CN115820873B - 一种梨茎蜂的dna条形码及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种梨茎蜂的DNA条形码，所述条形码是一条AT富集的DNA序列。本发明还提供了利用梨茎蜂的DNA条形码鉴定梨茎蜂的方法，对样品提取总DNA后进行高通量测序，将测序reads比对到所述DNA条形码，如能够完全覆盖所述DNA条形码，即判断待测样品的物种包含是梨茎蜂。

Description

一种梨茎蜂的DNA条形码及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种梨茎蜂的DNA条形码及其应用。

背景技术

梨茎蜂俗称折梢虫、剪枝虫、剪头虫等。属膜翅目，茎蜂科。分布在中国各梨产区，是梨树主要害虫之一。主要为害梨，也为害棠梨等。梨茎蜂一年发生一代，幼虫蛀食嫩梢髓部，被害梢变黑枯死。由于梨茎蜂个体较小，成虫体长9～10毫米，翅展13～16毫米，卵椭圆形，长约1毫米，稍弯曲，乳白色、半透明。老熟幼虫体长10～11毫米。且幼虫常藏于嫩茎的虫道内。难以及时观察和鉴别虫害类型。且现有技术中也缺乏梨茎蜂的基因组信息，难以设计引物进行物种鉴别。

发明内容

为了克服上述困难，我们采用了基于二代测序的方法获得了一段AT富集片段。经分析该片段与现有任何昆虫的基因组均不存在高度同源,适合作为梨茎蜂的鉴定参考序列。进一步利用测序数据设计了一种可靠的鉴定梨茎蜂的方法。

本发明的目的之一在于提供一种梨茎蜂DNA条形码。

本发明的另一目的在于提供上述DNA条形码在梨茎蜂鉴定中的应用。

本发明的再一目的在于提供一种梨茎蜂的鉴定方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种梨茎蜂DNA条形码，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

上述所述梨茎蜂DNA条形码在梨茎蜂鉴定中的应用。

一种鉴定梨茎蜂的方法，其特征在于包含以下步骤：

1)提取待检测样品的总DNA；

2)对上述总DNA进行高通量测序，获得测序reads；

3)将上述测序reads比对到上述DNA条形码上；

4)根据测序reads在DNA条形码上的覆盖情况判断所述样品是否含有梨茎蜂；如能够完全覆盖所述DNA条形码，即判断待测样品的物种包含是梨茎蜂。

在一个实施例中，步骤1)中所述样品为单个物种样品或混合的多物种样品。

在一个实施例中，步骤2)中所述高通量测序为二代测序或三代测序。

在一个实施例中，步骤3)中使用Geneious、Bowtie、Bowtie、Tophat或HISAT任一款软件极性reads比对。

在一个实施例中，步骤1)中所述样品为单个物种样品或混合的多物种样品。

在一个实施例中，步骤2)中所述高通量测序为二代测序或三代测序。

在一个实施例中，步骤3)中使用Geneious、Bowtie、Bowtie、Tophat或HISAT任一款软件极性reads比对。

本发明的有益效果是：

第一，本发明第一次提供了一段梨茎蜂基因组AT富集片段。经分析该片段与现有任何昆虫的基因组均不存在高度同源,适合作为梨茎蜂鉴定的参考序列。

第二，本发明可以对混合样品，例如直接采集被虫蛀的嫩枝进行总DNA提取，通过高通量测序获得样品的DNA信息，并通过与参考序列比对鉴定样品是否含有梨茎蜂，避免梨茎蜂样品较小，DNA提取操作困难，DNA量无法达到高通量测序要求等缺点。

第三，直接通过高通量测序，无需引物设计，避免引物设计困难，操作方便，灵敏度高。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式，对本发明的进行详细说明。

图1是梨茎蜂的DNA条形码在NCBI的nr/nt库中的比对结果。

图2是含梨茎蜂的虫蛀嫩枝的高通量测序reads比对到梨茎蜂的DNA条形码上的结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。

实施例1梨茎蜂的DNA条形码

本发明通过研究，确定了梨茎蜂DNA条形码标准检测序列，具体序列为SEQ IDNO.1：

5’AAATATTTTATTTAAAATAATTAATTAATCATATATATATATTTATAATAATATTTAAATAATTATAAATACATATATATATTAATTAATTATTATTTATTTATTAAAATAATAATTAATTTATTTTATATATAAATATATATTTAATAATAAATAAATAATTTATTATTTTCTTTAATTCTCCTAATTAAACTATAACACATTTATTTAAACACTACATATCAATATATAAGTTCTAATGATTAATAATTTTAATTATTAATATATAAATTATATATATATAATTAAATAATTATAATTAAAATGAATATTTATATATAGATATTTATAATAATATTTAAATAATTATAAATATATATATATTAATTAATTATTATATATTTATAATAATATTTAAATAATTATAAATATATATATATTAATTAATTATTATATATTTATAATAATATTTAAATAATTATAAATATATATATATATTAATTAATTATTATTTATTTATTAAAATAATAATTAATTTATTTTATATATAAATATATATTTAATAATAAATAAATAATTTATTATTTTCTTTAATTCTCCTAATTAAACTATAACACATTTATTTAAACACTACATATCAATATATAAGTTCTAATGATTAATAATTTTAATTATTAATATATAAATTATATATATATAATTAAATAATTATAATTAAAATGAATATTTATATACTAGTATATAAATTTTAATTATTAATAAATAAAATTTATTAAAATTTAATATTTTTAATATTAAATATTAAAATATTAAATAGTAAATCAATATTACTAAAGTTTTATACTACTATAAAACGATGTTTATTAAATTTAAAAAATATAATATTTATTTTCTTATTAAAAAAAAAAAAGATAAGCTAAAAAAGCTTAAAGACTCATAATTTTTATATAGAAATTTTAATTTTCTTCTTTTTAAATATTTTTATTTAATTTTAATATTTAAATAGTAAATCTTCCTTATACCCCGGCCCCCCCCCACCTCATTATATTTTTTATACCCCACCCCAAATAAAAAATATAATTAATATAAATAATTAACTATTAAAATTTAAATTTTCTCCATACCCTAA-3’(SEQ ID NO:1)。

实施例2梨茎蜂的DNA条形码与近缘物种序列比对

为了确定本发明所述DNA条形码具有物种特异性，将本发明所述DNA条形码提交到NCBI进行在线blast比对，选择nr/nt库，不限定物种，选择More dissimilar sequences参数。如图1所示，发现本发明所述DNA条形码在NCBI的nr/nt库无任何近缘序列，表明本发明所述DNA条形码特异性极强。

实施例3梨茎蜂的鉴定方法

1)分别采集含梨茎蜂的虫蛀梨树嫩枝和健康梨树嫩枝作为待检测样品；

2)提取待检测样品的总DNA；

2)对上述2份样品的总DNA分别进行二代高通量测序，获得测序reads；

3)利用Geneious软件的默认参数将上述测序reads比对到本申请所述的DNA分子标记上；

4)根据测序reads在DNA分子标记上的覆盖情况判断所述样品是否含有梨茎蜂；如能够完全覆盖所述DNA条形码，即判断待测样品的物种包含是梨茎蜂，反之则获得相反结果。

检测结果如图2所示，其中图2为含梨茎蜂的虫蛀嫩枝，图中显示测序reads在参考序列(即本申请所述DNA条形码SEQ ID NO.1)上完全覆盖。而对于健康梨树嫩枝，参考序列上没有任何reads覆盖。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (4)

1.一种用于鉴定梨茎蜂的DNA条形码标准检测序列，所述DNA条形码标准检测序列为SEQ ID NO.1。

2.一种鉴定梨茎蜂的方法，其特征在于包含以下步骤：

1)提取待检测样品的总DNA；

2)对上述总DNA进行高通量测序，获得测序reads；

3)将上述测序reads比对到权利要求1所述的DNA条形码标准检测序列上；

4)根据测序reads在DNA条形码标准检测序列上的覆盖情况判断所述样品是否含有梨茎蜂；如能够完全覆盖所述DNA条形码标准检测序列，即判断待测样品的物种包含梨茎蜂。

3.如权利要求2所述的鉴定梨茎蜂的方法，其特征在于，步骤2)中所述高通量测序为二代测序或三代测序。

4.如权利要求2所述的鉴定梨茎蜂的方法，其特征在于，步骤3)中使用Geneious、Bowtie、Tophat或HISAT任一款软件进行reads比对。