CN111635949A - 一种鉴定黄纹大胡蜂的dna条形码标准检测片段及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴定黄纹大胡蜂的DNA条形码标准检测片段及其应用，属于生物物种鉴定领域，本发明用于鉴定黄纹大胡蜂的DNA条形码标准检测片段SEQ ID No.1，以及利用该基因序列及PCR扩增技术分子鉴定昆虫药材黄纹大胡蜂的方法，PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳进行验证后进行测序，将测序结果通过手工校对、序列拼接，并与本发明公开的COI基因序列SEQ ID NO.1进行比对，从而判断待测样品是否为黄纹大胡蜂；本发明的DNA分子鉴定技术无需对昆虫药材全虫进行形态学鉴定，实现了对药材鲜品或干品、全虫或部分虫体、蛹或幼虫或成虫的快速、准确可靠的鉴定，确保了黄纹大胡蜂作为药材入药的安全性。

Description

一种鉴定黄纹大胡蜂的DNA条形码标准检测片段及其应用

技术领域

本发明涉及生物物种鉴定领域，特别是涉及一种鉴定黄纹大胡蜂的DNA条形码标准检测片段及其应用。

背景技术

胡蜂俗称马蜂或黄蜂，是膜翅目(Hymenoptera)胡蜂总科(Vespoidea)昆虫的总称，主要包括胡蜂科(Vespidae)、马蜂科(Polistidae)和蜾蠃科(Eumenidae)等7个科。胡蜂不仅是一种应用广泛的资源昆虫，而且具有较高的药用价值，在我国西南、东南、台湾等地区作为药用昆虫应用于民间民族药物方剂。该蜂幼虫、成虫、蜂毒和蜂巢均可入药，药名分别为大黄蜂、大黄蜂子、蜂毒和露蜂房。胡蜂味甘辛、性温，主治风湿痹痛，其成虫和幼虫有祛风除湿之功效，可治急慢性风湿痛、风湿性关节炎；胡蜂房有定痛、祛风、驱虫、消肿解毒等功效，主治惊痛、风痹、疗毒、牙毒、乳痛等；而蜂毒主要应用于蜂蛰过敏症、心血管系统疾病、风湿关节炎及疮疡等疾病。以胡蜂为原料制作的胡蜂酒在我国民间有着悠久的使用历史，据《中国药典》(2010版)一部记载，胡蜂酒具有祛风除湿的功能，可用于风湿闭阻所致的痹病，症见关节疼痛、肢体沉重的急性风湿病、风湿性关节炎的治疗。由于胡蜂具有着较高的药用价值，近年来，在昆虫生物医药的开发利用进程中，胡蜂成了研究的热点，对其药理作用的研究越来越多，其药物制剂在临床上的应用也越来越广泛，而对胡蜂的物种鉴定是药物开发利用的前提和基础。

在入药的胡蜂科(Vespidae)昆虫中，隶属于胡蜂属(Vespa)的黄纹大胡蜂(Vespasoror)是一种具有较高经济效益和广阔的开发前景的胡蜂，近年来我国兴起了黄纹大胡蜂养殖热的现象。然而，养殖户由于技术所限、缺乏权威的形态学鉴定和分子生物学鉴定手段，导致大量具有药用价值的黄纹大胡蜂的混伪品涌入药材市场。入药胡蜂的种类不同，其所含的有效成分和药用功效、毒副作用都可能不同；混伪品入药除可能无法达到应有的药物疗效，甚者可能致使服用者产生不良反应。因此，为了保证药物的疗效及安全性，黄纹大胡蜂及其混伪品不能彼此混淆和替代，而需要给予准确的鉴定和细致的划分。

目前针对黄纹大胡蜂的鉴别方法有性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定等方法，但这种传统的物种鉴定主要依赖于专业的昆虫分类学家花费大量时间和精力整理积累后所描述的形态特征，存在较大的局限，不仅费时费力，而且常受主观因素干扰，极易混淆出错；其次传统鉴定方法的理论基础建立于分类群的性状特征分析，这些性状特征是与环境紧密相关的表现型，在鉴别时易受环境因素影响及样品形态和材料部位的限制，出现误差。近年来，随着分子生物学技术的发展，从体现物种遗传本质的DNA分子入手而形成的DNA条形码技术已成为物种鉴定的有效分析手段。

DNA条形码(DNA Barcoding)技术指的是通过特定DNA片段的核酸序列代表特定生物信息，达到识别生物的目的，已经成为生物分类和鉴定的新方向，是传统形态学鉴定的重要补充。DNA条形码是由加拿大动物学家Herbert首次提出的。2003年，Herbert等对动物界中11个门13320个物种的CO I基因序列进行分析，发现该序列种间变异能较好地区分除刺胞动物门以外的物种。随后的研究表明，CO I基因序列种内变异小，种间变异大，且其DNA序列本身很少存在插入和缺失，对动物物种的识别和鉴定切实可行，被公认为动物界中标准的DNA条形码基因。由于DNA条形码技术具有操作简便、准确、快速，不受物种发育阶段、个体形态以及研究者专业水平的限制的优势，使它受到分类鉴定工作者的普遍欢迎，并迅速发展成为学科前沿之一。而目前，尚未有准确性高的有效DNA条形码鉴定黄纹大胡蜂的方法出现。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定黄纹大胡蜂的DNA条形码标准检测片段及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，实现对黄纹大胡蜂的快速、准确、高效鉴定。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种用于鉴定黄纹大胡蜂的DNA条形码标准检测片段，所述DNA条形码标准检测片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步地，所述DNA条形码标准检测片段为黄纹大胡蜂CO I(cytochrome coxidase subunit I，细胞色素c氧化酶亚基I)基因片段。

本发明还提供一种用于鉴定黄纹大胡蜂的引物对，所述引物对用于扩增所述的DNA条形码标准检测片段；所述引物对中，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供一种利用所述的DNA条形码标准检测片段鉴定黄纹大胡蜂的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的DNA，以待测样品的DNA作为模板DNA，使用权利要求3所述的引物对进行PCR扩增，得到CO I基因片段；

(2)将得到的CO I基因片段进行琼脂糖凝胶电泳分析，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果，对特异性目的条带进行测序；

(3)将测序得到的结果经过校对、序列拼接后，除去引物序列，再与所述DNA条形码标准检测片段进行比对，若同源性在98％或以上，则可以判定待测样品为黄纹大胡蜂来源。

进一步地，步骤(1)中，PCR扩增时设置阴性对照和阳性对照，所述阳性对照为含有所述DNA条形码标准检测片段的PCR反应产物。

进一步地，步骤(2)中，将目的条带送测序公司进行DNA序列测定，使用DNA测序仪对PCR扩增产物进行双向测序，上述引物作为测序引物；测序结果采用序列拼接软件SeqMen进行手工校对、序列拼接。

进一步地，步骤(3)中，基因序列比对使用的是MEGA5.2软件，将步骤(3)中校对、拼接后的终序列去除引物序列后用Align by Clustalw进行排序对比。

进一步地，步骤(1)中，所述PCR扩增程序为：

首先94℃预变性3.5分钟；然后94℃变性35秒，49℃退火35秒，72℃延伸45秒，共33个循环；最后72℃延伸5分钟，置4℃保存。

进一步地，所述PCR扩增反应体系为：

双蒸水19μL，PCR反应混合液25μL，2μl正向引物P1，2μl反向引物P2，2μl DNA模板；其中，正向与反向引物的浓度为10μmol/L，PCR反应混合液内含0.1U的Taq聚合酶、500μmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸、20mmol/L的酸碱度pH＝8.3的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L的氯化钾、3mmol/L氯化镁。

进一步地，所述待测样品包括待鉴定的昆虫药材的鲜品或干品、炮制品或粉末状样品、全虫或部分虫体、蛹或幼虫或成虫。

本发明还提供一种所述的DNA条形码标准检测片段在黄纹大胡蜂物种鉴定及中药药材鉴定中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

与传统的形态学鉴定方法相比，本发明具有极其显著的有益效果，包括：(1)本发明获得的CO I基因序列有利于实现黄纹大胡蜂的分子鉴定，能有效缩短该昆虫药材的鉴定时间；(2)首次提供了一种用于鉴定黄纹大胡蜂的DNA条形码标准检测基因序列及其PCR扩增引物，实现了对该昆虫药材炮制品、粉末状样品、残缺不全虫体、蛹或幼虫等非成虫态、成虫与其伪品的快速鉴定；(3)克服了以下现有技术中的不足之处：对黄纹大胡蜂幼虫需要培养为成虫才能鉴定，耗时较长；对残缺不全的昆虫药材炮制品、虫体粉末基本上不能检测；以传统分类学方法鉴定黄纹大胡蜂要求掌握胡蜂属昆虫形态分类学的专业技术人员才能对其进行药材鉴定；(4)本发明提供的PCR扩增程序和反应体系重复性高，经多次试验证实其稳定性好；且该关键技术易于掌握，方法简便、可靠、速度快，大大提高了鉴定效率，便于企业在生药材、原料药质量控制等大生产中予以实施；(5)本发明提供的分子鉴定方法从根本上解决了当前黄纹大胡蜂难以进行快速准确鉴定的难题，对胡蜂酒及其它胡蜂制品的规范管理具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为购买于广东省增城市黄纹大胡蜂的CO I基因的PCR扩增结果电泳鉴定图；其中，泳道1为阴性对照，泳道2为黄纹大胡蜂幼虫的PCR扩增产物，泳道3为黄纹大胡蜂成虫的PCR扩增产物，泳道4为黄纹大胡蜂成虫炮制品的PCR扩增产物泳道，泳道5为阳性对照的PCR扩增产物，泳道M为DNA标准分子标量D2000 DNA Ladder条带；

图2为特异性检测结果的琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道M为DNA标准分子标量D2000 DNA Ladder条带，泳道1为阴性对照，泳道2为黄纹大胡蜂全虫药材的PCR扩增产物，泳道3为黄纹大胡蜂药材残破虫体的PCR扩增产物，泳道4为美洲大蠊全虫药材的PCR扩增产物，泳道5为美洲大蠊药材残破虫体的PCR扩增产物，泳道6为阳性对照的PCR扩增产物。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明中的黄纹大胡蜂是指昆虫纲Insecta，膜翅目Hymenoptera，胡蜂总科Vespoidea，胡蜂科Vespidae，胡蜂属Vespa昆虫黄纹大胡蜂(Vespa soror)。

据GenBank数据库比对结果，在黄纹大胡蜂及其近缘种中均未发现与此659bp基因序列相同的序列，用BLAST程序把本发明所述的CO I基因序列与GenBank中搜索到的前人研究结果相比对可以发现，待检黄纹大胡蜂样品均能一一对应相应的种类与序列。在种内水平上，黄纹大胡蜂CO I基因显示了很高的同源相似性(相似度98％-100％)；而黄纹大胡蜂CO I基因与其它物种的CO I基因则具有明显差异。因此，本发明提供的关于黄纹大胡蜂DNA条形码分子鉴定的方法，有利于实现黄纹大胡蜂的快速准确鉴定，缩短鉴定时间，由此完成了本发明。

实施例1用于鉴定黄纹大胡蜂的DNA条形码标准基因序列的获得

1、待测样品的采集、鉴定与保存

待测胡蜂样品购买于广东省增城市，样品经中国科学院昆明动物研究所董大志教授按形态学方法鉴定为黄纹大胡蜂(Vespa soror)。在鉴定无误后，将样品用无水乙醇浸泡并置于-20℃的冰柜中冻存。

2、实验仪器与试剂配制

2.1实验仪器与试剂

HWS12型恒温电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司，序列号131022035)；

SIGMA 1-14ED离心机(德国西格玛公司，序列号133828)；

DYCP-31DN型电泳仪(北京市六一仪器厂，批号20130816)；

DYY-7C型电泳仪电源(北京市六一仪器厂，序列号107C/20-04)；

微波炉(乐金电子(天津)电器有限公司，序列号108TA102133)；

10μL加样枪(大龙兴创实验仪器(北京)有限公司，序列号HU03523)；

20μL加样枪(大龙兴创实验仪器(北京)有限公司，序列号9071135)；

1000μL加样枪(大龙兴创实验仪器(北京)有限公司，序列号DS69142)；

5mL加样枪(大龙兴创实验仪器(北京)有限公司，序列号YE4A180788)；

XW-80A型涡旋机(海门麒麟医用仪器厂，批号201402)；

MyCycler Thermal Cycler型PCR仪(伯乐(BIO-RAD)生命医学产品有限公司，序列号580BR 12204)；

Tris(Beijing Solarbio Science&Technology Co.Ltd，分析纯)；

SDS(Beijing Solarbio Science&Technology Co.Ltd，分析纯)；

NaCl(天津市风船化学试剂科技有限公司，批号20130307)；

EDTA(天津市风船化学试剂科技有限公司，批号0100927)；

平衡酚(天津灏洋生物制品科技有限责任公司，批号20130913)；

氯仿(云南汕滇药业有限公司，批号20100604)；

异戊醇(西陇化工股份有限公司，批号1207312)；

无水乙醇(天津市瑞金特化学品有限公司，批号20130121)；

冰乙酸(天津瑞金特化学品有限公司，批号20110704)；

RNaseA(天根生化科技(北京)有限公司，批号M1806)；

6×DNA loading Buffer(天根生化科技(北京)有限公司，批号M1315)；

蛋白酶K(天根生化科技(北京)有限公司，批号M2011)；

2×Taq PCR MasterMix(天根生化科技(北京)有限公司，批号M1805)；

D2000 DNA Ladder(北京索莱宝科技有限公司)；

琼脂糖(Agarose LE)(天根生化科技(北京)有限公司，批号K0108)。

2.2试剂的配制

2.2.1匀浆缓冲液

由8份A液，1份B液及1份C液组成。

A液：Tris 0.05摩尔/升(mol/L)；NaCl 0.1mol/L；EDTA 0.1mol/L；pH＝7.0-8.0；

B液：5％的SDS；

C液：2毫克/毫升(mg/mL)的蛋白酶K。

2.2.2电泳缓冲液50×TAE的配制

由242克Tris、57.1mL冰醋酸和100mL的0.5mol/L EDTA(pH＝8.0)混合溶解而成。

3、总DNA提取及模板制备

首先对待测样品进行预处理：为避免污染，舍去腹部，只从头部或胸部提取DNA；将样品在75％的酒精中浸泡3小时，然后将其浸没于纯水中浸泡3小时，之后用纯水将其冲洗干净。预处理后用已灭菌的手术剪把样品剪成小块，取50毫克的样品采用SDS-蛋白酶K消化，采用平衡酚-氯仿方法提取样品中的基因组总DNA，于-20℃保存备用。

3.1研磨

取样品适量迅速剪碎置于研钵中，加入液氮，迅速研磨成粉末，称重，分别装入离心管中，一般每个离心管中加入20-200毫克样品。

3.2消化

在各离心管中加入480微升A液、60微升B液、60微升C液，涡旋混匀后，置于56℃水浴1-3小时，直至混合液消化得很清亮为止。

3.3酚抽提

在混合液中加入等体积的平衡酚，上下缓慢颠倒十次，切勿剧烈振荡，在台式高速离心机上6000r/min离心10分钟，取上清液。重复上述步骤直至水相与酚相的界面处看不到白色的蛋白质层为止，取上清液。

3.4氯仿:异戊醇(24:1)抽提

在上清液中加入等体积的氯仿∶异戊醇(24:1)，上下缓慢颠倒十次，在台式高速离心机上8000r/min离心10分钟，取上清液。

3.5沉淀DNA

在上清液中加入2×体积的冷无水乙醇(预先置-20℃冰箱内)沉淀DNA，冰箱内放置10分钟，12000r/min离心10分钟，弃上清液。

3.6洗涤DNA

在留有沉淀的离心管中加入1毫升70％的冷乙醇洗涤DNA，在台式高速离心机上10000r/min离心5分钟，倾去上清液。

3.7加入超纯水或TE缓冲液溶解

按10毫克样品对应10微升TE缓冲液溶解DNA。

3.8配制0.7％琼脂糖凝胶

称取0.14克琼脂糖于三角瓶中，加入1×TAE液，微波炉中加热溶解，稍冷却后加20微升的溴化乙锭溶液(1毫克/毫升)，倒入模具内制琼脂糖凝胶，冷却50-60分钟即可。将成型的琼脂糖凝胶置于电泳槽内，注入电泳缓冲液稍稍高于凝胶。

3.9取5微升各离心管中的DNA溶液于保鲜膜上，然后取5微升载样缓冲液与其混合，加样。取DNA标记(D2000 DNA Ladder Marker)7微升加样。

4、引物合成

正向引物P1(SEQ ID No.2)：5'-GGT CAA AAA TCA AAA GAT ATT GG-3'和反向引物P2(SEQ ID No.3)：5'-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3'委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成并测序验证。

5、PCR扩增

5.1PCR反应体系

取双蒸水19μL，PCR反应混合液25μL，2μl正向引物P1，2μl反向引物P2，2μl DNA模板；其中，正向与反向引物的浓度为10μmol/L，PCR反应混合液含有0.1U的Taq聚合酶、500μmol/L的dNTP、20mmol/L的Tris-HCl(pH＝8.3)、100mmol/L的KCl、3mmol/L的MgCl₂。

5.2扩增程序

首先在94℃预变性3.5分钟；然后94℃变性35秒、49℃退火35秒、72℃延伸45秒，扩增33个循环；最后72℃延伸5分钟，置4℃保存。

6、PCR扩增产物检测及基因序列测定

取2μL的PCR扩增产物，用1.2％琼脂糖凝胶电泳(90V电压，电泳40分钟)，溴化乙锭染色并置于凝胶成像系统检测，对条带位置在500-750bp的PCR扩增产物委托进行测序。将测序得到的序列在NCBI中进行BLAST检验，确定得到的是CO I基因片段，去掉两端引物序列的SEQ ID NO.1具体序列如下所示：

AATATTATATTTTATATTCGCCTTTATGATCAGGGACTCTAGGAGCCTCTATAAGATTAATTATTCGTATAGAATTAAGATCTCCTGGTAGGTTAATTAATAATGATCAAATTTATAACTCTATTATTACTGCCCATGCTTTTATTATAATTTTCTTTATGGTTATACCATTTATAATTGGAGGTTTCGGAAATTGACTAATTCCCCTTATATTAGGAATTCCAGACATAGCATTCCCCCGAATAAATAATATAAGATTTTGATTATTACCACCTTCTTTATTTCTTTTAATTATAAGAAATTTTATCGGAGGAGGGGTAGGAACAGGATGAACTTTATATCCCCCCCTATCTTCTATTACTGGCCATAATTCTCCTTCAGTAGATCTTAGAATTTTTTCTCTTCATATTGCAGGAATTTCTTCCATTATAGGAGCAATTAATTTTATTGTAACAATTTTAAATATACATGTTAAAACTCACTCATTAAATTTTCTACCTTTATTTTCTTGATCAGTATTAATTACAGCCTTCCTTCTCCTCTTATCTTTACCCGTTTTAGCAGGAGCAATCACTATACTTTTAACAGATCGAAACTTTAACACATCCTTCTTTGACCCAACTGGAGGCGGCGACCCTATCCTTTATCAACATCTATTC；CO I基因片段SEQID NO.1的序列长度为659bp。

7、实验结论

所述DNA序列SEQ ID NO.1在GenBank中进行BLAST比对，结果并没有发现与其序列相似性为88％及以上的物种，而序列相似性为87％及以下的基因序列来源皆非黄纹大胡蜂。由此可以得出：上述DNA条形码COI基因序列SEQ ID NO.1为黄纹大胡蜂所特有基因片段序列并且能够用来准确鉴定昆虫药材黄纹大胡蜂。

实施例2对黄纹大胡蜂不同形态及炮制品的样品进行鉴定

1、待测样品的采集与保存：取购于云南省德宏市的黄纹大胡蜂蜂蛹及成虫为待测样品，并取部分成虫虫体经烘箱快速烘干为成虫炮制品，并以购置于广东省增城市的胡蜂成虫为阳性对照样品。所有样品经中国科学院昆明动物研究所董大志教授按形态学方法鉴定为黄纹大胡蜂(Vespa soror)。在鉴定无误后，将样品用无水乙醇浸泡并置于-20℃的冰柜中冻存。

2、实验仪器与试剂配制：同实施例1。

3、DNA提取及模板制备：首先对阳性对照样品及待测样品进行预处理。以与实施例1相同的方法对样品进行预处理、DNA提取和DNA模板制备。

4、引物合成：同实施例1。

5、PCR扩增：同实施例1，并设置阴性对照(反应体系中不含DNA模板，以水代替)和阳性对照。

6、PCR扩增产物检测：取2μL的PCR扩增产物，用1.2％琼脂糖凝胶电泳(90V电压，电泳40分钟)，溴化乙锭染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱如图1所示：其中，泳道1为阴性对照、泳道5为阳性对照的PCR扩增产物、泳道2-4为待测样品的PCR扩增产物(泳道2为黄纹大胡蜂幼虫的PCR扩增产物、泳道3为成虫的PCR扩增产物、泳道4为成虫炮制品的PCR扩增产物)，检测出大小在500bp-750bp之间的条带，并且该条带与阳性对照处于同一位置。

7、基因序列测定：委托华大基因对PCR扩增产物进行测序，测序结果显示：幼虫、成虫、成虫炮制品和阳性对照样品与如SEQ ID NO.1所示的CO I基因序列的同源性皆为99％，因而可判定该待测样品即为黄纹大胡蜂，与传统形态学鉴定结果相同。

结果显示：DNA条形码标准基因序列SEQ ID NO.1能够快速有效地对黄纹大胡蜂不同形态及炮制品进行物种鉴定，弥补了传统形态学方法鉴定的不足。

实施例3黄纹大胡蜂的DNA条形码分子鉴定方法之特异性检测

1、待测样品的采集与保存

待测样品为在云南省德宏市购买的黄纹大胡蜂药材，以及在云南省保山市购买的美洲大蠊药材。样品经中国科学院昆明动物研究所董大志教授、大理大学杨自忠教授按形态学方法鉴定为黄纹大胡蜂(Vespa soror)和美洲大蠊(Periplaneta americana Linn.)，并取购置于广东省增城市的经形态学鉴定的黄纹大胡蜂成虫为阳性对照样品。以75％酒精擦拭待测样品消毒，取一部分消毒后的待测样品头部或胸部肌肉组织于1.5mL的离心管中，然后用无水乙醇浸泡肌肉组织并保存于-20℃冰箱中。

2、实验仪器与试剂配制：同实施例1。

3、DNA提取：用用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)(由天根生化科技(北京)有限公司生产，版本号DP121109，目录号DP304)提取待测样品的基因组DNA，置于-20℃冰柜中保存备用。

4、引物合成：同实施例1。

5、PCR扩增：同实施例1，并设置阴性对照(反应体系中不含模板，水代替为模板)和阳性对照。

6、PCR扩增产物检测：取2μL的PCR扩增产物，用浓度为1.0％并经过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳(90V电压，电泳45分钟)分离。然后用紫外凝胶成像系统进行检测，电泳图谱如图2所示：其中，泳道1为阴性对照、泳道6为阳性对照的PCR扩增产物、泳道2-5为待测样品的PCR扩增产物(泳道2为黄纹大胡蜂全虫药材的PCR扩增产物、泳道3为黄纹大胡蜂药材残破虫体的PCR扩增产物，泳道4美洲大蠊全虫药材的PCR扩增产物，泳道5为美洲大蠊药材残破虫体的PCR扩增产物)，检测出大小在500bp-750bp之间的条带，并且该条带与阳性对照处于同一位置。

7、委托华大基因对PCR扩增产物进行测序，测序结果与实施例1提供的SEQ IDNO.1所示的DNA条形码标准基因比对：发现黄纹大胡蜂药材全虫及残破虫体与SEQ ID NO.1的同源性皆为99％，而美洲大蠊药材的全虫及残破虫体与SEQ ID NO.1的同源性分别为83％和81％；将美洲大蠊药材待测样品在NCBI上进行BLAST搜索，发现所测序列皆为美洲大蠊基因序列。

结果显示：DNA条形码标准基因序列SEQ ID NO.1为黄纹大胡蜂所特有基因序列并且能够用来准确鉴定黄纹大胡蜂，弥补了传统形态学方法鉴定的不足。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 大理大学

<120> 一种鉴定黄纹大胡蜂的DNA条形码标准检测片段及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 659

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aatattatat tttatattcg cctttatgat cagggactct aggagcctct ataagattaa 60

ttattcgtat agaattaaga tctcctggta ggttaattaa taatgatcaa atttataact 120

ctattattac tgcccatgct tttattataa ttttctttat ggttatacca tttataattg 180

gaggtttcgg aaattgacta attcccctta tattaggaat tccagacata gcattccccc 240

gaataaataa tataagattt tgattattac caccttcttt atttctttta attataagaa 300

attttatcgg aggaggggta ggaacaggat gaactttata tcccccccta tcttctatta 360

ctggccataa ttctccttca gtagatctta gaattttttc tcttcatatt gcaggaattt 420

cttccattat aggagcaatt aattttattg taacaatttt aaatatacat gttaaaactc 480

actcattaaa ttttctacct ttattttctt gatcagtatt aattacagcc ttccttctcc 540

tcttatcttt acccgtttta gcaggagcaa tcactatact tttaacagat cgaaacttta 600

acacatcctt ctttgaccca actggaggcg gcgaccctat cctttatcaa catctattc 659

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtcaaaaat caaaagatat tgg 23

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taaacttcag ggtgaccaaa aaatca 26

Claims (9)

1.一种用于鉴定黄纹大胡蜂的DNA条形码标准检测片段，其特征在于，所述DNA条形码标准检测片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的DNA条形码标准检测片段，其特征在于，所述DNA条形码标准检测片段为黄纹大胡蜂CO I(cytochrome c oxidase subunit I，细胞色素c氧化酶亚基I)基因片段。

3.一种用于鉴定黄纹大胡蜂的引物对，其特征在于，所述引物对用于扩增权利要求1或2所述的DNA条形码标准检测片段；所述引物对中，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

4.一种利用权利要求1-2任一项所述的DNA条形码标准检测片段鉴定黄纹大胡蜂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的DNA，以待测样品的DNA作为模板DNA，使用权利要求3所述的引物对进行PCR扩增，得到COI基因片段；

(2)将得到的CO I基因片段进行琼脂糖凝胶电泳分析，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果，对特异性目的条带进行测序；

(3)将测序得到的结果经过校对、序列拼接后，除去引物序列，再与所述DNA条形码标准检测片段进行比对，若同源性在98％或以上，则可以判定待测样品为黄纹大胡蜂来源。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，PCR扩增时设置阴性对照和阳性对照，所述阳性对照为含有所述DNA条形码标准检测片段的PCR反应产物。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述PCR扩增程序为：

首先94℃预变性3.5分钟；然后94℃变性35秒，49℃退火35秒，72℃延伸45秒，共33个循环；最后72℃延伸5分钟，置4℃保存。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应体系为：

双蒸水19μL，PCR反应混合液25μL，2μl正向引物P1，2μl反向引物P2，2μl DNA模板；其中，正向与反向引物的浓度为10μmol/L，PCR反应混合液内含0.1U的Taq聚合酶、500μmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸、20mmol/L的酸碱度pH＝8.3的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L的氯化钾、3mmol/L氯化镁。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述待测样品包括待鉴定的昆虫药材的鲜品或干品、炮制品或粉末状样品、全虫或部分虫体、蛹或幼虫或成虫。

9.一种权利要求1或2任一项所述的DNA条形码标准检测片段在黄纹大胡蜂物种鉴定及中药药材鉴定中的应用。

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