CN107904315B

CN107904315B - 锈色棕榈象甲特异性引物及快速分子检测方法

Info

Publication number: CN107904315B
Application number: CN201711173881.7A
Authority: CN
Inventors: 宗世祥; 陶静; 骆有庆; 任利利; 阎伟
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2017-11-22
Filing date: 2017-11-22
Publication date: 2021-01-15
Anticipated expiration: 2037-11-22
Also published as: CN107904315A

Abstract

本发明提供了锈色棕榈象甲特异性引物及快速分子检测方法。本发明通过分析锈色棕榈象甲线粒体COI基因，设计了特异性引物对，所述特异性引物对核苷酸序列分别见序列表SEQ ID No.1‑2和SEQ ID No.3‑4所示。本发明的锈色棕榈象甲快速分子检测方法，是以样品总DNA为模板，利用上述两对引物的任一对进行PCR扩增，根据琼脂糖电泳判定结果。本发明引物特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度好，为锈色棕榈象甲的鉴定提供了检测方法。

Description

锈色棕榈象甲特异性引物及快速分子检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测鉴定技术，具体地说涉及对锈色棕榈象甲进行PCR鉴定用引物及使用该引物对锈色棕榈象甲进行的PCR鉴定方法。

背景技术

随着全球经济一体化的加快，林业外来生物入侵的形势日趋严峻。一些重大林业入侵物种已对我国的森林资源、物种多样性与生态安全造成了重大损失。

锈色棕榈象甲Rhynchophorus ferrugineus(Oliver)属鞘翅目Coleoptera象甲科Curculionidae隐颏象亚科Rynchoporinae棕榈象属Rhynchophorus，又称红棕象甲、椰子隐喙象、椰子甲虫、亚洲棕榈象甲、印度锈色棕榈象甲，被列入我国进境植物检疫性有害生物名录和林业检疫性有害生物名录。锈色棕榈象甲主要在棕榈植物叶柄基部和生长点附近的干部危害，其危害主要发生在幼虫期。幼虫钻进树干内取食茎杆疏导组织，致使树干成空壳，树势渐衰弱，易受风折。由于幼虫在树干内危害，初期受害不易发现，一旦发现，受害植株多无法挽救，而油棕、椰子等棕榈植物成林时间较长，一旦死亡，损失较大。

锈色棕榈象甲原产南亚和东南亚，1906年作为椰子Cocos nucifera的主要害虫在印度被报道，1920年在伊拉克发现，直到20世纪80年代中期锈色棕榈象甲作为海枣PhoenixSpp.的主要害虫在中东地区大面积暴发，此后逐渐由北非向欧洲蔓延，90年代末几乎使地中海沿岸国家和地区的油棕Elaeis guineensis全部死亡。现已广泛分布于全球，包括以色列、科威特、埃及、法国、葡萄牙、巴基斯坦、菲律宾、日本、澳大利亚、墨西哥等40多个国家和地区。我国于20世纪90年代在福建(厦门)首次发现锈色棕榈象甲，随后广东、广西(1997)、海南(2000)、云南(2000)、上海(2003)、浙江(2007)、重庆(2008)、贵州(2010)。目前，包括西藏(墨脱)在内我国已有13个省市自治区不同程度地受到锈色棕榈象甲的危害。主要危害树种有油棕、椰子、加拿利海枣Phoenix canariensis、槟榔Areca catechu、糖棕Borassusflabellifer、霸王棕Bismarckia nobilis、等30余种棕榈科植物及甘蔗Saccharum sp.。

锈色棕榈象甲对3-15年生棕榈植物危害较重，较少危害30-50年生的老树。成虫喜产卵于植株幼嫩组织伤口上，幼虫孵化后从树冠受害部位侵入树体，而不从树干的受伤部位侵入。锈色棕榈象甲早期危害很难被察觉，后期被害树与健康树有明显差异，受害树中心叶片干枯，叶子减少，倒披下来，当移开枯死的叶柄，能看到锈色棕榈象甲结的茧，剥开表皮可看到幼虫钻蛀的坑道。受害严重的植株，心叶枯萎，生长点死亡，只剩下数片老叶，此时植株难以挽救，有的树干甚至被蛀食中空，只剩下空壳。锈色棕榈象甲的危害，不仅给国民经济造成巨大损失，也破坏了自然景观及生态环境，成为绿色棕榈植物资源的一大“杀手”，对我国丰富的热带木本粮油树种资源及产业构成严重威胁。

植物检疫，是防止外来有害生物入侵和扩散的最有效的手段。近年来，我国在棕榈科苗木调运中不断截获锈色棕榈象甲。为了将锈色棕榈象甲和国内常见象甲类昆虫区分开来，需要大量形态学鉴别工作，这些工作大多费时、费力且需要专业的昆虫分类学知识。并且，处于卵、幼虫、蛹这三个虫态的象甲类昆虫在形态上非常相似，只能在获取到成虫样本的时候才能进行，处于卵、幼虫、蛹这三个虫态的象甲类昆虫在形态上非常相似，目前还没有可靠的鉴定特征。

近些年，越来越多的研究已证明分子生物学手段能够为鉴定害虫提供有力依据。线粒体DNA严格母性遗传，其中的细胞色素氧化酶I基因(COI)具有高度保守，结构稳定，无内含子的特点。因此，常作为昆虫DNA条形码用于物种分类、鉴定和亲缘关系的研究。目前尚无锈色棕榈象甲的分子快速鉴定技术。

为了保护我国林业种质资源，需要建立一种能够对难以从形态上进行判断的锈色棕榈象甲进行辨别，且应该适合检验检疫部门检查应用，简单且精确的锈色棕榈象甲快速鉴定方法，以防止锈色棕榈象甲通过国内外苗木调运进入国境危害林业。

发明内容

本发明的目的在于提供一种锈色棕榈象甲的PCR鉴定用引物及PCR鉴定方法，对难以从形态上进行判断的锈色棕榈象甲进行简单且精确的鉴定。

本发明以锈色棕榈象甲为靶标，与锈色棕榈象甲在国内常见的象甲种类作为参照，设计基于线粒体COⅠ基因序列的种特异性引物，并构建和优化了锈色棕榈象甲的快速分子检测体系。

本发明首先提供了锈色棕榈象甲PCR鉴定用的特异性引物，其核苷酸序列如SEQID NO.1-2，或SEQ ID NO.3-4所示。

本发明提供了上述特异性引物在苗木害虫检验检疫中的应用。

本发明进一步提供了锈色棕榈象甲PCR鉴定用的特异性引物组合，该引物组合含有2对特异性引物对，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-2和SEQ ID NO.3-4所示。

本发明提供了上述特异性引物组合在苗木害虫检验检疫中的应用。

本发明还提供了上述特异性引物或特异性引物组合在鉴定锈色棕榈象甲中的应用。

具体地，本发明提供一种锈色棕榈象甲的快速分子检测方法，该方法以样品总DNA为模板，利用上述特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳判定结果，当以SEQID NO.1-2所示的引物进行PCR扩增时，若扩增产物为458bp，则待测样品来自锈色棕榈象甲；或当以SEQ ID NO.3-4所示的引物进行PCR扩增时，若扩增产物为454bp，则待测样品来自锈色棕榈象甲。

上述快速分子检测方法中，25μL PCR反应体系为：

其中，PCR的反应条件为：预变性94℃、2min；再经94℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸10min。

所述样品总DNA来自锈色棕榈象甲的去头和鞘翅的成虫，或幼虫的腹部组织。

更进一步地，本发明提供了一种锈色棕榈象甲的快速分子检测方法，该方法以样品总DNA为模板，利用上述2对特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳判定结果，当以SEQ ID NO.1-2所示的引物进行PCR扩增时，扩增产物为458bp，并且当以SEQ IDNO.3-4所示的引物进行PCR扩增时，扩增产物为454bp，则待测样品来自锈色棕榈象甲。

上述快速分子检测方法中，25μL PCR反应体系为：

本发明提供了一种锈色棕榈象甲鉴定用试剂盒，含有SEQ ID NO.1-2所示的特异性引物或含有SEQ ID NO.3-4所示的特异性引物。

本发明还提供了一种锈色棕榈象甲鉴定用试剂盒，含有SEQ ID NO.1-2和SEQ IDNO.3-4所示的特异性引物。

本发明的试剂盒可以是由多个隔断所形成，以容纳固定一个或多个如管或小瓶的容器。这些容器之一或者多个可以装有本发明的引物，根据需要该引物可以是冻干形式或溶于缓冲液中的状态。另外，本发明的试剂盒中还可以包括用于PCR反应的一种或多种酶/试剂，以及实施本发明所需要的其它成分及用具。

通过使用本发明的引物，对锈色棕榈象甲的DNA进行扩增，生成锈色棕榈象甲特异扩增片段，具有种特异性，从而能够特异且精确地对锈色棕榈象甲进行鉴定，并且能有效地缩短试验时间。本发明建立了适合口岸应用的简便的锈色棕榈象甲检测方法，操作快捷、结果准确，灵敏度高，最小检测限为2pg的基因组DNA，避免了用传统的形态分类学和细胞学方法所产生的耗费时间和易疏漏的缺陷，可用于出入境苗木及木质包装材料运输中锈色棕榈象甲的快速鉴定。

附图说明

图1为琼脂糖凝胶电泳检测九种象甲PCR扩增产物的电泳图，图1A为COⅠ通用引物扩增产物电泳图；图1B为锈色棕榈象甲特异性SS-COⅠ引物RFSSF1/RFSSR1扩增产物电泳图；图1C为锈色棕榈象甲特异性SS-COⅠ引物RFSSF2/RFSSR2扩增产物电泳图。图中M：DL2000DNAmarker(从上至下2000,1000,750,500,250,100bp)；泳道：1-锈色棕榈象甲Rhynchophorus.ferrugineus，2-杨干象Cryptorrhynchus lapathi，3-沟眶象Eucryptorrhynchus.chinensis，4-臭椿沟眶象Eucryptorrhynchus brandti，5-芒果果核象甲Odoiporus.longicollis，6-香蕉球茎象甲Cryptorrhynchus.lapathi,7-马尾松角胫象Shirahoshizo patruelis，8-玉米象Sitophilus zeamais，9-松瘤象Hyposipalusgigas，10-阴性对照。

图2琼脂糖凝胶电泳检测锈色棕榈象甲种特异性引物的灵敏度检测图，图2A为特异性引物RFSSF1/RFSSR1引物扩增结果；图2B为特异性引物RFSSF2/RFSSR2引物扩增结果。图中M：DL2000DNAmarker(从上至下2,000,1000,750,500,250,100bp)；泳道1-6代表：分别为20ng,2ng,200pg,20pg,2pg和200fg的锈色棕榈象甲基因组DNA，泳道7-阴性对照。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1引物的设计

1、9种象甲的总DNA提取采用BIOMIGA公司的EZgene^TMInsect gDNA Kit(GD2413-02)试剂盒进行。

9种象甲分别为：1-锈色棕榈象甲Rhynchophorus.ferrugineus，2-杨干象Cryptorrhynchus lapathi，3-沟眶象Eucryptorrhynchus.chinensis，4-臭椿沟眶象Eucryptorrhynchus brandti，5-芒果果核象甲Odoiporus.longicollis，6-香蕉球茎象甲Cryptorrhynchus.lapathi,7-马尾松角胫象Shirahoshizo patruelis，8-玉米象Sitophilus zeamais，9-松瘤象Hyposipalus gigas。

2、象甲COⅠ基因序列的扩增

根据文献报道，合成象甲类昆虫COⅠ基因序列扩增通用引物：

C1-J-2183:5’-CAA CAT TTATTT TGATTT TTT GG-3’，(SEQ ID NO.5)

TL-2-N-3014：5’-TCC ATT GCA CTA TAC TGC CAT ATT A-3’(SEQ ID NO.6)

PCR扩增反应使用

GreenMaster Mix试剂盒(Promega)，总体系为25μl，各成分如表1所示：

表1 PCR反应体系

混匀后放入PCR仪中进行扩增，扩增的程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，49℃复性45s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸10min。每次反应用无菌蒸馏水做一个空白对照，用以排除系统误差。取3μl产物上样到1.5％TAE琼脂糖凝胶上。经130V电泳20min后，将胶块浸泡于EB染料中3min，在紫外分光光度计下检测拍照。

3.近缘种多重序列对比及种特异性引物设计

将PCR产物送诺赛生物(北京)公司进行双向测序，得到COⅠ序列。使用DNAstar对序列进行拼接，去除冗余序列，将序列结果在GenBank中进行Blast序列比对。根据9种象甲的测序结果以及数据库中已公开的4种象甲的碱基序列进行对比分析，运用软件PrimerPrimer 5.0软件设计到多对引物，经过进一步的筛选和分析，又筛选到5对扩增效果较好的引物，其中3对(RFSSF3/RFSSR3；RFSSF4/RFSSR4；RFSSF5/RFSSR5)的特异性效果不佳，最终选定锈色棕榈象甲特异性SS-COⅠ引物2对(RFSSF1/RFSSR1；RFSSF2/RFSSR2)：

RFSSF1：5’-TAC ACC CAC AGC TCT ATG AA-3’(SEQ ID NO.1)

RFSSR1：5’-AGA AGA AGC CAG TCT TAC TCT-3’(SEQ ID NO.2)

RFSSF2：5’-TTG GTG GAC TAA CAG GAG-3’(SEQ ID NO.3)

RFSSR2：5’-AAT GAT CGG TAG GTG GAA-3’(SEQ ID NO.4)

RFSSF3：5’-TCC AGG ATT TGG GAA ATC TCC-3’(SEQ ID NO.7)

RFSSR3：5’-TTT TCT ATC ATC TCG CCC CC-3’(SEQ ID NO.8)

RFSSF4：5’-TCT TCC AGG ATT TGG GAA ATC-3’(SEQ ID NO.9)

RFSSR4：5’-CCC CCC TTA CTG CCA TAT T-3’(SEQ ID NO.10)

RFSSF5：5’-GAA ACT TTC GGA GTT TTA GGT-3’(SEQ ID NO.11)

RFSSR5：5’-TGT TCG GCT GGA GGT AAA AA-3’(SEQ ID NO.12)。

实施例2快速检测锈色棕榈象甲的PCR扩增方法的建立

1、PCR反应体系

以锈色棕榈象甲总DNA为模板，进行PCR反应，25μL反应体系见表1。

2、PCR反应条件

设置如下条件进行反应：预变性94℃、2min；再经94℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸10min。

3、反应结束后酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳判定结果，当以SEQ ID NO.1-2所示的引物进行PCR扩增时，若扩增产物为458bp，则待测昆虫样品阳性，为锈色棕榈象甲；

当以SEQ ID NO.3-4所示的引物进行PCR扩增时，若扩增产物为454bp，则待测昆虫样品阳性，为锈色棕榈象甲。

实施例3本发明锈色棕榈象甲PCR方法的特异性和灵敏度

以国内常见的9种象甲类昆虫(见实施例1)的DNA为模板，以锈色棕榈象甲DNA为阳性对照，检验实施例1设计得到的锈色棕榈象甲SS-COⅠ引物RFSSF1/RFSSR1和RFSSF2/RFSSR2的种特异性。以不同浓度的锈色棕榈象甲DNA标准品为模板进行扩增，检验该引物的灵敏度。

1、标准品的制备

将9种象甲的DNA进行浓度和纯度测定后，配置成10ng/μl浓度的母液。并将锈色棕榈象甲DNA样本按照(1:10)的比例依次稀释成10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl的标准液。所有标准液储存于4℃备用。

2、SS-COⅠ种特异性引物的扩增

PCR扩增反应使用

GreenMaster Mix试剂盒(Promega)，反应体系与COⅠ基因序列扩增体系相同(见表1)。扩增的程序参照实施例2。每次反应用无菌蒸馏水做一个空白对照，用以排除系统误差。取3μl产物上样到1.5％TAE琼脂糖凝胶上。经130V电泳20min后，将胶块浸泡于EB染料中3min，在紫外分光光度计下检测拍照。

3、锈色棕榈象甲SS-COⅠ引物的种特异性检验结果

利用COⅠ通用引物，9种象甲均扩增约830bp的产物，见图1A，而利用本发明设计的锈色棕榈象甲特异性SS-COⅠ引物RFSSF1/RFSSR1和RFSSF2/RFSSR2进行PCR，仅有锈色棕榈象甲成功扩增，产物为458bp、454bp，对其它8种象甲和阴性对照均不具有扩增能力(见图1B-图1C)，表明本发明实施例1设计的2对引物为锈色棕榈象甲的种特异性引物。

4、锈色棕榈象甲SS-COⅠ引物的灵敏度检验

利用不同浓度梯度的锈色棕榈象甲DNA标准品进行特异性引物灵敏度检验(见图2A和图2B)。PCR检验的最小检测限度为2pg的基因组DNA。

以上结果表明，该发明可用于出入境植物苗木及木质包装材料运输中锈色棕榈象甲的快速鉴定。

以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 北京林业大学

<120> 锈色棕榈象甲特异性引物及快速分子检测方法

<130> KHP171117038.9

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tacacccaca gctctatgaa 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agaagaagcc agtcttactc t 21

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttggtggact aacaggag 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aatgatcggt aggtggaa 18

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caacatttat tttgattttt tgg 23

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tccattgcac tatactgcca tatta 25

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tccaggattt gggaaatctc c 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttttctatca tctcgccccc 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcttccagga tttgggaaat c 21

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccccccttac tgccatatt 19

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaaactttcg gagttttagg t 21

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tgttcggctg gaggtaaaaa 20

Claims

1.锈色棕榈象甲PCR鉴定用的特异性引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2，或SEQ ID NO.3-4所示。

2.锈色棕榈象甲PCR鉴定用的特异性引物组合，其特征在于，含有2对特异性引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2和SEQ ID NO.3-4所示。

3.权利要求1所述的特异性引物或权利要求2所述的特异性引物组合在鉴定锈色棕榈象甲中的应用。

4.一种锈色棕榈象甲的快速分子检测方法，该方法以样品总DNA为模板，利用权利要求1所述的特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳判定结果，当以SEQ IDNO.1-2所示的引物进行PCR扩增时，若扩增产物为458bp，则待测样品来自锈色棕榈象甲；或当以SEQ ID NO.3-4所示的引物进行PCR扩增时，若扩增产物为454bp，则待测样品来自锈色棕榈象甲。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，25μL PCR反应体系为：

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR的反应条件为：94℃预变性2min；再经94℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸10min。

7.如权利要求4-6任一所述的方法，其特征在于，样品总DNA来自锈色棕榈象甲的去头和鞘翅的成虫，或者来自幼虫的腹部组织。

8.一种锈色棕榈象甲鉴定用试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的特异性引物。

9.一种锈色棕榈象甲鉴定用试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的特异性引物组合。