12
<211> 93
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 主寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> n = 5-氨基修饰的胸苷或5-羟基修饰的胸苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n = 5-氨基修饰的胸苷或5-羟基修饰的胸苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> n = 5-氨基修饰的胸苷或5-羟基修饰的胸苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> n = 5-氨基修饰的胸苷或5-羟基修饰的胸苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> n = 5-氨基修饰的胸苷或5-羟基修饰的胸苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> n = 5-氨基修饰的胸苷或5-羟基修饰的胸苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> n = 5-氨基修饰的胸苷或5-羟基修饰的胸苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> n = 5-氨基修饰的胸苷或5-羟基修饰的胸苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)..(42)
<223> n = 5-氨基修饰的胸苷或5-羟基修饰的胸苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> n = 5-氨基修饰的胸苷或5-羟基修饰的胸苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (48)..(48)
<223> n = 5-氨基修饰的胸苷或5-羟基修饰的胸苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(51)
<223> n = 5-氨基修饰的胸苷或5-羟基修饰的胸苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(54)
<223> n = 5-氨基修饰的胸苷或5-羟基修饰的胸苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (57)..(57)
<223> n = 5-氨基修饰的胸苷或5-羟基修饰的胸苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (60)..(60)
<223> n = 5-氨基修饰的胸苷或5-羟基修饰的胸苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(63)
<223> n = 5-氨基修饰的胸苷或5-羟基修饰的胸苷
<400> 12
ttgacagctg ccggattntt nttnttnttn ttnttnttnt tnttnttntt nttnttnttn 60
ttnttttttt ttggtgccga gataactgtt gct 93
<210> 13
<211> 63
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 锚寡核苷酸
<400> 13
tttttgacag ctgccggatt tttttttgac agctgccgga tttttttttg acagctgccg 60
gat 63
<210> 14
<211> 15
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 标记的寡核苷酸探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' label
<400> 14
tccggcagct gtcaa 15
<210> 15
<211> 15
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 标记的寡核苷酸探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' AF488
<400> 15
tccggcagct gtcaa 15
<210> 16
<211> 15
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 标记探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' 生物素
<400> 16
tccggcagct gtcaa 15
<210> 17
<211> 15
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 标记的寡核苷酸探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' AF594
<400> 17
tccggcagct gtcaa 15
<210> 18
<211> 48
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 铰链寡核苷酸
<400> 18
gcgttgatta ttctggcata caaaaaagcg ttgattattc tggcatac 48
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> Mab接头
<400> 19
ccgtagcaga tatcacagc 19
<210> 20
<211> 90
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 对接寡核苷酸
<400> 20
ttgacagctg ccggattgac agctgccgga ttgacagctg ccggattgac agctgccgga 60
ttgacagctg ccggagctgt gatatctgct 90
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> Mab接头
<400> 21
ccgtagcacc cgggacagc 19
<210> 22
<211> 90
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 对接寡核苷酸
<400> 22
ttgacagctg ccggattgac agctgccgga ttgacagctg ccggattgac agctgccgga 60
ttgacagctg ccggagctgt cccgggtgct 90
<210> 23
<211> 15
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> Fluor Oligo
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 3' AF488
<400> 23
tccggcagct gtcaa 15
<210> 24
<211> 15
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 荧光染料寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 3' AF594
<400> 24
tccggcagct gtcaa 15
<210> 25
<211> 42
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> Mab接头
<400> 25
acgggatatc agatacggga tatcagatac gggatatcag at 42
<210> 26
<211> 14
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 荧光染料寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 3' AF488
<400> 26
atctgatatc ccgt 14
<210> 27
<211> 14
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 荧光染料寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 3' AF594
<400> 27
atctgatatc ccgt 14
Claims (25)
1.一种组合物，所述组合物包括：
复数个分析物检测剂，每个分析物检测剂包含可操作地连接至所述分析物检测剂的不稳定标签，每个不稳定标签包括与另一个不稳定标签不同的信号，每个分析物检测剂靶向不同分析物；
每个不稳定标签是可移除的或可淬灭的，而不会破坏施加了所述复数个分析物检测剂的样品，并允许使用第二复数个分析物检测剂对所述样品进行进一步分析。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中至少一个不稳定标签包含荧光团。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述复数个分析物检测剂中的至少一个包括寡核苷酸。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述寡核苷酸是单链的或双链的。
5.根据权利要求3所述的组合物，其中所述寡核苷酸包含荧光标记。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中至少一个不稳定标签是通过核酸内切酶、核酸外切酶、DNA酶、RNA酶、聚合酶、TCEP、β-巯基乙醇、高碘酸盐、pH变化、肽酶，或蛋白酶可去除的。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中至少一个不稳定标签是可淬灭的。
8.根据权利要求1的组合物，其中至少一个所述分析物检测剂还包含接头。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述复数个分析物检测剂的至少一个包括交联剂。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述交联剂包括基于金属的交联剂、抗生物素蛋白、链霉亲和素，或二硫化物。
11.一种用于分析样品的方法，所述方法包括：
(a)用复数个分析物检测剂标记样品，每个分析物检测剂包括可操作地连接所述分析物检测剂的不稳定标签，每个不稳定标签包括与另一个不稳定标签不同的信号，每个分析物检测剂靶向不同分析物；
(b)检测由所述样品上的所述复数个分析物检测剂中的每一个所产生的信号；
(c)从每种分析物检测剂中去除所述信号；以及
(d)重复步骤a-c。
12.根据权利要求11所述的方法，还包括重复步骤a-c至少另外一次。
13.根据权利要求11所述的方法，还包括将所述样品放置在平面上。
14.根据权利要求11所述的方法，还包括将所述样品放置在允许流体交换的腔室中。
15.根据权利要求11所述的方法，包括通过成像检测所述信号。
16.根据权利要求11所述的方法，包括通过用靶向所述标签上的不稳定连接的裂解剂处理所述样品来去除信号。
17.根据权利要求11所述的方法，包括通过淬灭移除所述信号。
18.根据权利要求13所述的方法，还包括将交联剂添加到所述平面。
19.根据权利要求11所述的方法，进一步包括在移除所述信号之后阻断所述样品。
20.根据权利要求11所述的方法，包括检测来自15种不同分析物的至少15种不同的信号。
21.根据权利要求11所述的方法，包括加入EDTA以灭活添加到所述样品中的酶。
22.根据权利要求11所述的方法，其中至少一个分析物检测剂包括分支DNA。
23.根据权利要求11所述的方法，还包括施加电场，以从每个分析物检测剂中去除所述信号。
24.根据权利要求11所述的方法，包括使用针对每个不稳定标签的特定的限制酶选择性去除所述不稳定标签。
25.根据权利要求24所述的方法，其中一个不稳定标签保持完整。
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