CN111534635A - 一体化分子诊断系统及其在追溯β冠状病毒动物来源的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于检测β冠状病毒的引物和探针组合，其中包括分别针对β冠状病毒A普系、B普系、C普系及C普系MERS，和/或D普系的引物和探针；本发明还提供18S rRNA序列作为在哺乳动物和禽类的病毒检测中作为内参基因的应用。进一步提供一种用于一体化检测动物中β冠状病毒的试剂盒，其包括上述的试剂盒包装成的反应液，还包括裂解提取液和清洗液。本发明通过引物和探针的设计，使得在一个反应里同时能检测新型冠状病毒SARS‑CoV‑2，SARS病毒以及MERS病毒等动物源性β冠状病毒，从而在一个反应里实现对三大烈性的高传染性呼吸系统病原体的全覆盖，对于其动物溯源，具有较高的应用价值。

Description

一体化分子诊断系统及其在追溯β冠状病毒动物来源的应用
技术领域：
本发明属于分子生物学，尤其涉及病毒的检测，更具体涉及β冠状病毒溯源的检测。
背景技术：
对于病原体为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的检测，科学家已经提供了检测引物和探针(http://www.chinaivdc.cn/)。疫情严重，寻找传染源、弄清传播途径是社会各界观注的重要问题。中国科学院武汉病毒研究所石正丽团队研究表明这次新型冠状病毒(SARS-CoV-2)与一株蝙蝠体内分离到的冠状病毒序列一致性高达96％(Zhou P,Yang XL, WangXG,et al.Discovery of a novel coronavirus associated with the recentpneumonia outbreak in humans and its potential bat origin.bioRxiv 2020)，可以将天然宿主基本锁定在蝙蝠。然而，蝙蝠体内常在的冠状病毒能否直接感染人类并未可知？SARS-CoV-2是否通过某些中间宿主传染到人？为了回答上述问题，大量的动物溯源工作需要进行。这对于明确SARS-CoV-2传染源、切断传播途径具有重大的意义。2020年2月7日华南农业大学通报，其与合作机构对动物园野生动物的潜在冠状病毒进行宏基因组学分析，并通过分子生物学检测，揭示穿山甲中β冠状病毒的阳性率为70％；进一步对病毒进行分离鉴定，电镜下观察到典型的冠状病毒颗粒结构；最后通过对病毒的基因组分析，发现宏基因拼接出来的毒株序列与目前感染人的毒株序列相似度高达99％，确定穿山甲是可能的潜在宿主。除穿山甲外，还有哪些物种可能作为本次疫情大暴发的中间宿主值得深入研究。
PCR等分子生物学技术因其快速、灵敏等优点，在疾病诊断中的作用越来越明显。尤其是多重荧光定量PCR能够同时检测多种病原体，在呼吸系统疾病诊断上发挥了巨大的作用(Brittain-Long R,Nord S,Olofsson S,et al.Multiplex real-time PCR fordetection of respiratory tract infections.J Clin Virol.2008,41(1):53-56.)，例如应用于 SARS病毒的检测(Hadjinicolaou AV,Farcas GA,Demetriou VL,etal.Development of a molecular-beacon-based multi-allelic real-time RT-PCRassay for the detection of human coronavirus causing severe acute respiratorysyndrome(SARS-CoV):a general methodology for detecting rapidly mutatingviruses.Arch Virol.2011Apr；156(4):671-80.)。但是，由于荧光定量PCR超高的敏感性，容易形成气溶胶污染从而造成假阳性。而且，对操作人员的专业技术要求高，也需要严格的实验室分区，还需要前期的核酸提取等步骤。这从一定程度上限制了荧光定量PCR技术的应用。基于微流控技术的PCR即时检测(point-of-care testing, POCT)是目前国际基因检测的前沿技术之一(Vashist SK.Point-of-Care Diagnostics:Recent Advances andTrends.Biosensors(Basel).2017,7(4).pii:E62.)，将核酸提取与荧光定量基因检测通过微流控卡槽相结合，实现了样本到基因检测结果的全封闭自动输出，将整体检测时间控制在1小时左右。目前以美国Cepheid公司和罗氏公司为首的国际公司纷纷推出了分子POCT仪器和试剂卡槽的荧光定量PCR试剂盒，其快速、无污染、不需要专业人员操作等特性，使之在欧美等发达国家广泛应用。
我国在该领域也在持续的研发与推进，但目前上市的产品较少，尤其是针对追溯β冠状病毒中的检测手段有待进一步加强。
发明内容：
本发明的目的是针对SARS-CoV-2的动物溯源、寻找病毒中间宿主而开发的。本发明整合SARS-CoV-2与动物源冠状病毒RNA的提取、RNA反转录为cDNA分子、多重荧光定量PCR扩增及可视化结果输出为一体,为动物溯源和寻找病毒中间宿主提供了一整套解决方案。
一是本发明通过对各种动物种属的冠状病毒进行序列比对，分析保守区域及二级结构。设计了一整套通用型冠状病毒扩增引物及探针，用于检测动物源冠状病毒，以便寻找SARS-CoV-2的中间宿主。当然本发明同时还可适用对于SARS和MERS的检测。这样能够解决检测中的下述问题：现有分子扩增只针对SARS-CoV-2，只能对是否存在2019年新型冠状病毒进行确诊。无法检测与SARS-CoV-2相近的动物源冠状病毒。因为包括 SARS-CoV-2在内的冠状病毒属于RNA病毒，RNA病毒具有较高的突变率，如果蝙蝠体内的冠状病毒经由某种或者某些中间宿主传染给人，那么这些中间宿主体内的冠状病毒与 SARS-CoV-2序列是存在差异的。只用针对SARS-CoV-2的特异性引物进行检测，则无法检测出与SARS-CoV-2相近但有差异的动物冠状病毒，那就无法检测病毒的中间宿主。
其次是针对的病毒RNA的提取与后续的分子扩增是分隔开来的，步骤繁多，且人工提取病毒RNA会增加人力成本、时间成本，且批量样本中存在样本间均一性不够的问题，会受人为操作因素的影响。因此，还需进一步完善一体化检测，通过一体化检测实现样本的裂解、核酸的提取、RNA的反转录、多重荧光定量PCR反应、结果的可视化输出的一体化、全封闭反应。
因此，本发明首先提供一种用于检测β冠状病毒的引物和探针组合，其选自下述组合之一或多种：
(1)针对β冠状病毒A普系引物和探针，其引物对序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，探针序列为SEQ ID NO.3所示；
(2)针对β冠状病毒B普系引物和探针，其引物对序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示，探针序列为SEQ ID NO.6所示；
(3)针对β冠状病毒C普系引物和探针，其引物对序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示，探针序列为SEQ ID NO.9所示；
(4)针对β冠状病毒C普系MERS引物和探针，其引物对序列分别如SEQ ID NO.10 和SEQ ID NO.11所示，探针序列为SEQ ID NO.12所示；
(5)针对β冠状病毒D普系引物和探针，其引物对序列分别如SEQ ID NO.13和SEQID NO.14所示，探针序列为SEQ ID NO.15所示。
进一步地，对探针的两端进行修饰，优选地为荧光标记修饰，更优选地，5’端用CY5修饰，3’端用BHQ2修饰。
本发明还提供18S rRNA序列作为在哺乳动物和禽类的病毒检测中作为内参基因的应用。进一步地，其作内参基因的引物对序列分别如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示，探针序列为SEQ ID NO.18所示；优选地对探针的两端进行修饰，优选地为荧光标记修饰，更优选地，5’端用ROX修饰，3’端用BHQ2修饰。
另一方面，本发明提供一种检测动物中β冠状病毒的试剂盒，其特征在于，其包括上述第(1)至第(5)项的检测引物和探针组合的一组和多组，或进一步包括内参基因的引物和探针组合，进一步地这些引物和探针组合单独包装或混和包装。更优选地，还包括公认的检测SARS-CoV-2的引物组和探针组合，更具体地，其引物如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示，探针如SEQ ID NO.21所示，和/或引物如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示，探针如SEQ ID NO.24；更进一步地，对探针的两端进行修饰，优选地为荧光标记修饰，更优选地，5’端用FAM修饰，3’端用BHQ1或TAMRA修饰
优选地，所述内参基因为18S rRNA序列，优选地，所述内参基因的引物对序列分别如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示，探针序列为SEQ ID NO.18所示；优选地对探针的两端进行修饰，优选地为荧光标记修饰，更优选地，5’端用ROX修饰，3’端用BHQ2修饰。
在优选实施方式中，所述引物和探针以预混液包装，优选地其包括Mn2+2.5mM；引物和探针的浓度：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示引物各0.3μM，及SEQ ID NO.3所示探针0.2μM；SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示引物各0.3μM，及SEQ ID NO.6所示探针0.2 μM；SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8所示引物各0.2μM，及SEQ ID NO.9所示探针0.15μM； SEQ ID NO.10、SEQID NO.11所示引物各0.3μM，及SEQ ID NO.12所示探针0.2μM；SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14各0.2μM，及SEQ ID NO.15所示探针0.15μM；SEQ ID NO.16、 SEQ ID NO.17所示引物各0.3μM，及SEQ ID NO.18所示探针0.2μM；SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示引物各0.3μM，及SEQID NO.21所示探针0.2μM；SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23所示引物各0.3μM，及SEQ ID NO.24所示探针0.2μM。
本发明还提供一种用于一体化检测动物中β冠状病毒的试剂盒，其特征在于，其包括上述的试剂盒包装成的反应液，还包括裂解提取液和样本洗涤液。优选地，反应液中还包括公认的(如中华人民共和国疾病预防控制中心公示)的检测SARS-CoV-2的引物组和探针组合，更具体地，其引物如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示，探针如SEQ ID NO.21 所示，和/或引物如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示，探针如SEQ ID NO.24，更进一步地，对探针的两端进行修饰，优选地为荧光标记修饰，更优选地，5’端用FAM修饰，3’端用BHQ1或TAMRA修饰。
优选地，所述裂解提取液的组成为：3M Gu.HCl、0.8M NaCl、30％异丙醇、3％Tween20、1％Triton-X100、3mM EDTA、和12mM Tris.HCl。
在具体实施方式中，所述检测中β冠状病毒的包括SARS-CoV-2、SARS-CoV和 MERS-CoV中一种或多种。即可实现对其中一种，两种，以及多种病毒的同时检测。
本发明的引物和探针在检测动物中的β冠状病毒时，可采用现有技术的设置如中国专利申请号201710429121.1，公布号为CN107151700A中公开的试剂盒设备，以实现一体化检测。该专利申请公开的试剂盒设备内设置多个分离腔体，相邻分离腔体之间使用柱塞阻断，分离腔体内分别放置有裂解液、洗涤液和反应液；检测样本时，推动各个柱塞，使柱塞的柱塞孔对准分离腔体，进而导通各个分离腔体，然后利用电磁控制方式，控制试剂盒内的磁珠带动待测样本依次经过各个分离腔体，并依次进行裂解、清洗和反应，最后从外部对反应液中的基因进行光学检测。
本发明的优点包括下述几个方面：
首先，通过引物和探针的设计，使得在一个反应里，不仅能检测当前暴发的新型冠状病毒SARS-CoV-2，也能检测2003年暴发的SARS病毒以及在亚洲部分国家暴发的MERS 病毒，从而在一个反应里实现对三大烈性的高传染性呼吸系统病原体SARS-CoV-2、 SARS-CoV和MERS-CoV的全覆盖。还能对SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV在内的动物源性β冠状病毒进行检测，实现其动物溯源。再一方面，本发明提供的内标基因的荧光定量PCR引物和探针，可以对病毒RNA提取、cDNA合成、荧光定量分子扩增和结果输出进行质量控制以及对动物物种进行质量控制。最后本发明，通过一体化检测实现样本的裂解、核酸的提取、RNA的反转录、多重荧光定量PCR反应、结果的可视化输出的一体化、全封闭反应；其只需要人工加样，剩余均自动化操作，最大限度的降低了人力成本、缩短了时间、减少了人为因素的影响。这样最大限度地降低了人的主观因素的影响，保证了结果的精准性。同时，最大限度地保护了检测操作人员，并降低了环境污染的可能性。
附图说明
图1.β冠状病毒全基因组进化树。
图2.β冠状病毒全基因组一致性分析。
图3.β冠状病毒A普系引物和探针比对图。
图4.β冠状病毒B普系引物和探针比对图。
图5.β冠状病毒C普系引物和探针比对图。
图6.β冠状病毒C普系MERS引物和探针比对图。
图7.β冠状病毒D普系引物和探针比对图。
图8.动物源β冠状病毒多重荧光定量PCR的特异性。
其中，1.B普系+阳性质粒；2.C普系MERS+阳性质粒；3.A普系+阳性质粒；4.D 普系+阳性质粒；5.C普系+阳性质粒；6-20依次为A普系、B普系、C普系、C普系MERS、 D普系分别+猪瘟病毒核酸、鸡传染性法氏囊病病毒核酸、健康宠物猫核酸、大肠杆菌核酸
图9.动物源β冠状病毒多重荧光定量PCR的灵敏度。
其中：1、1×102A普系质粒；2、1×102B普系质粒；3、3×102C普系质粒；4、 1×102C普系MERS质粒；5、2×102D普系质粒；6、1×101A普系质粒；7、1×101B 普系质粒；8、3×101C普系质粒；9、1×101C普系MERS质粒；10、2×101D普系质粒；11、1×100A普系质粒；12、1×100B普系质粒；13、3×100C普系质粒；14、1 ×100C普系MERS质粒；15、2×100D普系质粒。
图10.各物种18S rRNA全长序列进化树。
图11.各物种18S rRNA全长序列同源性分析。
图12.内标引物及探针序列对比图。
图13.内标荧光定量的特异性与灵敏度。
其中：1、1×108质粒；2.1×107质粒；3、1×106质粒；4、1×105质粒；5、1 ×104质粒；6、1×103质粒；7、1×102质粒；8、1×101质粒；9、1×100质粒；10、猪瘟病毒核酸；11、鸡传染性法氏囊病病毒核酸；12、健康宠物猫核酸；13、大肠杆菌核酸。
图14.一体化分子诊断系统扩增反应图。
其中：1、SARS-CoV-2阳性质粒；2、β冠状病毒A普系阳性质粒；3、动物内标核酸。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例一：引物和探针的设计
冠状病毒目前分为四个属，即α冠状病毒，β冠状病毒，γ冠状病毒和δ冠状病毒，取代了传统的三组分类，即第1至3。β冠状病毒属进一步分为A到D系。人冠状病毒 OC43(HCoVOC43)和人冠状病毒HV1(HCoV HKU1)属于β冠状病毒谱系A；严重急性呼吸系统综合症相关病毒(SARS-CoV)属于β冠状病毒谱系B；中东呼吸系统综合症(MERS-CoV)属于β冠状病毒谱系C(Lau SK,Feng Y,Chen H,et al.Severe Acute Respiratory Syndrome(SARS)Coronavirus ORF8 Protein Is Acquired from SARS-Related Coronavirus fromGreater Horseshoe Bats through Recombination.J Virol.2015 Oct；89(20):10532-10547.)。经过分析研究，得出目前能诱发人类传染性的烈性呼吸系统综合症的冠状病毒均属于β冠状病毒属。
为此，通过比较GenBank中典型的人源及动物源的β冠状病毒全基因组序列(序列号包括：AY278488.2，AY304488.1，AY394997.1，AY545919.1，DQ022305.2，EF424621.1，EF424622.1，JX860640.1，JX869059.2，KC869678.4，KF906251.1，KJ473821.1，KJ713298.1，MN908947.3，NC_001846.1，NC_003045.1，NC_004718.3，NC_005147.1，NC_006577.2， NC_007732.1，NC_009019.1，NC_009020.1，NC_009021.1，NC_010327.1，NC_012936.1， NC_017083.1，NC_019843.3)，首先进行遗传演化分析，其进化树如图1如示。因而，发现在物种人、果子狸、獾、蝙蝠、骆驼、单峰驼、羚羊、长颈鹿、鼠、猪、牛、马、兔、犬之间β冠状病毒序列的一致性从45.3％到100％(如图2如示)，说明各物种β冠状病毒之间存在较大的差异，进化树分析显示形成四个相对独立的分枝，即普系A-D。经济动物的β冠状病毒主要位于A普系；MERS样β冠状病毒主要位于C普系；SARS样β冠状病毒主要位于B普系；最近暴发的新型冠状病毒SARS-CoV-2同样位于B普系。而各普系间的序列同源性较低，通过一组引物进行各普系的扩增并不现实。
为此，本发明试图通过几组引物进行联合扩增，以实现对β冠状病毒各普系的检测。首先，通过比对各普系序列进一步找出基因的保守区域，排除序列中高级结构复杂的区域以挑选出引物设计区。设计并筛选出一组各参数指标优良的针对β冠状病毒A普系的引物组和探针，其序列对比如图3如示，探针5’端修饰CY5，3’端标记BHQ2(如表1中 SEQ IDNO.1-3所示)；针对β冠状病毒B普系的引物组和探针序列对比如图4如示，探针5’端修饰CY5，3’端标记BHQ2(如表2中SEQ ID NO.4-6所示)；针对β冠状病毒C 普系的引物组和探针序列对比如图5如示(如表3中SEQ ID NO.7-9)；由于中东呼吸系统综合症MERS这一烈性病原的毒株序列与同一分枝的其他C普系病毒序列存在较大差异，故针对MERS病毒特征序列设计其引物与探针，其中针对C普系的MERS引物组和探针序列对比如图6如示，探针5’端修饰CY5，3’端标记BHQ2(表4中SEQ ID NO.10-12 所示)；针对β冠状病毒D普系的引物组和探针序列对比如图7如示，探针5’端修饰CY5， 3’端标记BHQ2(如表5中SEQ ID NO.13-15)。分别用β冠状病毒各普系的阳性质粒进行定量PCR反应，A-D普系引物组和探针均有良好的扩增，如图8曲线1-5所示。
表1.β冠状病毒A普系引物和探针
Figure RE-GDA0002564936430000081
表2.β冠状病毒B普系引物和探针
Figure RE-GDA0002564936430000082
表3.β冠状病毒C普系引物和探针
Figure RE-GDA0002564936430000083
表4.β冠状病毒C普系MERS引物和探针
引物/探针 引物序列 5’端修饰 3’端修饰
上游引物SEQ ID NO.10 GGAGTTGATGATGTATGC / /
下游引物SEQ ID NO.11 CCACGAAATCATAGAAGTC / /
探针SEQ ID NO.12 CACATTGCCTCCTCTAACGCT CY5 BHQ2
表5.β冠状病毒D普系引物和探针
Figure RE-GDA0002564936430000084
Figure RE-GDA0002564936430000091
实施例二：最佳反应条件和程序
通过对反应体系中Mn2+离子不同浓度、各组引物和探针SEQ ID NO.1-15不同终浓度的筛选以及DNA聚合酶的特性确定最佳反应预混液和最佳反应程序。最佳反应预混液组成为：RNA-direct realtime PCR master mix(1×，东洋纺生物科技有限公司)，Mn2+2.5mM、引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.10、 SEQ IDNO.11各0.3μM；引物SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14 各0.2μM；探针SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.12各0.2μM，探针SEQ ID NO.9、 SEQ ID NO.15各0.15μM。最佳反应程序为：90℃30s,61℃20min；95℃30s,40循环 (95℃0s,60℃45s)。
以标准阳性质粒和猪瘟病毒核酸、鸡传染性法氏囊病病毒核酸、健康宠物猫核酸、大肠杆菌核酸进行反应，证明该引物组扩增效率优良，并且与猪瘟病毒核酸、鸡传染性法氏囊病病毒核酸、健康宠物猫核酸、大肠杆菌核酸不发生非特异反应(如图8所示)。β冠状病毒基因序列与其他病原基因序列差异大，且引物对与探针均在β冠状病毒序列中保守而特异，与其他核酸在45个循环内扩增曲线均无起峰，说明特异性优良。而如图9所示：β冠状病毒A普系多重荧光定量PCR的灵敏度为10个拷贝；β冠状病毒B普系多重荧光定量PCR的灵敏度为10个拷贝；β冠状病毒C普系MERS多重荧光定量PCR的灵敏度为10个拷贝；β冠状病毒C普系多重荧光定量PCR的灵敏度为30个拷贝；β冠状病毒D普系多重荧光定量PCR的灵敏度为20个拷贝；结果判断为：无Ct值或者Ct为40 判定为阴性；Ct值小于37判定为阳性；Ct值在37-40之间判定为可疑，并重复试验，若重复试验Ct小于40，扩增曲线有明显起峰，则判定为阳性，否则为阴性。
实施例三：内标基因的确定
通过比较GenBank中几乎所有可查的哺乳动物和禽类的全长18S rRNA序列(序列号包括：XR_004135034.1；NR_046261.1；XR_003587981.1；NR_046271.1；EU823286.1； XR_004038418.1；XR_002788481.1；X00640.1；XR_002778881.1；NR_036642.1；XR_004246958.1；NR_146166.1；NR_145820.1；XR_004069086.1；NR_046237.1；FM165414.1；XR_003493879.1)，首先进行遗传演化分析，其进化树如图10如示，发现在物种人、猪、牛、羊、马、兔、鸡、鸭、鼠、豚鼠、猕猴、大猩猩、长臂猿、骆驼、鹿、蝙蝠、鲸之间18S rRNA序列的一致性从93.3％到99.9％(如图11如示)，说明该基因在哺乳动物及禽类中保守，可作为理想的内标基因。并通过序列比对进一步找出基因的保守区域，并排除序列中高级结构复杂的区域，挑选出用于设计内标的引物设计区，设计并筛选出一组各参数指标优良的引物组和探针(如图12如示)，并根据极少数序列位点的差异，在探针和下游引物中分别引入一个简并碱基(如表6如示)。进一步对反应预混液配方、反应程序进行优化，最终确定最佳反应预混液为：RNA-direct realtime PCR master mix(1 ×，东洋纺生物科技有限公司)、Mn2+2.5mM、上游引物SEQ ID NO.16 0.3μM、下游引物SEQ ID NO.17 0.3μM、探针SEQ ID NO.180.2μM、最佳反应程序为：90℃30s，61℃ 20min；95℃30s，40循环(95℃0s，60℃45s)。以标准阳性质粒为模板，进行10倍倍比稀释以测试内标基因引物和探针的灵敏度，证明该方法能检测出10个拷贝的标准阳性质粒，而1个拷贝的标准阳性质粒检测为阴性，说明该方法的检测灵敏度为10个拷贝的内标核酸(如图13所示)。同时不与猪瘟病毒核酸、鸡传染性法氏囊病病毒核酸、健康宠物猫核酸、大肠杆菌核酸发生非特异反应，18S rRNA序列与其他病原基因序列或其他内标基因序列差异大，且引物对与探针均在18S rRNA序列中保守而特异，与其他核酸在45 个循环内扩增曲线均无起峰，说明内标基因荧光定量PCR特异性良好(如图13所示)。
表6.内标18S rRNA引物和探针
引物/探针名称 引物序列 5’端修饰 3’端修饰
上游引物SEQ ID NO.16 TTGCCAAGAATGTTTTCATTA / /
下游引物SEQ ID NO.17 CATCGTTTRTGGTCGGAA / /
探针SEQ ID NO.18 ATCTGATCGTCTTCRAACCTCCG ROX BHQ2
实施例四：样品裂解提取液的确定
本发明测试了两种裂解提取液A与B，其组份如表7所示，后续用相同的洗涤液I 和II依次进行清洗，洗涤液I包含1M Gu.HCl、10mM Tris.HCl、1mM EDTA、0.2M NaCl、 2％Tween 20、60％乙醇，洗涤液II包含70％乙醇。用10mM Tris-HCl、1mM EDTA(pH 8.0) 进行洗脱。
表7.裂解提取液的组份
Figure RE-GDA0002564936430000111
通过A、B裂解提取液对9份样本产量和纯度的比较，裂解提取液A的产量为61±5.73，裂解提取液B的产量为65.9±3.98，B的产量更高，但二者并无显著差异。二者的纯度比较如表8所示，裂解提取液A的纯度为1.9±0.07，裂解提取液B的纯度为2.01±0.04，B的纯度更高，且差异显著。表明裂解提取液B的产物更纯，对后续反应的抑制作用会更小。为此，本发明采用在封闭环境下利用纳米磁珠进行核酸提取，选取裂解提取液B进行裂解与提取联合通用。
表8.裂解提取液A、B产物的纯度(A260/280)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
裂解提取液A 1.79 1.89 1.87 1.97 1.99 1.93 1.97 1.88 1.79
裂解提取液B 1.95 1.98 1.97 2.03 2.09 2.05 2.01 2.03 1.99
实施例五：一体化检测
本发明将样本核酸提取与基因定量检测进行一体化整合，实现了样本到基因检测结果的自动化封闭式输出。本实施例采用的一体化检测试剂卡，其结构参见中国专利申请201710429121.1，公布号为CN107151700A。
1、本发明实施例四中的样本裂解提取液存贮于一体化检测试剂卡的第一个小室内(自上而下)，以实现样本的裂解与核酸的提取；实施例四中的样本洗涤液I存贮于一体化检测试剂卡的第二个小室内，以实现核酸的第一次洗涤；实施例四中的样本洗涤液II存贮于一体化检测试剂卡的第三个小室内，以实现核酸的第二次洗涤；实施例一、三中的引物、探针，以及中华人民共和国疾病预防控制中心公示的两对引物组和探针(SEQ ID NO.19 至SEQ ID NO.24)及整个反应预混液存贮于一体化检测试剂卡的第四个小室内，以实现多重荧光定量PCR反应。
引物和探针的使用浓度：引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、 SEQ IDNO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23各0.3μM；引物SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、 SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.14各0.2μM；探针SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.12、 SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.24各0.2μM，探针SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.15各0.15μM。
2、将采集动物样本200μL，加入一体化检测试剂卡，盖盖封闭该卡。在一体化检测试剂卡内逐步进行以下反应：
(1)对样本进行裂解，磁珠吸附包括新型冠状病毒SARS-CoV-2在内的其他动物源的冠状病毒RNA、内标基因的RNA等；
(2)磁珠吸附冠状病毒RNA、内标基因RNA进行定向移动，洗涤去除磁珠上的杂质、蛋白等非核酸样本；
(3)磁珠进入分子扩增反应区，冠状病毒RNA等从磁珠上进行解离，在反转录酶的作用下将RNA反转录为相应cDNA分子，DNA作模板进行多重荧光定量PCR反应， SARS-CoV-2的探针5’端用FAM标记，动物冠状病毒的探针5’端用Cy5标记，内标的探针5’端用ROX标记，扩增反应将各类探针水解，5’端的荧光标记物释放，相应的荧光信号被捕捉并记录。
(4)记录的各荧光信号反映为相应的荧光曲线出现对数增长期及平台期，并输出到可视屏上，荧光信号实时捕捉，荧光曲线实时反馈。
从而对SARS-CoV-2、动物冠状病毒、内标进行实时监控。内标的荧光曲线出现对数增长的阳性扩增，证明了该一体化系统的样本裂解、核酸提取、RNA反转录为相应cDNA、荧光定量的分子扩增等环节均正常工作，即一体化系统运行优良。同时，内标的阳性扩增还能证明对应的动物样本采样成功。SARS-CoV-2的荧光曲线出现对数增长的阳性扩增，证明该样本中存在2019新型冠状病毒的RNA。动物冠状病毒的荧光曲线出现对数增长的阳性扩增，证明该样本中存在动物冠状病毒的RNA。
其中，针对新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测用引物组和探针，中华人民共和国疾病预防控制中心公示的两对引物组和探针如下：正向引物ORF1ab-F：
CCCTGTGGGTTTTACACTTAA(SEQ ID NO.19)；反向引物ORF1ab-R：
ACGATTGTGCATCAGCTGA(SEQ ID NO.20)；探针ORF1ab-P：
CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG(SEQ ID NO.21)，探针5’端标记FAM，3’端标记BHQ1。
靶向核蛋白(nucleoprotein,N)的正向引物N-F：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT (SEQID NO.22)；反向引物N-R：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG(SEQ ID NO.23)；探针N-P：TTGCTGCTGCTTGACAGATT(SEQ ID NO.24)，探针5’端标记FAM，3’端标记TAMRA。其最佳反应预混液为：RNA-direct realtime PCR master mix(1×，东洋纺生物科技有限公司)，Mn2+2.5mM、引物ORF1ab-F、ORF1ab-R、N-F、N-R各0.3μM，探针 ORF1ab-P、N-P各0.2μM。最佳反应程序为：90℃30s,61℃20min；95℃30s,40循环(95℃ 0s,60℃45s)。结果判断为：无Ct值或者Ct为40判定为阴性；Ct值小于37判定为阳性； Ct值在37-40之间判定为可疑，并重复试验，若重复试验Ct小于40，扩增曲线有明显起峰，则判定为阳性，否则为阴性(http://www.chinaivdc.cn/)。
将SARS-CoV-2阳性质粒和动物β冠状病毒A普系阳性质粒混入健康宠物猫的咽拭子液中，模拟临床样本，取咽拭子液200μL加入一体化分子诊断试剂卡内进行反应，其结果如图14所示：有3条扩增曲线出现典型的对数增长型起峰，且起峰时间均在18个循环左右，曲线1指示样本中存在SARS-CoV-2核酸；曲线2指示样本中存在动物β冠状病毒核酸；曲线3指示样本中存在内标核酸，且说明一体化分子诊断系统运行良好。
序列表
<110> 泰州蕾灵百奥生物科技有限公司
<120> 一体化分子诊断系统及其在追溯β冠状病毒动物来源的应用
<160> 24
<170> Patent-In 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400> 1
atggyaagac agtyttrg 18
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400> 2
ccwacagata gcttataagt g 21
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：探针
<400>3
acaccattag tcaactcact cttatca 27
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400> 4
gcagatgggc tatgtaaa 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400> 5
tgctgtttag ytacgagaa 19
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：探针
<400>6
acgatacata gtctactctt gtgcaga 27
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400> 7
ttaaacgagt ccggggtt 18
<210>8
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400> 8
cagatgtcra atgcccta 18
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：探针
<400>9
tgtaaatgcc cgamtagaac cctgt 25
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400> 10
ggagttgatg atgtatgc 18
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400> 11
ccacgaaatc atagaagtc 19
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：探针
<400>12
cacattgcct cctctaacgc t 21
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400> 13
atggcaayaa gwtatataac tc 22
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400> 14
gtacgatata tacccaagta 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：探针
<400>15
cgcctctgta agccctgcac 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400> 16
ttgccaagaa tgttttcatt a 21
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400> 17
catcgtttrt ggtcggaa 18
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：探针
<400>18
atctgatcgt cttcraacct ccg 23
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400> 19
ccctgtgggt tttacactta a 21
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400> 20
acgattgtgc atcagctga 19
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：探针
<400>21
ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatgg 28
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400> 22
ggggaacttc tcctgctaga at 22
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400> 23
cagacatttt gctctcaagc tg 22
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：探针
<400>24
ttgctgctgc ttgacagatt 20

Claims (10)

1.一种用于检测β冠状病毒的引物和探针组合，其选自下述组合之一或多种：
(1)针对β冠状病毒A普系引物和探针，其引物对序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，探针序列为SEQ ID NO.3所示；
(2)针对β冠状病毒B普系引物和探针，其引物对序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示，探针序列为SEQ ID NO.6所示；
(3)针对β冠状病毒C普系引物和探针，其引物对序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示，探针序列为SEQ ID NO.9所示；
(4)针对β冠状病毒C普系MERS引物和探针，其引物对序列分别如SEQ ID NO.10和SEQID NO.11所示，探针序列为SEQ ID NO.12所示；或
(5)针对β冠状病毒D普系引物和探针，其引物对序列分别如SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14所示，探针序列为SEQ ID NO.15所示。
2.如权利要求1所述的用于检测β冠状病毒的引物和探针组合，其特征在于：对探针的两端进行修饰，优选地为荧光标记修饰，更优选地，5’端用CY5修饰，3’端用BHQ2修饰。
3.18S rRNA序列作为在哺乳动物和禽类的病毒检测中作为内参基因的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，其作内参基因的引物对序列分别如SEQ IDNO.16和SEQ ID NO.17所示，探针序列为SEQ ID NO.18所示；优选地对探针的两端进行修饰，优选地为荧光标记修饰，更优选地，5’端用ROX修饰，3’端用BHQ2修饰。
5.一种检测动物中β冠状病毒的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1或2中的第(1)至第(5)项的检测引物和探针组合的一组或多组进一步地这些引物和探针组合单独包装或混和包装；优选地，还包括内参基因的引物和探针组合，进一步优选还包括公认的检测SARS-CoV-2的引物组和探针组合，更具体地，其引物如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示，探针如SEQ ID NO.21所示，和/或引物如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示，探针如SEQ IDNO.24；更进一步地，对探针的两端进行修饰，优选地为荧光标记修饰，更优选地，5’端用FAM修饰，3’端用BHQ1或TAMRA修饰。
6.如权利要求5所述的β冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述内参基因为18S rRNA序列，优选地，所述内参基因的引物对序列分别如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示，探针序列为SEQ ID NO.18所示；优选地对探针的两端进行修饰，优选地为荧光标记修饰，更优选地，5’端用ROX修饰，3’端用BHQ2修饰。
7.如权利要求5或6所述的β冠状病毒的试剂盒，其特征在于，优选地所述引物和探针以预混液包装，优选地其包括Mn2+2.5mM；引物和探针的浓度：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示引物各0.3μM，及SEQ ID NO.3所示探针0.2μM；SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示引物各0.3μM，及SEQ ID NO.6所示探针0.2μM；SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示引物各0.2μM，及SEQ IDNO.9所示探针0.15μM；SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示引物各0.3μM，及SEQ ID NO.12所示探针0.2μM；SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14各0.2μM，及SEQ ID NO.15所示探针0.15μM；SEQID NO.16、SEQ ID NO.17所示引物各0.3μM，及SEQ ID NO.18所示探针0.2μM；SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.20所示引物各0.3μM，及SEQ ID NO.21所示探针0.2μM；SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23所示引物各0.3μM，及SEQ ID NO.24所示探针0.2μM。
8.一种用于一体化检测动物中β冠状病毒的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求5至7任一项所述的试剂盒包装成的反应液，还包括裂解提取液和样本洗涤液。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解提取液的组成为：3M Gu.HCl、0.8M NaCl、30％异丙醇、3％Tween 20、1％Triton-X100、3mM EDTA、和12mM Tris.HCl。
10.如权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述检测中β冠状病毒的包括SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV中一种或多种，可用于追溯β冠状病毒动物来源。
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