CN110804664B - 一种用于鉴定美雕齿小蠹的引物对、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定美雕齿小蠹的引物对、试剂盒及其应用。该引物对包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物IC96‑F和如SEQ ID NO.2所示的下游引物IC323‑R。本发明提供的引物对和试剂盒能克服了传统形态学检测的局限，可以有效区分美雕齿小蠹与7个我国口岸常截获的近缘种类，从而实现了对美雕齿小蠹的快速、准确和稳定的检测；而且通过灵敏性实验表明，PCR方法能够检测出0.1ng/μL浓度的样品。本发明的研究结果可直接应用于进出境植物检疫中美雕齿小蠹的检疫鉴定，对保护我国农林生产安全、维持生态平衡，保证公共卫生安全都有极为重要的意义。

Description

一种用于鉴定美雕齿小蠹的引物对、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物物种分子诊断技术领域，特别涉及一种用于鉴定美雕齿小蠹的引物对、试剂盒及其应用。

背景技术

美雕齿小蠹Ips calligraphus(Germar)属鞘翅目(Coleoptera)小蠹科(Scolytidae)齿小蠹属(Ips)为我国进境植物检疫性有害生物。该虫危害湿地松、加勒比松、萌芽松、山松、西方松、卵果松、西黄松、拟北美松、多脂松、北美乔松、火炬松等松属植物；危害树桩、树干及近期伐倒的大枝条，并能危害健康树；成虫、幼虫蛀食韧皮部。美雕齿小蠹原产于北美地区，主要分布于美国、加拿大、牙买加、墨西哥、洪都拉斯、危地马拉、尼加拉瓜，现已入侵菲律宾等地，具有适生范围广，定殖能力强的特点，是全球性的重要森林害虫。

齿小蠹属目前世界已知有37种，主要分布于北美地区。由于该属种类属于树皮小蠹类，成虫、幼虫均可造成危害，很容易随进口木材进行远距离传播，且寄主主要是针叶树，而松属、云杉属植物是我国常见树种，分布遍及全国，是重要的林业、绿化树种，因此该属昆虫极易在我国找到适宜的生活环境，成功入侵定殖。鉴于近年来我国各口岸进境北美地区木材量增长迅猛，且口岸截获齿小蠹属昆虫的种类和频率也迅速增多，说明齿小蠹属昆虫入侵的风险很大。但由于美雕齿小蠹与其近缘种类在外形上很类似，单纯依靠外部形态对其进行种类鉴定比较困难，因此，亟需方便、快速鉴定美雕齿小蠹的方法。

线粒体基因(mtDNA)具有结构简单，序列保守专一，易于操作，母性遗传，单拷贝，没有重组、倒位、易位等突变现象，比核基因更小的特点，故可作为分子标记广泛应用于昆虫系统学研究。而且线粒体蛋白质编码基因：细胞色素氧化酶I甲基(mtDNA-COI)由于分布的普遍性、序列和结构的相对保守性而被广泛应用于不同分类阶元的系统发育研究。

然而，目前尚未见有利用美雕齿小蠹的COI序列设计特异性引物，并将其用于快速鉴定美雕齿小蠹的相关报道。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有形态学鉴定难点，提供一种用于鉴定美雕齿小蠹的引物对。

本发明的另一目的是提供一种用于鉴定美雕齿小蠹的试剂盒。

本发明的再一目的是提供上述用于鉴定美雕齿小蠹的引物对以及试剂盒的应用。

本发明的上述目的通过以下方案予以实现：

一种用于鉴定美雕齿小蠹的引物对，具体序列如下：

上游引物IC96-F：5’-ATTGGCTTACTTGGTTTC-3’；

下游引物IC323-R：5’-TCCTGTGAGACCTCCTAT-3’。

所述的用于鉴定美雕齿小蠹的引物对在制备用于鉴定美雕齿小蠹的试剂盒中的应用。

一种用于鉴定美雕齿小蠹的试剂盒，包括上述用于鉴定美雕齿小蠹的引物对。

所述的用于鉴定美雕齿小蠹的试剂盒，还包括用于PCR的试剂。

所述的用于PCR的试剂包括用于PCR的酶、PCR缓冲液和用于PCR的水中的至少一种。

所述的用于PCR的酶优选为Taq DNA聚合酶。

所述的Taq DNA聚合酶的浓度优选为1～5U/μL；更优选为1.25U/μL。

所述的PCR缓冲液优选为2×PCR缓冲液、5×PCR缓冲液或10×PCR缓冲液。

所述的2×PCR缓冲液为含有MgCl₂和dNTP混合物的缓冲液，其中，MgCl₂的浓度为2mmol/mL，dNTP混合物的浓度为400μmol/mL。

所述的用于鉴定美雕齿小蠹的试剂盒在鉴定美雕齿小蠹中的应用。

一种用于鉴定美雕齿小蠹的方法，包括如下步骤：

(1)提取待鉴别美雕齿小蠹的基因组DNA；

(2)以步骤(1)中提取的基因组DNA为模板，利用上述引物对配制PCR反应体系进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(3)将步骤(2)中PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，处理后并统计凝胶电泳结果；

(4)分析步骤(3)中的凝胶电泳结果，鉴定是否为美雕齿小蠹。

步骤(1)中所述的基因组优选通过SDS法提取得到。

步骤(1)中所述的DNA模板的检测浓度为0.1～100ng/μL；优选为1～100ng/μL。

步骤(2)中所述的PCR反应体系优选为：1×PCR缓冲液，上游引物0.2～0.5μmol/mL，下游引物0.2～0.5μmol/mL、Taq DNA聚合酶0.02～0.03U/μL，DNA模板0.1～100ng/μL，余量为ddH₂O；更优选为：1×PCR缓冲液，上游引物0.4μmol/mL，下游引物0.4μmol/mL、TaqDNA聚合酶0.025U/μL，DNA模板0.1～100ng/μL，余量为ddH₂O。

步骤(2)中所述的PCR扩增的条件优选为：94℃变性3min；98℃变性10s、48℃退火20s、68℃延伸30s，35个循环；68℃总延伸5min。

步骤(3)中所述的电泳为2％琼脂糖TAE凝胶电泳。

所述的处理包括用GeneGreen核酸染料染色，在凝胶成像系统上观察记录和拍照等步骤。

步骤(4)中所述的鉴定的方法为：若凝胶上出现美雕齿小蠹特异性条带即可判断待鉴别样品是美雕齿小蠹；反之，不是美雕齿小蠹。

所述的美雕齿小蠹特异性条带的长度为228bp。

与现有技术相比，本发明具有如下的优点及有益效果：

(1)本发明发明人在前期对不同种类的小蠹的研究中，得到了相应的COI基因序列，通过种间COI基因序列的差异分析，根据美雕齿小蠹的COI基因序列特征，筛选特异性引物，建立了基于“聚合酶链式反应(PCR)”分子检测体系，克服了传统形态学检测的局限，可以有效区分美雕齿小蠹与7个口岸常截获的近缘种类，从而实现了对美雕齿小蠹的快速、准确和稳定的检测。而且通过灵敏性实验表明，PCR方法能够检测出0.1ng/μL浓度的样品。

(2)本发明建立的常规PCR检测方法适用于美雕齿小蠹不同虫态的检测，为我国齿小蠹属在分子水平上的分类和近缘种的快速鉴定方面奠定了基础。本发明的研究结果可直接应用于进出境植物检疫中美雕齿小蠹的检疫鉴定，对保护我国农林生产安全、维持生态平衡，保证公共卫生安全都有极为重要的意义。

附图说明

图1为本发明实施例2的常规PCR特异性验证结果图；其中，泳道M为DL2000Marker，泳道1为美雕齿小蠹MD5，泳道2为美雕齿小蠹MD6，泳道3为美雕齿小蠹MD12，泳道4为十二齿小蠹，泳道5为云杉八齿小蠹，泳道6为粒点假齿小蠹，泳道7为南部松齿小蠹，泳道8为美松齿小蠹，泳道9为大云齿小蠹，泳道10为蒙大拿齿小蠹。

图2为本发明实施常规PCR特异性引物的灵敏度检测结果图；其中，泳道M是DL2000Marker，泳道1是浓度梯度为100ng/μL的模板DNA，泳道2是浓度梯度为10ng/μL的模板DNA，泳道3是浓度梯度为1ng/μL的模板DNA，泳道4是浓度梯度为10^-1ng/μL的模板DNA，泳道5是浓度梯度为10^-2ng/μL的模板DNA，泳道6是浓度梯度为10^-3ng/μL的模板DNA。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所涉及的试剂、方法，如无特殊说明，均为本领域常用的试剂和方法，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

实施例1引物对的筛选

通常情况下，形态学鉴定方法需要具备专业知识的技术人员进行操作，而一线检验鉴定人员大部分不具备这样的技术要求。为解决上述问题，本发明所使用的全部样本已通过形态学鉴定，并经昆虫学研究员廖力复核(主要参考书目有：Evans A V.Beetles ofEastern North America[M].Princeton University Press,2014.；Douglas H B,CognatoA I,Grebennikov V,et al.Dichotomous and matrix-based keys to the Ips barkbeetles of the World(Cole optera:Curculionidae:Scolytinae)[J].CanadianJournal of Arthropod Identification,2019(38)：1-234.；安榆林主编.外来森林有害生物检疫[M].科学出版社,2012.)，其中，美雕齿小蠹、十二齿小蠹、云杉八齿小蠹、南部松齿小蠹、美松齿小蠹和蒙大拿齿小蠹已在文献：“汪莹等.进口美国松木中截获齿小蠹的鉴定.应用昆虫学报，2016，53(6):1391-1400”中公开；粒点假齿小蠹和大云齿小蠹已在文献：“李洋等.北美洲云杉属植物上9种齿小蠹的检疫鉴定.植物检疫，2019(3)：63-68.”中公开。

实验克隆鉴定了我国各口岸进境木材常截获的齿小蠹(包括美雕齿小蠹Ipscalligraphus及其7个近缘种类十二齿小蠹Ips sexdentatus、云杉八齿小蠹Ipstypographus、粒点假齿小蠹Pseudips concinnus、南部松齿小蠹Ips grandicollis、美松齿小蠹Ips pini、大云齿小蠹Ips tridens和蒙大拿齿小蠹Ips montanus)的COI序列，用于对齿小蠹属种间遗传差异进行研究。结果意外发现，COI序列在齿小蠹属种内高度保守，种间又有一定程度的变异，是比较好的研究齿小蠹属不同种间系统发育关系的标记基因。鉴于此，本发明根据美雕齿小蠹的COI基因片段序列设计了如表1所示的用于鉴定美雕齿小蠹的特异性引物对。

表1：本发明所涉及的引物对

名称	序列(5’-3’)
		上游引物IC96-F	ATTGGCTTACTTGGTTTC
下游引物IC323-R	TCCTGTGAGACCTCCTAT
		下游引物IC341-R	AGAGTTGGCAAGAATGAC
下游引物IC465-R	GACCTGTAAATAAAGGGAAT

DNA模板的制备：取检测标本置于200μL离心管中，加入60μL提取液A(含1％SDS缓冲液，50mmol/L Tris·HCl，25mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA)，用烧熔枪头研磨充分，振荡混匀后于65℃孵化45min；孵化结束后，加入等体积提取液B(3mol/L pH7.2的KAC)，缓慢上下颠倒混匀后于冰上放置1h，12000rpm离心10min，取上清液至新的500μL离心管中，加入2倍体积冷冻无水乙醇混匀后置于-20℃冷冻1h；接着于12000rpm离心10min，弃上清，加入400μL 75％(v/v)酒精洗涤沉淀，12000rpm离心10min，晾干酒精后用50μL双蒸水溶解沉淀。用微量分光光度仪测定DNA浓度和纯度后，将样品于-20℃保存备用。

PCR反应体系：

反应总体积为30μL，各成分组成如下：15μL的2×PCR缓冲液(含MgCl₂ 2mmol/mL；dNTP混合物400μmol/mL)、上下游引物(每种引物的浓度为10μmol/mL，IC96-F和IC323-R为第一对引物，IC96-F和IC341-R为第二对引物，IC96-F和IC465-R为第三对引物，)各1.2μL、0.6μL Taq DNA聚合酶(浓度为1.25U/μL)，2μL DNA模板(约40ng)，余量为ddH₂O。根据引物对计，有三组反应体系。IC96-F位于美雕齿小蠹COI基因的第96～113bp位置处，下游引物IC323-R位于美雕齿小蠹COI的第306～323bp位置处，下游引物IC341-R位于美雕齿小蠹COI的第324～341bp位置处，下游引物IC465-R位于美雕齿小蠹COI的第446～465bp位置处。依据第一对引物扩增得到的理论条带长度为228bp，依据第二对引物扩增得到的理论条带长度为246bp，依据第三对引物扩增得到的理论条带长度为370bp。

PCR反应条件是：94℃变性3min；98℃变性10s、47～54℃退火20s、68℃延伸30s，35个循环；68℃总延伸5min。PCR扩增完成后，取10μL PCR反应产物及上样缓冲液在2％琼脂糖TAE凝胶电泳分离，GeneGreen核酸染料染色，在凝胶成像系统上观察记录和拍照。采用梯度PCR进行，退火温度按1℃递增，每组有8个温度梯度。

PCR结果显示，第1对引物有较好的扩增目的条带，且在48℃得到的PCR产物条带清晰，特异性强；第2对引物无扩增条带，第3对引物存在非特异性扩增和扩增条带弱的情况。因此，本发明采用第1对引物作为鉴别美雕齿小蠹的特异性引物。

实施例2美雕齿小蠹的鉴定

本实施例利用实施例1筛选得到的美雕齿小蠹的特异性引物(即IC96-F和IC323-R)对美雕齿小蠹Ips calligraphus及其7个我国口岸常截获的近缘种类十二齿小蠹Ipssexdentatus、云杉八齿小蠹Ips typographus、粒点假齿小蠹Pseudips concinnus、南部松齿小蠹Ips grandicollis、美松齿小蠹Ips pini、大云齿小蠹Ips tridens和蒙大拿齿小蠹Ips montanus进行PCR特异性检测，各标本编号及来源见下表2：

表2：美雕齿小蠹及其近缘种基本信息

注：上述所有标本经形态学鉴定，廖力研究员复核。

具体检测步骤为：

(1)提取待鉴别美雕齿小蠹的基因组DNA

DNA模板的制备：取检测标本置于200μL离心管中，加入60μL提取液A(含1％SDS缓冲液，50mmol/L Tris·HCl，25mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA)，用烧熔枪头研磨充分，振荡混匀后于65℃孵化45min；孵化结束后，加入等体积提取液B(3mmol/L、pH7.2的KAC)，缓慢上下颠倒混匀后于冰上放置1h，12000rpm离心10min，取上清液至新的500μL离心管中，加入2倍体积冷冻无水乙醇混匀后置于-20℃冷冻1h；接着于12000rpm离心10min，弃上清，加入400μL 75％(v/v)酒精洗涤沉淀，12000rpm离心10min，晾干酒精后用50μL双蒸水溶解沉淀。用微量分光光度仪测定DNA浓度和纯度后，将样品于-20℃保存备用。

(2)建立高效稳定的PCR反应体系

反应总体积为30μL，各成分组成如下：15μL的2×PCR缓冲液(含MgCl₂ 2mmol/mL；dNTP混合物400mol/mL)、上下游引物(IC96-F和IC323-R、10μmol/mL)各1.2μL、0.6μL TaqDNA聚合酶(浓度为1.25U/μL)，2μL DNA模板，余量为ddH₂O。然后进行PCR扩增，PCR反应条件是：94℃变性3min；98℃变性10s、48℃退火20s、68℃延伸30s，35个循环；68℃总延伸5min。PCR扩增完成后，取10μL PCR反应产物及上样缓冲液在2％琼脂糖TAE凝胶电泳分离，GeneGreen核酸染料染色，在凝胶成像系统上观察记录和拍照。为确保结果的可靠性，每次实验均重复三次以上。

特异性验证：用特异性扩增引物IC96-F和IC323-R对美雕齿小蠹Ipscalligraphus及其7个近缘种类十二齿小蠹Ips sexdentatus、云杉八齿小蠹Ipstypographus、粒点假齿小蠹Pseudips concinnus、南部松齿小蠹Ips grandicollis、美松齿小蠹Ips pini、大云齿小蠹Ips tridens和蒙大拿齿小蠹Ips montanus进行PCR特异性检测，结果如图1所示。

从图1可以看出，美雕齿小蠹的3个样品均能扩增出1条228bp左右的DNA片段，其它7个近缘种均未扩增出特异性条带，表明该体系具有良好的特异性。

检测灵敏度：选用美雕齿小蠹样本MD12的6个不同浓度的DNA模板来确定PCR的检测灵敏度；其中，DNA模板浓度分别为100ng/μL、10ng/μL、0.1ng/μL、1×10^-2ng/μL、1×10^{- 3}ng/μL、Marker为DL2000 Marker，结果如图2。

从图2可以看出，模板DNA浓度为1～100ng/μL时，能够扩增出强烈的检测信号；对于0.1ng/μL的DNA模板，扩增产物明显降低，检测信号较弱；模板浓度低于0.1ng/μL时，由于无扩增产物或检测信号太弱而无法检出。表明该方法的检测限度为0.1ng/μL，最适检测浓度为1～100ng/μL。

另外，上述特异性常规PCR扩增产物测序结果与美雕齿小蠹的DNA序列完全吻合，进一步证明了上述检测方法是对美雕齿小蠹的特异性扩增。

综上所述，以上结果表明该方法是一种快速、稳定可靠、灵敏度高的美雕齿小蠹快速分子鉴定方法，适用于美雕齿小蠹不同虫态的检测。该方法为我国的鞘翅目小蠹科齿小蠹属在分子水平上的分类和近缘种的快速鉴定奠定了基础。研究结果可直接应用于进出境植物检疫中美雕齿小蠹的检疫鉴定，这对保护我国农林业生产安全及维持生态平衡方面有极为重要的意义。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 拱北海关技术中心

<120> 一种用于鉴定美雕齿小蠹的引物对、试剂盒及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<223> 上游引物IC96-F

<400> 1

attggcttac ttggtttc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<223> 下游引物IC323-R

<400> 2

tcctgtgaga cctcctat 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<223> 下游引物IC341-R

<400> 3

agagttggca agaatgac 18

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<223> 下游引物IC465-R

<400> 4

gacctgtaaa taaagggaat 20

Claims (9)

1.一种用于鉴定美雕齿小蠹的引物对，其特征在于：所述的引物对由如SEQ ID NO.1所示的上游引物IC96-F和如SEQ ID NO.2所示的下游引物IC323-R组成。

2.权利要求1所述的用于鉴定美雕齿小蠹的引物对在制备用于鉴定美雕齿小蠹的试剂盒中的应用。

3.一种用于鉴定美雕齿小蠹的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的用于鉴定美雕齿小蠹的引物对。

4.根据权利要求3所述的用于鉴定美雕齿小蠹的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括用于PCR的试剂；所述的用于PCR的试剂包括用于PCR的酶、PCR缓冲液和用于PCR的水中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的用于鉴定美雕齿小蠹的试剂盒，其特征在于：

所述的用于PCR的酶为Taq DNA聚合酶；

所述的PCR缓冲液为2×PCR缓冲液、5×PCR缓冲液或10×PCR缓冲液。

6.权利要求3～5任一项所述的用于鉴定美雕齿小蠹的试剂盒在鉴定美雕齿小蠹中的应用。

7.一种用于鉴定美雕齿小蠹的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）提取待鉴别美雕齿小蠹的基因组DNA；

（2）以步骤（1）中提取的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的引物对配制PCR反应体系进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

（3）将步骤（2）中PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，处理后并统计凝胶电泳结果；

（4）分析步骤（3）中的凝胶电泳结果，鉴定是否为美雕齿小蠹；若凝胶上出现美雕齿小蠹特异性条带即可判断待鉴别样品是美雕齿小蠹；反之，不是美雕齿小蠹；所述的美雕齿小蠹特异性条带的长度为228 bp。

8.根据权利要求7所述的用于鉴定美雕齿小蠹的方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的PCR反应体系为：1×PCR缓冲液，上游引物0.2～0.5 µmol/mL，下游引物0.2～0.5 µmol/mL、Taq DNA聚合酶0.02～0.03 U/µL，DNA模板0.1～100 ng/μL，余量为ddH₂O。

9.根据权利要求7所述的用于鉴定美雕齿小蠹的方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的PCR扩增的条件为：94℃变性3min；98℃变性10s、48℃退火20s、68℃延伸30s，35个循环；68℃总延伸5min。

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