CN110144413B - 日本血吸虫w染色体特异基因的筛选及其在尾蚴性别鉴定中的应用 - Google Patents

日本血吸虫w染色体特异基因的筛选及其在尾蚴性别鉴定中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种日本血吸虫W染色体特异基因的筛选及其在尾蚴性别鉴定中的应用，具体为采用包含日本血吸虫W染色体特异基因的特异引物和日本血吸虫内参基因PSMD4引物的双重PCR方法，属于生物技术领域。本发明以日本血吸虫W染色体特异基因引物和PSMD4看家基因引物，采用双重PCR方法快速鉴定日本血吸虫尾蚴性别，全过程仅需2小时，较传统的动物实验鉴定方法大幅缩短了鉴定时间，提高了日本血吸虫病动物模型的标准化和均一化；同时，本发明无需提取尾蚴DNA，较传统的PCR方法操作简便快捷，重复性高，可实现高通量鉴定；本发明既可以鉴定阳性钉螺释放的单一雌性或雄性尾蚴，又可以鉴定阳性钉螺释放的雌雄混合性别尾蚴。

Description

日本血吸虫W染色体特异基因的筛选及其在尾蚴性别鉴定中 的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及日本血吸虫W染色体特异基因的筛选及其在尾蚴性别鉴定中的应用。
背景技术
血吸虫是一种独特的雌雄异体吸虫，染色体包括7对常染色体和1对性染色体，其中雄性性染色体为ZZ型，雌性性染色体为ZW型。日本血吸虫、曼氏血吸虫和埃及血吸虫是最主要的三种人血吸虫病的病原体。血吸虫单性雌虫在宿主体内无法发育成熟，其性成熟依赖于与雄虫的合抱，而成熟雌虫所产生的大量虫卵是造成宿主病理损害和疾病再传播的关键。研发血吸虫尾蚴性别快速鉴定技术有助于单一性别血吸虫感染动物模型建立，对血吸虫遗传进化、发育及生殖机制研究具有重要意义。
血吸虫生活史包括虫卵、毛蚴、母包蚴、子包蚴、尾蚴、童虫及成虫等多个发育阶段，其中仅成虫阶段具有明显的性别二态性，其他发育阶段难以通过虫体形态结构差异进行性别鉴定。传统的动物实验鉴定尾蚴性别方法是将单只阳性钉螺释放的尾蚴通过人工感染实验小鼠，待虫体在小鼠体内发育至成虫(至少需要培养约1个月时间)后进行解剖取虫，通过成虫形态结构差异鉴定感染尾蚴的性别。该方法费时费力，无法满足快速鉴定尾蚴性别的需求。
随着分子生物学技术的发展，国外学者从曼氏血吸虫基因组中筛选获得D9、W1、W2和W6等多条W染色体特异的核酸序列，并以此为基础设计了特异的DNA探针和引物，通过Southern杂交或PCR建立了曼氏血吸虫尾蚴性别鉴定方法。但遗憾的是，已报道的曼氏血吸虫尾蚴性别鉴定方法对不同地理株来源的曼氏血吸虫尾蚴性别鉴定结果并不稳定，且曼氏血吸虫性别特异探针和引物也无法用于日本血吸虫和埃及血吸虫尾蚴性别鉴定。
虽然传统的PCR鉴定尾蚴性别方法比动物实验鉴定尾蚴性别方法所需时间大大缩短，但仍存在许多问题需要进一步解决。首先，传统PCR鉴定尾蚴性别方法需要提取多条尾蚴DNA作为模板进行特异核酸序列扩增，操作繁琐且有引入模板污染的可能性。同时，由于PCR体系中只有一对雌虫特异性扩增区域设计引物，对于扩增出目的条带的样本，无法确认该样本即为单雌性尾蚴，还必须排出雌性尾蚴和雄性尾蚴混合感染的情况；对于没有扩增出目的条带的样本，亦无法确定样本即为雄性尾蚴，还必须排除样本DNA提取失败的可能性。
随着高通量测序技术的发展，日本血吸虫、曼氏血吸虫和埃及血吸虫的转录组和基因组相继获得破译，为科研人员研究血吸虫及血吸虫病提供了丰富的信息资源。然而，日本血吸虫基因组目前尚未组装到染色体水平，无法仅凭基因组序列筛选出W染色体特异的核酸序列或基因。目前，有关日本血吸虫尾蚴性别鉴定的分子生物学方法鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种日本血吸虫W染色体特异基因的筛选方法。
本发明的另一目的是提供一种日本血吸虫W染色体特异基因在尾蚴性别鉴定中的应用方法。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
首先我们利用Microarray技术初筛出日本血吸虫雌虫特异表达基因并结合生物信息学分析进一步筛选出候选基因进行PCR验证；根据候选基因序列设计特异引物，以雌性成虫和雄性成虫的cDNA和基因组DNA为模板，通过PCR方法最终筛选出日本血吸虫W染色体特异基因。
然后以日本血吸虫W染色体特异基因引物和PSMD4看家基因引物建立双重PCR技术体系，对我国安徽省、湖南省、江苏省和江西省的日本血吸虫虫株进行了雌雄性别鉴定验证。
进一步，通过蛋白酶K消化尾蚴直接制备PCR模板，以日本血吸虫W染色体特异基因引物和PSMD4看家基因引物，建立了免DNA提取的快速鉴定尾蚴性别的双重PCR方法。
具体地，日本血吸虫W染色体特异基因，包括具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
日本血吸虫W染色体特异基因的筛选方法，包括以下步骤：
S1、利用Microarray技术初筛出日本血吸虫雌虫特异表达基因；
S2、通过生物信息学分析进一步筛选出较好比对到日本血吸虫基因组上的雌虫特异表达基因作为候选基因；
S3、根据候选基因序列设计特异引物；
S4、以日本血吸虫雌性成虫和雄性成虫的cDNA和基因组DNA为模板，通过PCR方法筛选出雌虫基因组DNA模板特异扩增的雌虫特异表达基因PCR产物，即为日本血吸虫W染色体特异基因。
本发明还提供了日本血吸虫W染色体特异基因在尾蚴性别鉴定中的应用方法。具体为本发明的日本血吸虫W染色体特异基因作为生物标志物，在日本血吸虫尾蚴性别鉴定方面的用途，采用包含日本血吸虫W染色体特异基因的特异引物和日本血吸虫内参基因PSMD4引物的双重PCR方法。更具体地为一种以日本血吸虫W染色体特异基因引物和PSMD4看家基因引物，通过蛋白酶K消化尾蚴直接制备PCR模板，免DNA提取的快速鉴定日本血吸虫尾蚴性别的双重PCR方法。
其中，一组鉴定日本血吸虫尾蚴性别的特异引物，包含SjF4、SjF6或SjF9引物，以及其中任一特异引物与PSMD4引物的组合。
日本血吸虫雌虫特异基因SjF4引物，上、下游引物分别如SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示，包括：
上游引物SjF4-f：5’-AGATGGCTCAACTGGTCTATCA-3’
下游引物SjF4-r：5’-ACCAGACATTTGCAGCAGACAC-3’
日本血吸虫雌虫特异基因SjF6引物，上、下游引物分别如SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.7所示，包括：
上游引物SjF6-f：5’-GAATTCGTTGCAAGCGCTCAA-3’
下游引物SjF6-r：5’-TGGGACTCTTTTCACTTGGCA-3’
日本血吸虫雌虫特异基因SjF9引物，上、下游引物分别如SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.9所示，包括：
上游引物SjF9-f：5’-GCGTCCAAATTTCGTGAGAT-3’
下游引物SjF9-r：5’-TTTGAAACGGCAACTTTCGG-3’
日本血吸虫内参基因PSMD4引物，上、下游引物分别如SEQ ID NO.10和SEQ IDNO.11所示，包括：
上游引物PSMD4-f：5’-CCTCACCAACAATTTCCACATCT-3’
下游引物PSMD4-r：5’-GATCACTTATAGCCTTGCGAACAT-3’
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明采用包含日本血吸虫W染色体特异基因的特异引物和日本血吸虫内参基因PSMD4引物的双重PCR方法，来鉴定尾蚴性别全过程仅需2小时，较传统的动物实验鉴定尾蚴性别方法(约1个月时间)大幅缩短了尾蚴性别鉴定时间，提高了日本血吸虫病动物模型的标准化和均一化。
2、本发明通过蛋白酶K消化尾蚴直接制备PCR模板，双重PCR法鉴定尾蚴性别无需提取DNA，避免因样本DNA提取失败导致传统的PCR方法没有扩增出目的条带情况发生，提高检测的准确性，同时，本发明无需提取尾蚴DNA，较传统的PCR方法操作简便快捷，可重复性高，可实现高通量鉴定。
3、本发明的双重PCR法，既可以鉴定阳性钉螺释放的单一雌性或雄性尾蚴，又可以鉴定阳性钉螺释放的雌雄混合性别尾蚴，适用范围更广。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1日本血吸虫W染色体特异基因的PCR筛选结果示意图，其中M为50bp DNA Ladder分子量标准；PSMD4为内参基因的PCR产物；1-12分别为12个日本血吸虫雌虫特异表达基因的PCR产物；A为以血吸虫成虫cDNA为模板的PCR产物，♀为雌性成虫cDNA模板PCR产物，♂为雄性成虫cDNA模板PCR产物；B为以血吸虫成虫DNA为模板的PCR产物，♀为雌性成虫DNA模板PCR产物，♂为雄性成虫DNA模板PCR产物；
图2为本发明实施例2中日本血吸虫W染色体特异基因在不同地理虫株基因组DNA的双重PCR验证结果示意图；A、B和C分别为三个日本血吸虫W染色体特异基因引物的双重PCR产物；M为50bp DNA Ladder分子量标准；1-3为雌性成虫基因组DNA的双重PCR产物，4-6为雄性成虫基因组DNA的双重PCR产物；
图3为本发明实施例4中双重PCR法快速鉴定日本血吸虫尾蚴性别的结果示意图。A、B和C分别为以日本血吸虫雌性尾蚴、雄性尾蚴和雌雄混合性别尾蚴为模板，W染色体特异基因SjF9和内参基因PSMD4引物的双重PCR产物；M为50bp DNA Ladder分子量标准；1-6为单只阳性钉螺释放的6条尾蚴的双重PCR产物。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步的详细介绍。
实施例1日本血吸虫W染色体特异基因筛选
(1)根据雌雄成虫基因表达荧光信号比值初筛出雌虫特异表达基因100个，进一步通过生物信息学分析筛选出基因序列较好比对到日本血吸虫基因组上的候选基因12个。
(2)PCR引物设计：根据基因序列，利用PrimerPremier 5.0软件设计基因特异引物，12个日本血吸虫雌虫特异表达候选基因的引物信息如表1所示。
表1 12个日本血吸虫雌虫特异表达基因引物信息
Figure BDA0002098606690000061
(3)PCR筛选日本血吸虫W染色体特异基因：分别以日本血吸虫雌雄成虫cDNA和基因组DNA为模板，以看家基因PSMD4作为内参基因，其上游引物为5’-CCTCACCAACAATTTCCACATCT-3’(SEQ ID NO.10)，下游引物为5’-GATCACTTATAGCCTTGCGAACAT-3’(SEQ ID NO.11)对12个日本血吸虫雌虫特异表达候选基因进行PCR验证及W染色体特异基因筛选。PCR反应体系如下：
Figure BDA0002098606690000062
PCR扩增程序：98℃1min；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸5s，共35个循环；最后72℃延伸10s。
(4)用2.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，观察是否存在目的条带，结果如图1所示。结果显示12对日本血吸虫雌虫特异表达基因引物均在雌虫cDNA模板中扩增出特异目的条带，在雄性cDNA模板中均未扩增出目的条带；12对日本血吸虫雌虫特异表达基因引物中有3对引物(4、6和9)只在雌虫DNA模板中扩增出目的条带，为W染色体特异基因。图1A为以雌雄成虫cDNA为模板的PCR产物电泳结果，M为50bp DNA ladder分子量，PSMD4为内参基因PCR产物，1-12分别为12个日本血吸虫雌虫特异表达基因PCR产物，♀为雌性成虫cDNA模板PCR产物，♂为雄性成虫cDNA模板PCR产物。图1B为以雌雄成虫基因组DNA为模板的PCR产物电泳结果，M为50bp DNA Ladder分子量标准，PSMD4为内参基因PCR产物，1-12分别为12个日本血吸虫雌虫特异表达基因的PCR产物，♀为雌性成虫DNA模板PCR产物，♂为雄性成虫DNA模板PCR产物。
实施例2日本血吸虫W染色体特异基因在不同地理虫株中的验证
(1)基因组DNA提取：收集我国安徽省、湖南省、江西省和江苏省日本血吸虫雌雄成虫，利用基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN公司)分别提取雌雄成虫基因组DNA(雌虫和雄虫各进行三次生物学重复)制备PCR模板。
(2)以不同省份的日本血吸虫雌雄成虫基因组DNA为模板，以PSMD4为内参基因，分别利用日本血吸虫W染色体特异基因SjF4、SjF6和SjF9的引物进行双重PCR检测。PCR反应体系如下：
Figure BDA0002098606690000081
PCR扩增程序同实施例1。
(3)用2.5％琼脂糖凝胶电泳检测双重PCR产物，观察是否存在目的条带。凝胶电泳结果如图2所示，M为50bp DNA Ladder分子量标准，自左向右依次为安徽省、湖南省、江苏省和江西省日本血吸虫成虫DNA模板PCR产物凝胶电泳结果，1-3为雌性成虫DNA模板PCR产物，4-6为雄性成虫DNA模板PCR产物。图2A结果显示，所有雌虫DNA模板在129bp处扩增出一条清晰明亮的条带为PSMD4内参基因的PCR产物，和190bp处有一条清晰明亮的条带为W染色体特异基因SjF4的PCR产物，所有雄虫DNA模板仅在129bp处扩增出一条清晰明亮的条带为内参基因PCR产物；图2B结果显示，所有雌虫DNA模板在129bp处扩增出一条清晰明亮的条带为PSMD4内参基因的PCR产物，和226bp处有一条清晰明亮的条带为W染色体特异基因SjF9的PCR产物，所有雄虫DNA模板仅在129bp处扩增出一条清晰明亮的条带为PSMD4内参基因是的PCR产物；图2C结果显示所有雌虫DNA模板在129bp处扩增出一条清晰明亮的条带为PSMD4内参基因的PCR产物和260bp处有一条清晰明亮的条带为W染色体特异基因SjF6的PCR产物，所有雄虫DNA模板仅在129bp处扩增出一条清晰明亮的条带为PSMD4内参基因的PCR产物。
实施例3单一性别和混合性别日本血吸虫感染阳性钉螺制备
(1)阴性钉螺筛选：在非日本血吸虫病流行地区收集钉螺，并通过光照逸蚴法进一步验证为非日本血吸虫感染的阴性钉螺。
(2)人工感染阳性钉螺制备：通过单只毛蚴感染单只钉螺或多只毛蚴混合感染一只钉螺，感染后钉螺在光照培养箱中培养3个月。
(3)动物感染实验鉴定尾蚴性别：每支试管放入一只人工感染钉螺并编号，通过光照逸蚴法释放单只阳性钉螺中的尾蚴，每只钉螺挑取约60条尾蚴通过腹部贴片法一对一感染小鼠，感染小鼠饲养5周后进行解剖取成虫鉴定尾蚴性别。20只阳性钉螺释放尾蚴性别的鉴定结果如表2所示，共获得单一雌性血吸虫感染阳性钉螺8只，单一雄性血吸虫感染阳性钉螺7只，雌雄混合性别血吸虫感染钉螺5只。
表2人工感染阳性钉螺释放尾蚴性别鉴定结果
Figure BDA0002098606690000091
其中，F表示雌性，M表示雄性，FM表示雌雄混合性别。
实施例4免DNA提取快速鉴定尾蚴性别的双重PCR法
(1)尾蚴制备：每支试管放入一只阳性钉螺(单一雌性、单一雄性和雌雄混合感染钉螺各取3只，实施例3已鉴定尾蚴性别)，通过光照逸蚴法释放尾蚴，用无菌吸头蘸取尾蚴移至装有去离子水的24孔板中，60℃孵育5min杀灭尾蚴。
(2)尾蚴蛋白酶K消化：在倒置显微镜下，用无菌吸头挑取单条尾蚴至装有5μl蛋白酶K工作液(QIAGEN公司)的PCR管中(每只阳性钉螺各挑取6条释放的尾蚴)，将PCR管置于PCR仪中60℃孵育5min消化尾蚴，98℃孵育10min热灭活蛋白酶K。
(3)双重PCR：将PCR管短暂离心，加入预混的PCR反应液，PCR反应体系如下：
Figure BDA0002098606690000101
PCR扩增程序同实施例1。
(4)用2.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，观察是否存在目的条带，结果如图3所示，M为50bp DNA Ladder分子量标准。图3A为3只单一雌性血吸虫感染钉螺释放尾蚴的PCR产物凝胶电泳结果，结果显示在129bp有一条清晰明亮的条带为内参基因PCR产物，226bp有一条清晰明亮的条带为W染色体特异基因SjF9的PCR产物，确定3只阳性钉螺感染的均为单一雌性血吸虫；图3B为3只单一雄性血吸虫感染钉螺释放尾蚴的PCR产物凝胶电泳结果，结果显示仅在129bp有一条清晰明亮的条带为内参基因PCR产物，确定3只阳性钉螺感染的均为单一雄性血吸虫；图3C为3只混合性别血吸虫感染钉螺释放尾蚴的PCR产物凝胶电泳结果，结果显示3只钉螺释放的6条尾蚴的雌性和雄性比分别为3:3、4:2和3:3，结果表明3只阳性钉螺释放的尾蚴为雌雄混合性别。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，但这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国医学科学院病原生物学研究所
<120> 日本血吸虫W染色体特异基因的筛选及其在尾蚴性别鉴定中的应用
<160> 29
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1563
<212> DNA
<213> 日本血吸虫(Schistosoma japonicum Katsurada)
<400> 1
atggccgatt actacaggcg ggacttcaga gcatcagtgg aacgtaataa catggacaca 60
agtcacaagt ccagtgttga aactagtacg gctactagta aagagtatga tcaatccaac 120
tgcaatgacg ttaatagtaa aggtgactat cacccagctt ctgcatcctg taatcggaga 180
ttatcatcgc ctcaaacaaa atatgattcc agcagtgatg gtcgaagtcg aagtaagaaa 240
cgtgagagaa aaagatctca cagtcacggc caccgacgac atagtaaaag tcgccatcgt 300
gattatagtg ggggacataa atctagacgg catcaatctc accatcggtc cccttccaac 360
tctgtgtcgg ctcacaaata ttgggatgtt ccgccacctg ggtttgaaca cgtcacacca 420
gctcagtaca aagctctaca aacgtctggc caggtaccag ttaatgtata tgctgctggt 480
caagtgccta tgccagttca tgcaccaaat gctcccttaa cactcaccac caatgtacca 540
tttgctggga gcgcagtgtg ccgacaggct cgtcgtctat acgtcggaaa catcccattc 600
accgcaactg aagaaaatat gatggagttc tttaataagc aaatgcgagc gcaaggtctt 660
attcaagctg aaggtaatcc gataattgcc gttcagatta atatggagaa aaatttcgcc 720
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Claims (2)

1. 日本血吸虫W染色体特异基因SjF9在鉴定日本血吸虫尾蚴性别中的应用，其特征在于，所述的日本血吸虫W染色体特异基因SjF9的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.如权利要求1所述的日本血吸虫W染色体特异基因SjF9在鉴定日本血吸虫尾蚴性别中的应用，其特征在于，通过蛋白酶K消化尾蚴直接制备PCR模板，采用日本血吸虫W染色体特异基因SjF9特异引物和日本血吸虫内参基因PSMD4引物通过双重PCR方法鉴定尾蚴性别；日本血吸虫W染色体特异基因SjF9特异引物的上、下游引物序列分别如SEQ ID NO .8和SEQID NO .9所示，日本血吸虫内参基因PSMD4引物的上、下游引物序列分别如SEQ ID NO .10和SEQ ID NO .11所示。
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