CN104232634A - 一种松树蜂特异性ss-coⅰ引物对及快速分子检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种松树蜂特异性SS-COⅠ引物对及快速分子检测方法，本发明以松树蜂为靶标，与松树蜂在国内同域发生和同属近缘的其他4种树蜂(Sirex nitidus，新渡户树蜂Sirex nitobei，烟角树蜂Tremex fuscicornis，黑顶扁角树蜂Tremex apicalis)作为参照，设计基于线粒体COⅠ基因序列的种特异性引物，并构建和优化了松树蜂快速分子检测体系。
Description
技术领域
本发明涉及分子检测领域，特别涉及一种松树蜂特异性SS-CO Ⅰ引物对及快速分子检测方法。
背景技术
随着全球经济一体化的加快，林业外来生物入侵的形势日趋严峻。一些重大林业入侵物种已对我国的森林资源、物种多样性与生态安全造成了重大损失。
松树蜂(Sirex noctilio F.)原产欧亚大陆和北非，主要危害松树。在美国被列为具有“极高风险”的林业入侵生物。在上世纪，该虫先后入侵澳洲的新西兰和澳大利亚，南美的乌拉圭、阿根廷、巴西和智利，以及南非等国；在本世纪初，又传入北美的加拿大和美国；在严重入侵区域，可造成80％的松树死亡。据国外文献报导，该虫危害各类针叶树，尤其是松树；天然林和人工林均可入侵，健康和衰弱树木均能危害，入侵后导致的林木死亡率很高；适生区域极广，可随原木和木包装进行远距离传播。
此前，我国一直报导没有松树蜂的分布，在1980年和2003年的全国林业有害生物普查中也未发现该虫，但一直高度关注和防范此虫的入侵；为此，2007年我国把该虫列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。国内外专家也对该虫在我国的潜在适生区进行了分析，结果认为：自云南至黑龙江一线以南的广大区域均为高度适生区；在我国寄主树种广泛，潜在风险非常大。
植物检疫，是防止外来有害生物入侵的最有效的手段。近年来， 我国在东部地区多个口岸在进境原木与木质包装中不断截获该虫。为了将松树蜂与近缘种树蜂类昆虫区分开来，需要大量形态学鉴别工作，这些工作大多费时、费力且需要专业的昆虫分类学知识。并且，处于卵、幼虫、蛹这三个虫态的树蜂类昆虫在形态上非常相似，目前还没有可靠的鉴定特征。
近些年，越来越多的研究已证明分子生物学手段能够为鉴定害虫提供有力依据。线粒体DNA严格母性遗传，其中的细胞色素氧化酶I基因(COI)具有高度保守，结构稳定，无内含子的特点。因此，常作为昆虫DNA条形码用于物种分类、鉴定和亲缘关系的研究。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种松树蜂特异性SS-CO Ⅰ引物对及快速分子检测方法，本发明鉴定方法快速稳定，对操作人员的专业技术能力要求较低，无需掌握树蜂类昆虫形态的专业知识，可广泛应用于基层的检验检疫及相关部门。
为达到上述目的，本发明的技术方案为：
一种松树蜂特异性SS-CO Ⅰ引物，其序列如下：
SNSSF1：5’-ATT CTG ACT CCT TCC TCC TGC TTT-3’
SNSSR1：5’-AGT GAT TGC TCC AGC AAG AAC A-3’
一种松树蜂快速分子检测方法，包括如下步骤，
步骤一、昆虫基因组DNA的提取
基因组DNA提取都采用BIOMIGA公司的EZgeneTM Insect gDNA Kit(GD2413-02)试剂盒。
具体操作步骤：
(1)将在纯酒精中浸泡的标本用超声波仪器清洗干净晾干后，成虫去头和鞘翅，幼虫取其腹部组织。取＜50mg的组织于研钵中充分研磨，置于1.5ml的离心管中。
(2)向离心管中加入350ul的Buffer ITL与25ul的蛋白酶K(25mg/ml)，充分混匀后置于60℃恒温水浴锅两个小时直到组织完全被消化。
(3)在离心管中加入350μl的氯仿：异戊醇(24:1)缓慢混匀，在室温，10,000转速下离心2min，并小心的将上清液转移到新的干净的1.5ml离心管中。
(4)加入1倍体积的的BufferBL与5μl的RNaseA,缓慢混匀，70℃水浴半小时。
(5)加入1倍体积的无水乙醇(室温)，缓慢混匀。
(6)将前一步的溶液和絮状沉淀700μ加入吸附柱内(吸附柱安放于收集管内)，10,000xg室温下离心1min，移除废液，吸附柱重新置于收集管内。如此时仍有剩余混合液则重复第6步。
(7)将吸附柱重新置于新的收集管内，加入500μl的BufferKB，10,000xg室温下离心30s，移除废液，吸附柱重新置于收集管内。
(8)加入600μl的DNAWashBuffer，10,000xg离心30s，移除废液，吸附柱重新置于收集管内。
(9)重复第8步，将吸附柱置于新的收集管内，在吸附柱的盖子打开的条件下，13,000sg室温离心2min，后置于室温下数分钟，使酒精充分挥发。
(10)将吸附柱置于新的1.5ml离心管中，向吸附柱中间部位悬空加 入30μl的Elution Buffer，Elution Buffer在60℃—70℃条件下预热，室温放置2分钟，在13,000xg下离心2min。
(11)重复第10步，以便提高产量。
步骤二、树蜂CO Ⅰ基因序列的通用引物扩增
根据已有文献报道，合成树蜂类昆虫CO Ⅰ基因序列扩增通用引物：
LCO 1490:5’-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3’，
HCO 2198：5’-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3’
PCR扩增反应使用GreenMaster Mix试剂盒(Promega)，总体系为25μl，包括：2×GO Taq GreenMaster Mix 12.5μl、两种引物LCO 1490和HCO 2198各1μl、DNA模板1.5μl、ddH2O 9μl。混匀后放入PCR仪中进行扩增，扩增的程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，45℃复性30s，68℃延伸1.5min，35个循环；最后68℃延伸10min。每次反应用无菌蒸馏水做一个空白对照，用以排除系统误差。取3μl产物上样到1.5％TAE琼脂糖凝胶上。经130V电泳20min后，将胶块浸泡于EB染料中3min，在紫外分光光度计下检测拍照。
步骤三、近缘种多重序列对比及种特异性引物设计
将PCR产物送诺赛生物(北京)公司进行双向测序，得到CO Ⅰ序列。使用DNAstar对序列进行拼接，去除冗余序列，将序列结果在GeneBank中进行Blast序列比对。
根据本实验中5种树蜂的测序结果以及数据库中已公开的10种Sirex属树蜂的碱基序列进行对比分析，运用软件Primer Primer5.0 软件设计松树蜂特异性SS-CO Ⅰ引物1对(SNSSF1/SNSSR1)：
SNSSF1：5’-ATT CTG ACT CCT TCC TCC TGC TTT-3’
SNSSR1：5’-AGT GAT TGC TCC AGC AAG AAC A-3’
步骤四、松树蜂SS-CO Ⅰ种特异性引物扩增体系的建立优化
PCR扩增反应使用GreenMaster Mix试剂盒(Promega)，反应体系与CO Ⅰ基因序列扩增体系相同(见表1)。扩增的程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，53℃复性30s，72℃延伸1.5min，35个循环；最后72℃延伸10min。每次反应用无菌蒸馏水做一个空白对照，用以排除系统误差。取3μl产物上样到1.5％TAE琼脂糖凝胶上。经130V电泳20min后，将胶块浸泡于EB染料中3min，在紫外分光光度计下检测拍照。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明鉴定方法快速稳定，对操作人员的专业技术能力要求较低，无需掌握树蜂类昆虫形态的专业知识，可广泛应用于基层的检验检疫及相关部门。
附图说明
图1琼脂糖凝胶电泳检测五种树蜂PCR扩增产物的检测图：a.CO Ⅰ通用引物扩增产物电泳图；b.松树蜂特异性SS-CO Ⅰ引物扩增产物电泳图。
图注：M：DL2000 DNA marker(从上至下2000,1000,750,500,250,100bp)；泳道：1-松树蜂Sirex noctilio，2-Sirex nitidus，3-新渡户树蜂Sirex nitobei，4-烟角树蜂Tremex fuscicornis，5-黑顶扁角树蜂Tremex apicalis，6-阴性对照(超纯水)。
图2琼脂糖凝胶电泳检测松树蜂种特异性引物的灵敏度
图注：M：DL2000 DNA marker(从上至下2,000,1000,750,500,250,100bp)；泳道1-6分别代表：40ng,4ng,400pg,40pg,4pg和400fg的松树蜂基因组DNA，泳道7-阴性对照(超纯水)
图3琼脂糖凝胶电泳检测特异性引物对不同虫态松树蜂样本的扩增。
图注：M：DL2000 DNA marker(从上至下2,000,1000,750,500,250,100bp)；泳道1-3分别代表：1-幼虫，2-蛹，3-成虫，泳道4-阴性对照(超纯水)
图4琼脂糖凝胶电泳检测特异性引物对不同地区松树蜂样本的扩增
图注：M：DL2000 DNA marker(从上至下2,000,1000,750,500,250,100bp)；泳道1-7分别代表七个不同地区的松树蜂样本：1-黑龙江杜蒙,2-黑龙江鹤岗,3-黑龙江齐齐哈尔,4-黑龙江绥阳,5-吉林榆树,6-内蒙满洲里,7-内蒙克一河，泳道8-阴性对照(超纯水)
具体实施方式
下面结合附图及具体实施方式对本发明方案做进一步详细描述：试验例1
本发明以松树蜂为靶标，与松树蜂在国内同域发生和同属近缘的其他4种树蜂(Sirex nitidus，新渡户树蜂Sirex nitobei，烟角树蜂Tremex fuscicornis，黑顶扁角树蜂Tremex apicalis)作为参照，设计基于线粒体CO Ⅰ基因序列的种特异性引物，并构建和优化了松树蜂快速分子 检测体系。
1.昆虫基因组DNA的提取
基因组DNA提取都采用BIOMIGA公司的EZgeneTM Insect gDNA Kit(GD2413-02)试剂盒。
具体操作步骤：
(1)将在纯酒精中浸泡的标本用超声波仪器清洗干净晾干后，成虫去头和鞘翅，幼虫取其腹部组织。取＜50mg的组织于研钵中充分研磨，置于1.5ml的离心管中。
(2)向离心管中加入350ul的Buffer ITL与25ul的蛋白酶K(25mg/ml)，充分混匀后置于60℃恒温水浴锅两个小时直到组织完全被消化。
(3)在离心管中加入350μl的氯仿：异戊醇(24:1)缓慢混匀，在室温，10,000转速下离心2min，并小心的将上清液转移到新的干净的1.5ml离心管中。
(4)加入1倍体积的的BufferBL与5μl的RNaseA,缓慢混匀，70℃水浴半小时。
(5)加入1倍体积的无水乙醇(室温)，缓慢混匀。
(6)将前一步的溶液和絮状沉淀700μ加入吸附柱内(吸附柱安放于收集管内)，10,000xg室温下离心1min，移除废液，吸附柱重新置于收集管内。如此时仍有剩余混合液则重复第6步。
(7)将吸附柱重新置于新的收集管内，加入500μl的BufferKB，10,000xg室温下离心30s，移除废液，吸附柱重新置于收集管内。
(8)加入600μl的DNAWashBuffer，10,000xg离心30s，移除废液， 吸附柱重新置于收集管内。
(9)重复第8步，将吸附柱置于新的收集管内，在吸附柱的盖子打开的条件下，13,000sg室温离心2min，后置于室温下数分钟，使酒精充分挥发。
(10)将吸附柱置于新的1.5ml离心管中，向吸附柱中间部位悬空加入30μl的Elution Buffer，Elution Buffer在60℃—70℃条件下预热，室温放置2分钟，在13,000xg下离心2min。
(11)重复第10步，以便提高产量。
2.树蜂COⅠ基因序列的通用引物扩增
根据已有文献报道，合成树蜂类昆虫CO Ⅰ基因序列扩增通用引物：
LCO 1490:5’-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3’，
HCO 2198：5’-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3’
PCR扩增反应使用GreenMasterMix试剂盒(Promega)，总体系为25μl，各成分如表1所示：
表1PCR反应体系
混匀后放入PCR仪中进行扩增，扩增的程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，45℃复性30s，68℃延伸1.5min，35个循环；最后68℃延伸10min。每次反应用无菌蒸馏水做一个空白对照，用以排除系统误差。取3μl产物上样到1.5％TAE琼脂糖凝胶上。经130V电泳20min后，将胶块浸泡于EB染料中3min，在紫外分光光度计下检测拍照。
3.近缘种多重序列对比及种特异性引物设计
将PCR产物送诺赛生物(北京)公司进行双向测序，得到CO Ⅰ序列。使用DNAstar对序列进行拼接，去除冗余序列，将序列结果在GeneBank中进行Blast序列比对。
根据本实验中5种树蜂的测序结果以及数据库中已公开的10种Sirex属树蜂的碱基序列进行对比分析，运用软件Primer Primer5.0软件设计松树蜂特异性SS-CO Ⅰ引物1对(SNSSF1/SNSSR1)：
SNSSF1：5’-ATT CTG ACT CCT TCC TCC TGC TTT-3’
SNSSR1：5’-AGT GAT TGC TCC AGC AAG AAC A-3’
4.松树蜂SS-CO Ⅰ种特异性引物扩增体系的建立优化
PCR扩增反应使用GreenMaster Mix试剂盒(Promega)，反应体系与CO Ⅰ基因序列扩增体系相同(见表1)。扩增的程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，53℃复性30s，72℃延伸1.5min，35个循环；最后72℃延伸10min。每次反应用无菌蒸馏水做一个空白对照，用以排除系统误差。取3μl产物上样到1.5％TAE琼脂糖凝胶上。经130V电泳20min后，将胶块浸泡于EB染料中3min，在紫 外分光光度计下检测拍照。
本发明的效果
1.松树蜂SS-COⅠ引物的种特异性检验
以国内与松树蜂同域发生和同属近缘的其他4种树蜂类昆虫的DNA为模板，以松树蜂DNA为阳性对照(检测DNA均为10ng/μl浓度的母液)。检验松树蜂SS-CO Ⅰ引物SNSSF1/SNSSR1的种特异性。
利用CO Ⅰ通用引物，5种树蜂均扩增约700bp的产物，而利用本发明设计的特异性SS-CO Ⅰ引物SNSSF1/SNSSR1进行PCR，仅有松树蜂成功扩增，产物为319bp，对其它4种树蜂和阴性对照均不具有扩增能力(见图1)，表明该对引物为松树蜂的种特异性引物。
2.松树蜂SS-CO Ⅰ引物的灵敏度检验
以不同浓度的松树蜂DNA标准品为模板进行扩增，检验该引物的灵敏度。
2.1标准品的制备
将松树蜂浓度为10ng/μl的DNA母液样本按照(1:10)的比例依次稀释成10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl的标准液。
利用不同浓度梯度的松树蜂DNA标准品进行特异性引物灵敏度检验(见图2)。PCR检验的最小检测限度为200pg的基因组DNA。3.不同虫态，不同地区松树蜂样本的检测
以不同虫态(幼虫、蛹、成虫)松树蜂DNA为模版，以种特异 性引物SNSSF1/SNSSR1进行扩增，不同虫态的松树蜂均能稳定地扩增出319bp的特异性片段(见图3)。
以采集自我国3个省7不同市、县的松树蜂成虫DNA为模板，以种特异性引物SNSSF1/SNSSR1进行扩增，结果显示不同地区种群的松树蜂都能扩增出清晰的靶标片段(见图4)。
综合上述研究，松树蜂种特异性引物(SNSSF1/SNSSR1)只对松树蜂具有扩增效果，对其同域发生和同属近缘的树蜂类昆虫不具有扩增能力；并且对采自我国3个省7个不同市县的松树蜂、不同虫态的松树蜂样本都具有同样的检测效果；特异性引物灵敏度高，能够检测最低为200pg的基因组DNA；对靶标序列的Blast结果显示，该片段与已报道松树蜂一致性为100％。结果表明该发明可用于出入境检验检疫过程中松树蜂的快速鉴定。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
Claims (5)
1.一种松树蜂特异性SS-CO Ⅰ引物，其特征在于，其序列如下：
SNSSF1：5’-ATT CTG ACT CCT TCC TCC TGC TTT-3’
SNSSR1：5’-AGT GAT TGC TCC AGC AAG AAC A-3’。
2.一种松树蜂快速分子检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述的松树蜂特异性SS-CO Ⅰ引物对松树蜂及其他与松树蜂同域发生和同属近缘的树蜂类昆虫DNA进行PCR扩增，以快速检测松树蜂品种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，松树蜂SS-CO Ⅰ特异性引物扩增体系的建立包括如下步骤：
步骤一、昆虫基因组DNA的提取；
步骤二、树蜂CO Ⅰ基因序列的通用引物扩增；
步骤三、近缘种多重序列对比及种特异性引物设计；
将步骤二所得通用引物扩增后的PCR产物进行双向测序，得到CO Ⅰ序列，使用DNAstar对序列进行拼接，去除冗余序列，将序列结果在GeneBank中进行Blast序列比对；
根据5种树蜂的测序结果以及数据库中已公开的10种Sirex属树蜂的碱基序列进行对比分析，运用软件Primer Primer5.0软件设计松树蜂特异性SS-CO Ⅰ引物1：
SNSSF1：5’-ATT CTG ACT CCT TCC TCC TGC TTT-3’
SNSSR1：5’-AGT GAT TGC TCC AGC AAG AAC A-3’；
步骤四、松树蜂SS-CO Ⅰ种特异性引物扩增体系的建立优化
PCR扩增反应使用GreenMaster Mix试剂盒，除采用SS-CO Ⅰ种特异性引物外，反应体系与CO Ⅰ基因序列扩增体系相同，扩增的程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，53℃复性30s，72℃延伸1.5min，35个循环；最后72℃延伸10min，每次反应用无菌蒸馏水做一个空白对照，用以排除系统误差，取3μl产物上样到1.5％TAE琼脂糖凝胶上，经130V电泳20min后，将胶块浸泡于EB染料中3min，在紫外分光光度计下检测拍照。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤一的具体操作步骤为：
(1)将在纯酒精中浸泡的标本用超声波仪器清洗干净晾干后，成虫去头和鞘翅，幼虫取其腹部组织；取＜50mg的组织于研钵中充分研磨，置于1.5ml的离心管中；
(2)向离心管中加入350ul的Buffer ITL与25ul的蛋白酶K(25mg/ml)，充分混匀后置于60℃恒温水浴锅两个小时直到组织完全被消化；
(3)在离心管中加入350μl的氯仿：异戊醇(24:1)缓慢混匀，在室温，10,000转速下离心2min，并小心的将上清液转移到新的干净的1.5ml离心管中；
(4)加入1倍体积的的BufferBL与5μl的RNaseA,缓慢混匀，70℃水浴半小时；
(5)室温下加入1倍体积的无水乙醇，缓慢混匀；
(6)将前一步的溶液和絮状沉淀700μ加入吸附柱内，吸附柱安放于收集管内，10,000xg室温下离心1min，移除废液，吸附柱重新置于收 集管内；如此时仍有剩余混合液则重复第6步；
(7)将吸附柱重新置于新的收集管内，加入500μl的BufferKB，10,000xg室温下离心30s，移除废液，吸附柱重新置于收集管内；
(8)加入600μl的DNAWashBuffer，10,000xg离心30s，移除废液，吸附柱重新置于收集管内；
(9)重复第8步，将吸附柱置于新的收集管内，在吸附柱的盖子打开的条件下，13,000sg室温离心2min，后置于室温下数分钟，使酒精充分挥发；
(10)将吸附柱置于新的1.5ml离心管中，向吸附柱中间部位悬空加入30μl的Elution Buffer，Elution Buffer在60℃—70℃条件下预热，室温放置2分钟，在13,000xg下离心2min；
(11)重复第10步，以便提高产量。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤二及步骤三中，PCR扩增反应体系为：使用GreenMaster Mix试剂盒，总体系为25μl，包括：2×GO Taq GreenMaster Mix 12.5μl、两种引物各1μl、DNA模板1.5μl、ddH2O 9μl。
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