CN113604586A

CN113604586A - 一种黑色枝小蠹的特异性引物

Info

Publication number: CN113604586A
Application number: CN202111034207.7A
Authority: CN
Inventors: 孙雪婷; 高磊; 罗卿权; 王凤; 路广亮; 孙荣华
Original assignee: Shanghai Academy of Landscape Architecture Science and Planning
Current assignee: Shanghai Academy of Landscape Architecture Science and Planning
Priority date: 2021-09-03
Filing date: 2021-09-03
Publication date: 2021-11-05

Abstract

本发明涉及分子检测技术领域，具体涉及一种黑色枝小蠹的特异性引物。本发明所提供的特异性引物序列如SEQ ID No.1‑2所示，本发明还提供使用特异性引物检测黑色枝小蠹的方法，包括，以待测样品DNA为模板，使用如SEQ ID No.1‑2所示的引物进行PCR扩增。本发明提供的方法特异性强、灵敏度高、稳定性好，可在4个小时内，实现黑色枝小蠹的准确检测，可实现包括成虫在内的3种黑色枝小蠹易截获虫态(幼虫、蛹和成虫)的鉴定。采用本发明提供的方法对操作人员的专业技术能力要求较低，无需掌握小蠹类昆虫形态的专业知识，可广泛应用于基层园林绿化部门及经济作物相关部门对黑色枝小蠹的快速鉴定。

Description

一种黑色枝小蠹的特异性引物

技术领域

本发明涉及分子检测技术领域，具体涉及一种黑色枝小蠹的特异性引物。

背景技术

随着全球经济一体化的加快，林业外来生物入侵的形势日趋严峻。一些重大林业入侵物种已对我国的森林资源、物种多样性与生态安全造成了重大损失。

黑色枝小蠹Xylosandrus compactus是一种重要的蛀干性害虫，该虫寄主范围广泛，且存在寄主范围扩大的现象。在多个入侵地造成了咖啡、可可等经济作物的减产甚至绝收，经济损失巨大；此外，该虫造成了广玉兰、悬铃木等多种寄主植物严重枯枝甚至死亡，严重影响了园林绿化景观效果。

小蠹类昆虫是一类小型的钻蛀性昆虫，其中，黑色枝小蠹雌成虫体长约1.6-1.8mm；雄成虫体长约0.8-1.1mm。且其存在很多近缘种，传统形态鉴定时常被混淆，致使多地错过早期最佳防治阶段。为了将黑色枝小蠹与近缘种小蠹类昆虫区分开来，需要大量形态学鉴别工作，这些工作大多费时、费力且需要专业的昆虫分类学知识。并且，处于幼虫与蛹虫态的小蠹类昆虫在形态上非常相似，目前还没有可靠的鉴定特征。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测黑色枝小蠹的方法。

应用传统形态学分类学对黑色枝小蠹进行检测存在明显的问题，比如需要专业的小蠹类昆虫分类知识，且由于小蠹类昆虫普遍较小，在以形态学方法进行检测时需要借助体式镜；且所截获的昆虫虫态可能不具备形态学特征，例如所截获的昆虫虫态为幼虫或蛹；即使截获的昆虫样本是成虫，也可能存在虫体不完整，昆虫残体形态学特征缺失等问题。

近些年，越来越多的研究已证明分子生物学手段能够为检测害虫提供有力依据。线粒体DNA遵从母性遗传，其中的细胞色素氧化酶I基因(COI)具有高度保守，结构稳定，无内含子的特点。因此，常作为昆虫DNA条形码用于物种分类、鉴定和亲缘关系的研究。

现有技术中合成小蠹类昆虫COⅠ基因序列扩增通用引物，采用所述通用引物进行PCR扩增，将PCR产物测序后与数据库中已知的小蠹类昆虫的序列信息进行比对，实现对小蠹类昆虫种类的判断。

为了实现对黑色枝小蠹不受虫态限制，快速、准确的检测，本发明提供一种黑色枝小蠹特异性SS-COⅠ引物，所述特异性SS-COI引物在DNA模板为黑色枝小蠹基因组DNA时，可以扩增出条带；在面对其他小蠹类昆虫的DNA模板均不能扩增出条带。采用本发明提供的特异性SS-COⅠ引物可以省略对PCR扩增产物进行测序比对，直接通过电泳条带的有无，来实现对黑色枝小蠹的判定。使用常规分子生物学检测方法，整个检测过程需2-3天，而本发明仅在4个小时内即可完成对黑色枝小蠹的检测。

本发明提供的具体技术方案，如下：

第一方面，本发明提供一种引物对，其核苷酸序列如SEQ ID No.1-2所示。

本发明还请求保护上述引物对在制备检测黑色枝小蠹的试剂或试剂盒中的应用。

第二方面，本发明提供含有上述引物对的试剂或试剂盒。本发明提供的试剂盒中还含有常规PCR扩增试剂。

根据本领域技术人员的理解，本发明请求保护，上述引物对或上述试剂或试剂盒在黑色枝小蠹检测中的应用。

以及上述引物对或上述试剂或试剂盒在快速检测木材是否存在黑色枝小蠹中的应用。

以及上述引物对或上述试剂或试剂盒在黑色枝小蠹防治中的应用。

第三方面，本发明提供一种检测黑色枝小蠹的方法，使用SEQ ID No.1-2所示的引物对，以待检测样品DNA为模板，进行PCR扩增；

PCR扩增出现条带，判定待检测样品中含有黑色枝小蠹；

PCR扩增不出现条带，判定待检测样品中不含有黑色枝小蠹。

在本发明提供的方法中，PCR扩增的程序是：94℃预变性4min，94℃变性30s，53℃复性45s，72℃延伸45s，27个循环；最后72℃延伸20min。

在本发明提供的方法中，PCR反应体系为2×GO Taq GreenMaster Mix、如SEQ IDNo.1所示引物、如SEQ ID No.2所示引物、DNA模板和ddH₂O。具体地，所述PCR反应体系为2×GO Taq GreenMaster Mix 12.5μl、如SEQ ID No.1所示引物1μl、如SEQ ID No.2所示引物1μl、DNA模板1.5μl和ddH₂O 9μl。

本发明所提供的方法快速稳定，对操作人员的专业技术能力要求较低，无需掌握小蠹类昆虫形态的专业知识，可广泛应用于基层园林绿化部门及经济作物相关部门对黑色枝小蠹的快速鉴定。

本发明的有益效果至少在于：

本发明所提供的方法特异性强，以国内与黑色枝小蠹同域发生和同属近缘的其他6种小蠹类昆虫的DNA为模板，以黑色枝小蠹DNA为阳性对照，特异性SS-COⅠ引物AF/AR进行PCR，仅有黑色枝小蠹成功扩增出产物。

本发明提供的方法灵敏度高，利用不同浓度梯度的黑色枝小蠹DNA标准品进行特异性引物灵敏度检验。PCR检验的最小检测限度为90pg。

本发明提供的方法稳定性好，以采集自我国8个省17个不同地理区域的黑色枝小蠹成虫DNA为模板，以本发明提供的引物AF/AR进行扩增，结果显示不同地区种群的黑色枝小蠹都能扩增出清晰的靶标片段。

本发明提供的方法，省略对PCR扩增产物进行测序与比对，直接通过电泳条带的有无，来实现对黑色枝小蠹的判定，将黑色枝小蠹的鉴定时间由2-3天缩短至4小时，特别是可实现包括成虫在内的3种黑色枝小蠹易截获虫态(幼虫、蛹和成虫)的鉴定。

采用本发明提供的方法进行黑色枝小蠹的检测，对操作人员的专业技术能力要求较低，无需掌握小蠹类昆虫形态的专业知识，可广泛应用于基层园林绿化部门及经济作物相关部门对黑色枝小蠹的快速鉴定。

本发明提供的方法，可用于调运苗木、原木制品、木质包装材料中黑色枝小蠹的快速检测。

附图说明

图1a是本发明实施例2中的COI通用引物扩增七种小蠹的扩增产物电泳图；其中，M：DL2000 DNA marker(从上至下2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp)；泳道：1-黑色枝小蠹Xylosandrus compactus，2-暗翅足距小蠹Xylosandrus crassiusculus，3-枫香刺小蠹Acanthotomicus suncei，4-坡面方胸小蠹Euwallacea interjectus，5-两色足距小蠹Xylosandrus discolor，6-小粒绒盾材小蠹Xyleborinus saxesenii，7-小圆胸小蠹Euwallacea fornicatus，8-阴性对照(超纯水)。

图1b是本发明实施例2中的黑色枝小蠹特异性SS-COI引物扩增七种小蠹的扩增产物电泳图；其中，M：DL2000 DNA marker(从上至下2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp)；泳道：1-黑色枝小蠹Xylosandrus compactus，2-暗翅足距小蠹Xylosandruscrassiusculus，3-枫香刺小蠹Acanthotomicus suncei，4-坡面方胸小蠹Euwallaceainterjectus，5-两色足距小蠹Xylosandrus discolor，6-小粒绒盾材小蠹Xyleborinussaxesenii，7-小圆胸小蠹Euwallacea fornicatus，8-阴性对照(超纯水)。

图2是本发明实施例3中检测黑色枝小蠹种特异性引物的灵敏度的电泳图；其中，M：DL2000 DNA marker(从上至下2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp)；泳道1-6分别代表：9ng,0.9ng,90pg,9pg,0.9pg和90fg的黑色枝小蠹基因组DNA，泳道7-阴性对照(超纯水)。

图3是本发明实施例4中特异性引物对不同虫态黑色枝小蠹样本的扩增；其中，M：DL2000 DNA marker(从上至下2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp)；泳道1-3分别代表：1-幼虫，2-蛹，3-成虫，泳道4-阴性对照(超纯水)。

图4是本发明实施例4中特异性引物对不同地区黑色枝小蠹样本的扩增；其中，M：DL2000 DNA marker(从上至下2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp)；泳道1-17分别代表十六个不同地区的黑色枝小蠹样本：1-上海浦东,2-上海辰山植物园,3-上海世纪公园,4-上海植物园,5-上海滨江森林公园,6-江苏苏州,7-江苏昆山，8-浙江台州，9-山东日照，10-广东广州，11-广东珠海，12-广东茂名，13-广东深圳，14-广东东莞，15-福建福州，16-海南儋州，17-云南巴卡小寨，泳道18-阴性对照(超纯水)。

图5是本发明对比例1中的引物扩增七种小蠹的扩增产物电泳图；其中，M：DL2000DNA marker(从上至下2000bp，1000bp，750bp，500bp,250bp,100bp)；泳道：1-黑色枝小蠹Xylosandrus compactus，2-暗翅足距小蠹Xylosandrus crassiusculus，3-枫香刺小蠹Acanthotomicus suncei，4-坡面方胸小蠹Euwallacea interjectus，5-两色足距小蠹Xylosandrus discolor，6-小粒绒盾材小蠹Xyleborinus saxesenii，7-小圆胸小蠹Euwallacea fornicatus，8-阴性对照(超纯水)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明实施例中所用到的小蠹均为小蠹类昆虫的常规种，本领域技术人员可通过自行采集或购买得到。

实施例1

本发明以黑色枝小蠹为靶标，选取与黑色枝小蠹在国内同域发生和同属近缘的其他6种小蠹(暗翅足距小蠹Xylosandrus crassiusculus，两色足距小蠹Xylosandrusdiscolor，小粒绒盾材小蠹Xyleborinus saxesenii，坡面方胸小蠹Euwallaceainterjectus，小圆胸小蠹Euwallacea fornicatus，枫香刺小蠹Acanthotomicus suncei)作为参照，设计基于线粒体COI基因序列的种特异性引物，并构建和优化了黑色枝小蠹快速分子检测体系。

1、昆虫基因组DNA的提取

基因组DNA提取采用QIAGEN公司的

Blood&Tissue Kit(cat.nos.69504)试剂盒。

基因组DNA提取的具体操作步骤：

(1)在纯酒精中浸泡的标本用超声波仪器清洗干净晾干后，将整头昆虫样本放置于1.5ml的离心管中，并轻微研磨。向离心管中加入180ul的Buffer ATL与20μl的蛋白酶K(25mg/ml)，涡旋混匀后置于56℃恒温水浴锅3h直到组织完全被消化。

(2)在离心管中加入200μl的Buffer AL，涡旋震荡，混匀。将混合液置于56℃恒温水浴锅10min。

(3)加入200μl的无水乙醇(室温)，缓慢混匀。

(4)将前一步的溶液转移至吸附柱内(吸附柱安放于收集管内)，6,000xg室温下离心1min，移除废液，并丢弃收集管。

(5)将吸附柱置于新的2ml收集管中。加入500μl的Buffer AW1，6,000xg室温下离心1min，移除废液，并丢弃收集管。

(6)将吸附柱重新置于新的2ml收集管内，加入500μl的Buffer AW2，20,000xg室温下离心3min，移除废液与收集管。

(7)将吸附柱放置于新的1.5ml离心管内，将吸附柱的盖子打开，置于室温下5min，使酒精充分挥发。

(8)向吸附柱中间部位悬空加入200μl的Buffer AE，室温放置1min，并在6,000xg下离心1min。

(9)重复第8步，以便提高DNA产量。

2、小蠹类COⅠ基因序列的通用引物扩增

根据已有文献报道，合成小蠹类昆虫COⅠ基因序列扩增通用引物：

LCO 1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，(SEQ ID No.3)；

HCO 2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’(SEQ ID No.4)。

PCR扩增反应使用

GreenMaster Mix试剂盒(Promega)，总体系为25μl，各成分如表1所示：

表1 PCR反应体系

混匀后放入PCR仪中进行扩增，扩增的程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，47℃复性45s，72℃延伸45s，27个循环；最后72℃延伸20min。每次反应用无菌蒸馏水做一个空白对照，用以排除系统误差。取1.5μl产物上样到1％TAE琼脂糖凝胶上。经130V电泳30min后，将胶块浸泡于Super

10,000×稀释至3×的染料中泡染30min，在紫外分光光度计下检测拍照。

3、近缘种多重序列对比及种特异性引物设计

将PCR产物送擎科生物(上海)公司进行双向测序，得到COⅠ序列。使用DNAstar对序列进行拼接，去除冗余序列，将序列结果在GeneBank中进行Blast序列比对。

根据本实施例得到的7种小蠹的测序结果以及数据库中已公开的19种常见小蠹的碱基序列进行对比分析，运用软件Primer Primer 5.0软件设计黑色枝小蠹特异性SS-COⅠ引物1对(AF/AR)：

AF：5’-TCTAATCCGAACAGAACTTG-3’(SEQ ID No.1)；

AR：5’-GGTAAGGATAGGAGTAGAAG-3’(SEQ ID No.2)。

4、黑色枝小蠹SS-COⅠ种特异性引物扩增体系的建立优化

PCR扩增反应使用

GreenMaster Mix试剂盒(Promega)，其反应体系与COⅠ基因序列扩增体系相同(见表1)。扩增的程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，53℃复性45s，72℃延伸45s，27个循环；最后72℃延伸20min。每次反应用无菌蒸馏水做一个空白对照，用以排除系统误差。取1.5μl产物上样到1％TAE琼脂糖凝胶上。经130V电泳30min后，将胶块浸泡于Super

实施例2黑色枝小蠹SS-COⅠ引物的种特异性检验

本实施例以国内与黑色枝小蠹同域发生和同属近缘的其他6种小蠹类昆虫的DNA为模板，以黑色枝小蠹DNA为阳性对照(检测DNA均为9ng/μl浓度的母液)。检验黑色枝小蠹SS-COⅠ引物AF/AR的种特异性。

利用COⅠ通用引物扩增，7种小蠹均扩增出约700bp的产物，而利用本发明设计的特异性SS-COⅠ引物AF/AR进行PCR，仅有黑色枝小蠹成功扩增，产物为495bp，对其它6种小蠹和阴性对照均不具有扩增能力(见图1a、图1b)，表明该对引物为黑色枝小蠹的种特异性引物。

实施例3黑色枝小蠹SS-COⅠ引物的灵敏度检验

本实施例以不同浓度的黑色枝小蠹DNA标准品为模板进行扩增，检验该引物的灵敏度。

标准品的制备：将黑色枝小蠹浓度为9ng/μl的DNA母液样本按照(1:10)的比例依次稀释成0.9ng/μl、90pg/μl、9pg/μl、0.9pg/μl、90fg/μl的标准液。

利用不同浓度梯度的黑色枝小蠹DNA标准品进行特异性引物灵敏度检验(见图2)。PCR检验的最小检测限度为90pg的基因组DNA。

实施例4不同虫态，不同地区黑色枝小蠹样本的检测

本实施例中，以不同虫态(幼虫、蛹、成虫)黑色枝小蠹DNA为模版，以种特异性引物AF/AR进行扩增，不同虫态的黑色枝小蠹均能稳定地扩增出495bp的特异性片段(见图3)。

以采集自我国8个省17个不同地理区域的黑色枝小蠹成虫DNA为模板，以种特异性引物AF/AR进行扩增，结果显示不同地区种群的黑色枝小蠹都能扩增出靶标片段(见图4)。

综合上述对特异性引物的特异性、灵敏度、稳定性的研究，黑色枝小蠹种特异性引物(AF/AR)只对黑色枝小蠹具有扩增效果，对其同域发生和同属近缘的小蠹类昆虫不具有扩增能力；特异性引物灵敏度高，能够检测最低为90pg的基因组DNA；并且对采自我国8个省17个不同区域的黑色枝小蠹、不同虫态的黑色枝小蠹样本都具有同样稳定的检测效果；对靶标序列的Blast结果显示，该片段与已报道黑色枝小蠹一致性为100％。

采用本发明提供的方法可在4个小时内实现对黑色枝小蠹的准确检测。本发明提供的方法对操作人员的专业技术能力要求较低，无需掌握小蠹类昆虫形态的专业知识，可广泛应用于基层园林绿化部门及经济作物相关部门对黑色枝小蠹的快速鉴定。

对比例1针对线粒体COI基因设计得到的其他引物

本对比例根据实施例1得到的7种小蠹的测序结果以及数据库中已公开的19种常见小蠹的碱基序列进行对比分析，运用软件Primer Primer 5.0软件设计引物1对；

(SEQ ID No.5)：PF：5’-GCTTTCATTATAATTTTCTT-3’；

(SEQ ID No.6)：PR：5’-GCTAAGACAGGTAAGGATAG-3’。

在本对比例中，使用SEQ ID No.5-6所示引物对，以国内与黑色枝小蠹同域发生和同属近缘的其他6种小蠹类昆虫的DNA为模板，检验SEQ ID No.5-6所示引物对对黑色枝小蠹的种特异性。

采用SEQ ID No.5-6所示引物对进行PCR扩增时，在7种小蠹中，除了黑色枝小蠹外，小粒绒盾材小蠹、小圆胸小蠹也能扩增出约400bp的条带。(见图5)

本对比例的结果证明，虽然设计SEQ ID No.5-6所示引物对与SEQ ID No.1-2所示引物对所依据的靶点相同，均为COI基因序列上的序列多变区。但SEQ ID No.5-6所示引物对不能作为黑色枝小蠹的种特异性引物。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 上海市园林科学规划研究院

<120> 一种黑色枝小蠹的特异性引物

<130> KHP211119079.1

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tctaatccga acagaacttg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtaaggata ggagtagaag 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtcaacaaa tcataaagat attgg 25

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taaacttcag ggtgaccaaa aaatca 26

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctttcatta taattttctt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctaagacag gtaaggatag 20

Claims

1.一种引物对，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1-2所示。

2.权利要求1所述引物对在制备检测黑色枝小蠹的试剂或试剂盒中的应用。

3.含有权利要求1所述引物对的试剂或试剂盒。

4.根据权利要求3所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有常规PCR扩增试剂。

5.权利要求1所述引物对或权利要求3-4任一项所述试剂或试剂盒在黑色枝小蠹检测中的应用。

6.权利要求1所述引物对或权利要求3-4任一项所述试剂或试剂盒在快速检测木材是否存在黑色枝小蠹中的应用。

7.权利要求1所述引物对或权利要求3-4任一项所述试剂或试剂盒在黑色枝小蠹防治中的应用。

8.一种检测黑色枝小蠹的方法，其特征在于，以待检测样品DNA为模板，使用SEQ IDNo.1-2所示的引物对进行PCR扩增；

PCR扩增出现条带，判定待检测样品中含有黑色枝小蠹。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，PCR扩增的程序是：94℃预变性4min，94℃变性30s，53℃复性45s，72℃延伸45s，27个循环；最后72℃延伸20min。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，PCR反应体系为2×GO Taq GreenMasterMix、如SEQ ID No.1所示引物、如SEQ ID No.2所示引物、DNA模板和ddH₂O。