CN109880917B

CN109880917B - 一种检测松针鞘瘿蚊的特异性引物及其应用

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Publication number: CN109880917B
Application number: CN201910300889.8A
Authority: CN
Inventors: 陶静; 焦继鹏; 骆有庆; 任利利
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2019-04-15
Filing date: 2019-04-15
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2039-04-15
Also published as: CN109880917A

Abstract

本发明公开了一种检测松针鞘瘿蚊的特异性引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。该引物特异性高，灵敏度高，能在短时间内快速、准确地进行我国重大林业检疫性害虫松针鞘瘿蚊的鉴定，特别是除成虫和老熟幼虫以外其它虫态的鉴定，可用于国内外苗木调运等检疫工作中松针鞘瘿蚊的快速检测。

Description

一种检测松针鞘瘿蚊的特异性引物及其应用

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种检测松针鞘瘿蚊的特异性引物及其应用。

背景技术

松针鞘瘿蚊属于双翅目(Diptera)瘿蚊科(Cecidomyiidae)鞘瘿蚊属(Thecodiplosis)，异名：T.pinicola(Skuhravá,1986)，英文名为Pine needle gallmidge。松针鞘瘿蚊是危害黑松和赤松的一种小型昆虫，该虫以幼虫匿居于松针基部吸食汁液为害寄主松针鞘瘿蚊2～3年连续危害会导致松林显著衰弱；当年生枝条枯梢率达50％的植株可致死。侵入新的地方后，开始为害单个树木并逐渐扩大形成片状，扩散5～7年后达到为害高峰期，严重时导致30％林木的枯死。幼虫在寄主松针基部取食，导致针叶基部膨大形成虫瘿，受害松针明显缩短，逐渐枯黄脱落，严重影响松树正常生长。研究证明该虫属初期性害虫，被其危害后植株树势衰弱、易被次期性害虫危害，并导致植株死亡；严重危害时单独也可在当年危害松树致死(Skuhraváand Roques，2000)。

Furuno和Sone(1978)接种试验表明，松针鞘瘿蚊可危害多种松属植物。被危害松针基部产生瘿瘤的寄主多属于欧洲赤松亚派，包括：脂松P.resinosa，欧洲黑松P.nigra，欧洲山松P.mugo，岛松P.insularis，美国大果松P.coulteri，欧洲赤松P.sylvestris，琉球松P.luchuensis，辐射松(澳洲、南非)P.radiata，黄山松P.taiwanensis，日本黑松P.thunbergii，马尾松P.massoniana，赤松P.densiflora和油松P.tabulaeformis。

松针鞘瘿蚊原产于东亚，于1901年在日本首次发现，属于日本的本土种。据文献记载，该虫于1924-1925年间在韩国形成第一次大暴发，1929年在韩国首尔市和全南省被发现，1930年该虫在釜山发现，并于1936-1946年间暴发成灾，1964年报道该虫在丹阳发生，该虫是韩国危害黑松和赤松最为严重的害虫，对韩国的生态环境和经济发展造成巨大的损害。1990年在济州岛发现，随后相继扩散至韩国各地。

2006年在我国山东省青岛市黄岛区薛家岛凤凰山南沿海防护林发现黑松和赤松受疑似瘿蚊属害虫危害，且呈现扩散蔓延态势，至2014年薛家岛全部沿海防护林黑松、赤松和部分油松陆续出现大范围针叶枯萎凋落现象，对当地沿海防护林造成严重危害。

植物检疫，是防止外来有害生物入侵和扩散的最有效的手段。为了将松针鞘瘿蚊和国内常见瘿蚊类昆虫区分开来，需要大量形态学鉴别工作，这些工作大多费时、费力且需要专业的昆虫分类学知识。并且，处于卵、低龄幼虫、蛹这三个虫态的瘿蚊类昆虫在形态上非常相似，目前还没有可靠的鉴定特征。近些年，越来越多的研究已证明分子生物学手段能够为鉴定害虫提供有力依据。线粒体DNA严格母性遗传，其中的细胞色素氧化酶I基因(COI)具有高度保守，结构稳定，无内含子的特点。因此，常作为昆虫DNA条形码用于物种分类、鉴定和亲缘关系的研究。目前尚无松针鞘瘿蚊的分子快速鉴定技术。

发明内容

本发明的主要目的在于利用分子生物学手段，在短时间内快速、准确地进行我国重大林业检疫性害虫松针鞘瘿蚊的鉴定，特别是除成虫和老熟幼虫以外其它虫态(卵、低龄幼虫和蛹)的鉴定。

一种检测松针鞘瘿蚊的特异性引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示。

包括所述松针鞘瘿蚊的特异性引物的检测试剂盒。

一种松针鞘瘿蚊的检测方法，采用PCR扩增方法，扩增引物采用如序列表SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对；

PCR反应程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共进行30个循环；最后72℃延伸5分钟；

将扩增完成之后的原液通过1.5％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，若出现扩增产物为299bp的样品，即为松针鞘瘿蚊。

本发明的有益效果：本发明以松针鞘瘿蚊为靶标，以其他三种在国内常见的瘿蚊种类作为参照，设计基于线粒体COⅠ基因序列的种特异性引物，并构建和优化了松针鞘瘿蚊的快速分子检测体系。本发明设计的检测松针鞘瘿蚊的引物，特异性高，灵敏度高，能在短时间内快速、准确地进行我国重大林业检疫性害虫松针鞘瘿蚊的鉴定，特别是除成虫和老熟幼虫以外其它虫态的鉴定，可用于国内外苗木调运等检疫工作中松针鞘瘿蚊的快速检测。

附图说明

图1为四种瘿蚊利用COⅠ通用引物PCR扩增产物的检测图电泳图；

图中，M：DL2000DNA marker(从上至下2000,1000,750,500,250,100bp)；泳道：1-3泳道：松针鞘瘿蚊T.japonensis；4-6泳道：福建鞘瘿蚊Thecodiplosis sp.；7-9泳道：枣瘿蚊Contarinia sp.；10-11泳道：山核桃瘿蚊Contarinia sp.，12-阴性对照。

图2为四种瘿蚊利用松针鞘瘿蚊特异性SS-COⅠ引物TJSSF1/TJSSR1扩增产物电泳图；

图中，M：DL2000DNA marker(从上至下2000,1000,750,500,250,100bp)；1：松针鞘瘿蚊T.japonensis；2：福建鞘瘿蚊Thecodiplosis sp.；3：枣瘿蚊Contarinia sp.；4：山核桃瘿蚊Contarinia sp.。

图3为松针鞘瘿蚊特异性引物TJSSF1/TJSSR1扩增成虫、幼虫DNA样本电泳图；

图中，M：DL2000DNA marker(从上至下2000,1000,750,500,250,100bp)；1-2：松针鞘瘿蚊成虫；3-4：松针鞘瘿蚊幼虫。

图4琼脂糖凝胶电泳检测松针鞘瘿蚊种特异性引物TJSSF1/TJSSR1的灵敏度；

图中，M：DL2000DNA marker(从上至下2,000,1000,750,500,250,100bp)；泳道1-7分别代表：分别为20ng,2ng,200pg,20pg,2pg和200fg的松针鞘瘿蚊基因组DNA，泳道7-阴性对照。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1昆虫基因组DNA的提取

利用DNA微量提取试剂盒提取采自国内4个地区瘿蚊科不用种的基因组DNA。

(1)将整个虫体放入1.5ml离心管中，加入200ul buffer PBS，用研磨棒研磨充分研磨。

(2)加入150ul buffer PBS和0.9ul Rnase A后温和地研磨30s。

(3)收集350ul研磨好的组织匀浆并转入2ml离心管，如匀浆体积不足350ul，补充PBS至350ul。

(4)加入150ul buffer C-L和20ul proteinase K，立即旋涡震荡1min混合均匀，短暂离心后，将离心管置56℃水浴10min。

(5)加入350ul buffer P-D，漩涡震荡30s混合均匀，12000×g离心10min。

(6)将DNA制备管置于2ml离心管中，将上步中的混合液转移至制备管中，12000×g离心1min。

(7)弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入500ul buffer W1，12000×g离心1min。

(8)弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入700ul buffer W2，12000×g离心1min，以同样的方法，用700ul buffer W2再洗涤一次。

(9)弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，12000×g离心1min。

(10)弃滤液，将制备管置回原来的2ml离心管中，在制备管膜中央加100uleluent，室温静置1min，12000×g离心1min洗脱DNA。

(11)DNA浓度检测。利用超微量分光光度计检测所提DNA的浓度。使用Nanodrop2000(Thermo公司)，检测前用先用去离子水对检测孔进行清洗，擦干后吸取1ul DNA提取时所用的洗脱缓冲液Elution Buffer进行修正，修正完成后吸取2ul样品点入检测孔中，将所有DNA分别测定其浓度。

实施例2瘿蚊COⅠ基因序列的扩增

根据文献报道，合成瘿蚊类昆虫COⅠ基因序列扩增通用引物：

YWJ：5’-AATTGGWGGWTTYGGAAAYTG-3’

YWN：5’-GCTCGAGTATCAACGTCTATWCC-3’

PCR扩增反应使用

GreenMaster Mix试剂盒(Promega)，总体系为25μl，各成分如表1所示：

表1 PCR反应体系

混匀后放入PCR仪中进行扩增，PCR反应程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共进行30个循环；最后72℃延伸5分钟，置于4℃下保存。将扩增完成之后的原液通过1.5％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测(电压120V，时间25分钟，1×TAE作为电泳缓冲液)，并用DL2000DNA Marker标记以确定是否为目标片段，将胶块浸泡于EB染料中3min，在紫外分光光度计下检测拍照。

实施例3近缘种多重序列对比及种特异性引物设计

将PCR产物送诺赛生物(北京)公司进行双向测序，得到COⅠ序列。使用DNAstar对序列进行拼接，去除冗余序列，将序列结果在GeneBank中进行Blast序列比对。根据4种瘿蚊的测序结果以及数据库中已公开的其他4种瘿蚊的碱基序列进行对比分析，运用软件PrimerPrimer 5.0软件设计松针鞘瘿蚊特异性SS-COⅠ引物1对(TJSSF1/TJSSR1)：

TJSSF1:5’-CAGGTAAAGAAAGTAAAAGTAGAATTGTTGTAATT-3’；

TJSSR1:5’-GATTTTGATTACTTCCCCCCTCTATTTC-3’。

实施例4松针鞘瘿蚊SS-COⅠ引物的种特异性及灵敏度检验

以国内常见的瘿蚊类昆虫的DNA为模板，以松针鞘瘿蚊DNA为阳性对照，检验松针鞘瘿蚊SS-COⅠ引物TJSSF1/TJSSR1的种特异性。以不同浓度的松针鞘瘿蚊DNA标准品为模板进行扩增，检验该引物的灵敏度。

(1)标准品的制备

将4种瘿蚊的DNA进行浓度和纯度测定后，配置成10ng/μl浓度的母液。并将松针鞘瘿蚊DNA样本按照(1:10)的比例依次稀释成10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl的标准液。所有标准液储存于4℃备用。

(2)SS-COⅠ种特异性引物的扩增

PCR扩增反应使用

GreenMaster Mix试剂盒(Promega)，反应体系与COⅠ基因序列扩增体系相同(见表2)。PCR反应程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共进行30个循环；最后72℃延伸5分钟，置于4℃下保存。将扩增完成之后的原液通过1.5％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测(电压120V，时间25分钟，1×TAE作为电泳缓冲液)，并用DL2000DNA Marker标记以确定是否为目标片段，将胶块浸泡于EB染料中3min，在紫外分光光度计下检测拍照。

表2 PCR反应体系

利用COⅠ通用引物，4种瘿蚊均扩增约665bp的产物(见图1)，而利用本发明设计的松针鞘瘿蚊特异性SS-COⅠ引物TJSSF1/TJSSR1进行PCR，仅有松针鞘瘿蚊成功扩增，产物为299bp，对其它3种瘿蚊和阴性对照均不具有扩增能力(见图2)，表明该对引物为松针鞘瘿蚊的种特异性引物。

以松针鞘瘿蚊成虫、幼虫的DNA为模板利用SS-COⅠ引物TJSSF1/TJSSR1进行PCR。根据电泳结果显示，成虫、幼虫所提取的DNA均能稳定的扩增出特异性片段(见图3)。

利用不同浓度梯度的松针鞘瘿蚊DNA标准品进行特异性引物灵敏度检验(见图4)。PCR检验的最小检测限度为200pg的基因组DNA。

以上结果表明，该发明可用于出入境植物苗木运输中松针鞘瘿蚊的快速鉴定。

Claims

1.一种检测松针鞘瘿蚊的特异性引物，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示。

2.包括权利要求1所述松针鞘瘿蚊的特异性引物的检测试剂盒。

3.一种松针鞘瘿蚊的检测方法，其特征在于，采用PCR扩增方法，扩增引物采用如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对；

PCR反应程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共进行30个循环；最后72℃延伸5分钟，将扩增完成之后的原液通过1.5%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，若扩增产物出现299bp大小的单一条带，即为松针鞘瘿蚊。