CN109762941B

CN109762941B - 一种检测致禽类死亡病原的液态芯片

Info

Publication number: CN109762941B
Application number: CN201910114558.5A
Authority: CN
Inventors: 王君玮; 赵格; 刘娜; 赵建梅; 蒋文明; 曲志娜; 王娟; 刘俊辉
Original assignee: CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER
Current assignee: CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER
Priority date: 2019-02-14
Filing date: 2019-02-14
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2039-02-14
Also published as: CN109762941A

Abstract

本发明涉及一种用于同时检测13种可致禽类死亡病原的引物和液态芯片方法。其上游引物具有F1‑F2‑F3所表示的序列，其中F1与用于液态芯片结果读取的配伍微球所连接的序列反向互补，F3与待检病原特异基因序列互补，F2为(CH2)n间臂，优选n为18；下游引物为与待检病原特异基因序列互补的R序列，并在5’端标记生物素。具体涉及用于检测克制禽类死亡一至十三种病原的至少一对液态芯片引物，还涉及包含所述引物序列的液相芯片、试剂盒及其检测方法。采用本发明方法，只进行一次试验就能同时快速检测可致禽类死亡的13种病原，不互相干扰。操作简便，耗时短，成本低，特异性强，灵敏度高，样品适用范围广，试剂中均无感染性和生物安全隐患成分，使用安全。

Description

一种检测致禽类死亡病原的液态芯片

技术领域

本发明属于病原微生物检测技术领域，具体涉及一种检测致禽类死亡病原的液态芯片。

背景技术

随着生活水平的提高，人们对动物产品的需求量越来越大，对食品安全问题也越来越重视。尽管我国在动物及其产品检疫监督方面出台了一系列法律法规来保证动物产品的质量安全，但是仍有少数不法商贩，受利益驱使，无视群众健康和法律法规，屠宰和经营病害动物或其产品，这种行为，不仅影响动物疫病防控，而且影响动物产品消费安全。现实中动物卫生监管基层执法人员在市场、流通、仓储等环节查获无检疫证明的动物或其产品的情况时有发生，明知存在质量问题，却缺乏现行有效的可快速通量鉴定病害动物及其产品的技术依据，无法及时认定，严重影响动物卫生监督执法工作的开展。

虽然根据对相关人员的调查或所查获动物表现出的临床性状，可初步判断疑似病死动物的发病种类，但是并不能进一步明确致病微生物的种类；而且在背景不明，又已屠宰的情况下，很难直接判断其发病类型，可见，利用现行的针对动物病原的诊断标准无法进行检测判定。因此更为可行的是根据病死动物的种类，研发一种灵敏通量地检测导致此动物死亡的所有可能病原的技术，快速有效的确定致病原的种类，既可作为基层人员的执法依据，又有利于问题动物及其产品的追踪和溯源，以及相关动物疫病的防控和预警，从而更好的保护消费者的健康和生命安全。

病死或死因不明的禽类或其产品是现实中最常被动物卫生监督部门查获的问题动物及其产品，结合农业部兽医局编制的《一二三类动物疫病释义》和临床经验，选定了13种可致禽类死亡的病原：包括高致病性禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、马立克病毒(MAR)、腺病毒(ADV)，巴氏杆菌(Pm)、沙门菌(Sal)、致病性大肠杆菌(Eco)、单增李斯特菌(Lis)和柔嫩艾美耳球虫(ET)以及毒害艾美尔球虫(EN)。目前国内技术部门对这些病原的检测仍旧依靠病原分离培养、血清平板凝集试验、血清中和试验、酶联免疫吸附实验，这些检测方法不仅成本高，而且所需时间长，批量检测能力弱。近年来分子生物学方法如PCR以及荧光定量PCR也被用于个别禽类病原的检测，但毕竟都是基于某一种病原开发的方法，无法一次性通量检测这13种病原。

鉴于我国对禽病发生流行时往往是几种病原混合、交叉或继发感染，仅凭疾病的流行特征、发病症状及组织学病理等方法是很难对其进行准确的判定，因此，亟需一种通量高、灵敏特异的快速鉴定禽类致死病原的方法，既为动物卫生执法提供技术依据，又为禽类的安全养殖提供技术支撑。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种检测13种致禽类死亡病原的液态芯片，可快速、灵敏、特异且高通量的检测可致禽类死亡的13种病原，从而弥补现有技术的不足。

本发明克服国内外现有通量鉴别病死禽类及其产品的快速诊断技术的缺陷，建立可致禽类死亡十三种病原的液态基因芯片检测技术，并提供这种检测技术的试剂和操作方法，使其具有特异、灵敏、高通量、快速和操作方便等特点。

为实现上述目的，本发明设计特异性引物并筛选和优化这些引物。优化了PCR反应条件及其扩增产物与特异性的荧光编码MagPlex-Tag微球的杂交条件，并提出了符合要求的样品病原核酸。采用Luminex^TM200仪器直接进行结果读取和判定，对得出的结果进行分析同时建立严谨科学的检测方法。最后进行方法验证，将其应用于可致禽类死亡的十三种病原感染病的快速诊断和研究工作中。

本发明首先提供一种用于液态芯片的检测引物，所述的检测引物，其上游引物具有F1-F2-F3的序列，其中F1的序列与用于液态芯片结果读取的配伍微球所连接的序列反向互补，F3的序列与待检病原的特异基因序列互补，F2为(CH2)n间臂，其中n≥3；优选n为12或18，特别优选18；下游引物为与待检病原的特异基因序列互补的R序列，并在5′端标记生物素；

所述的检测引物包含有：

检测高致病性禽流感病毒的引物中，上游引物中F1的序列为SEQ ID NO:1，F3的序列为SEQ ID NO:2，下游引物的序列为SEQ ID NO:3；

检测新城疫病毒的引物，上游引物中F1的序列为SEQ ID NO:4，F3的序列为SEQ IDNO:5，下游引物的序列为SEQ ID NO:6；

检测传染性喉气管炎病毒的引物：上游引物中F1的序列为SEQ ID NO:7，F3的序列为SEQ ID NO:8，下游引物的序列为SEQ ID NO:9；

检测传染性支气管炎病毒的引物：上游引物中F1的序列为SEQ ID NO:10，F3的序列为SEQ ID NO:11，下游引物的序列为SEQ ID NO:12；

检测传染性法氏囊病毒的引物：上游引物中F1的序列为SEQ ID NO:13，F3的序列为SEQ ID NO:14，下游引物的序列为SEQ ID NO:15；

检测马立克病毒的引物：上游引物中F1的序列为SEQ ID NO:16，F3的序列为SEQID NO:17，下游引物的序列为SEQ ID NO:18；

检测腺病毒的引物：上游引物中F1的序列为SEQ ID NO:19，F3的序列为SEQ IDNO:20，下游引物的序列为SEQ ID NO:21；

检测巴氏杆菌的引物：上游引物中F1的序列为SEQ ID NO:22，F3的序列为SEQ IDNO:23，下游引物的序列为SEQ ID NO:24；

检测沙门菌的引物：上游引物中F1的序列为SEQ ID NO:25，F3的序列为SEQ IDNO:26，下游引物的序列为SEQ ID NO:27；

检测致病性大肠杆菌的引物：上游引物中F1的序列为SEQ ID NO:28，F3的序列为SEQ ID NO:29，下游引物的序列为SEQ ID NO:30；

检测单增李斯特菌的引物：上游引物中F1的序列为SEQ ID NO:31，F3的序列为SEQID NO:32，下游引物的序列为SEQ ID NO:33；

检测柔嫩艾美耳球虫的引物：上游引物中F1的序列为SEQ ID NO:34，F3的序列为SEQ ID NO:35，下游引物的序列为SEQ ID NO:36；

检测毒害艾美尔球虫的引物：上游引物中F1的序列为SEQ ID NO:37，F3的序列为SEQ ID NO:38，下游引物的序列为SEQ ID NO:39。

本发明还涉及一种用于检测对禽类病原的液态芯片，其特征包括：

1)上述的检测引物；

2)偶联一定核苷酸片段的微球，所述的核苷酸片段能相应的与1)中引物序列的F1片段互补配对；所述核苷酸片段的序列选自SEQ ID NO:40-52，

本发明还涉及一种用于检测禽类一至十三种病原的试剂盒，包含有上述的检测引物和液态芯片；

本发明的试剂盒应还可以包括PCR反应液、待检测的禽类十三种病原特异基因的质粒DNA对照样品、稀释液和杂交液。

本发明还保护所述引物，所述液态芯片，所述试剂盒用于检测禽类一至十三种病原的方法，其步骤为：

1)样品DNA或RNA提取；

所述样品DNA或RNA提取中，需要对DNA和RNA进行260nm和280nm的紫外光吸收率的测定，OD260值在0.05～1的区间内，且OD260/OD280比值在1.5～2.0之间；

2)PCR扩增；

所述PCR扩增中，采用检测引物进行扩增；PCR的扩增体系如下：2×TaKaRa PremixTaq^TM 25μL；上下游引物浓度分别为0.2μM～1.0μM；从禽类组织中提取RNA病毒核酸并反转录合成的cDNA模板1μL，或DNA病毒核酸或细菌DNA或球虫DNA模板1μL；补水至50μL；反应条件为94℃预变性10min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；72℃10min。

3)与微球杂交：

所述与微球杂交为：取2.6μL的微球，加入17.4μL的1×杂交缓冲液，混匀；加入5μL的PCR产物；加入70～75μL用1×杂交缓冲液稀释125倍的streptavidin-R-phycoerythrin，37℃孵育30min(所述1×杂交缓冲液为0.1M Tris-Cl pH 8.0，0.2M NaCl和0.08％TritonX-100)。

4)仪器分析：

所述仪器分析为在Luminex ^TM200仪器上读取荧光中位数MFI值，根据读数进行结果判定；具体的，所述结果判定为：当样品的MFI值与空白样品的MFI值的比值≥3时结果判为阳性，如果其比值＜2时判为阴性。

本发明的优点和积极效果为：

1、禽类十三种病原的液态基因芯片检测技术与国内外现有或应用的PCR等方法相比较,本方法只进行一次试验就能同时快速检测禽类高致病性禽流感病毒、新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、马立克病毒、腺病毒、巴氏杆菌、沙门菌、致病性大肠杆菌、单增李斯特菌、以及柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美尔球虫十三种病原，也可根据实际情况对这十三种病原进行自由增减，不互相干扰。该方法操作简单，耗时短，特异性强，灵敏度高，且具有重复性和稳定性，总体成本低，为上述十三种病原及其禽病的快速诊断提供了一个新的技术平台。

2、本方法的检测试剂盒可同时对可致禽类死亡的十三种病原进行快速检测，样品适用范围广，试剂中均无感染性的和生物安全隐患的成分，使用安全。

3、本发明的方法在PCR扩增后，不需要对PCR产物进行处理，可直接与微球杂交，节省了时间，简化了工艺。

附图说明

图1为应用十三对引物对各特异病原扩增的PCR电泳图。

图2为十三种病原的液态芯片特异性检测结果。

图3为十三种病原的液态芯片敏感性检测结果。

具体实施方式

本发明选择GenBank中高致病性禽流感病毒的基质蛋白基因M、新城疫病毒的大聚合酶蛋白基因L、传染性喉气管炎病毒的感染细胞蛋白基因ICP4、传染性支气管炎病毒的基质蛋白基因M、传染性法氏囊病毒的囊膜蛋白基因VP2～Vp4、马立克病毒的致瘤基因Meq、腺病毒的衣壳蛋白基因Hexon、巴氏杆菌的Kmt基因、沙门菌的侵袭蛋白invA基因、致病性大肠杆菌编码葡萄糖苷酸酶的uidA基因、单增李斯特菌的溶血素蛋白hly基因、以及柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美尔球虫的ITS序列。分别针对上述十三种禽类病原，各选择不同实验室分离的至少20株病原的相应基因，进行序列同源性比较，选择其保守区域，通过primer plexP2273多重引物软件设计候选引物，并经过大量的反应条件优选，对比试验和验证试验才获得用于鉴别诊断的特异性引物。所形成的引物组合包含的引物碱基数为18～22个，引物的熔解温度Tm值为54℃～64℃，引物GC％为40％～60％。同时进行筛选，保留不能形成引物二聚体的引物，所获得的这对引物其扩增的目标片段长度为100bp～200bp。合成或标记的引物均可采用HPLC纯化。

本发明上游引物的5’端合成一段Luminex^TM生产的MagPlex-Tag微球上序列成反向互补核酸序列，再加上十八个碳原子的间臂或间隔臂(spacer18)，5’端依据所检测病原基因序列设计；常见的间臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间臂，n大于等于3，如(CH2)12，(CH2)18等。本发明间臂优选(CH2)12-(CH2)18，特别优选(CH2)18，用spacer18来表示。本发明下游引物的5’端标记生物素。

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，贺福初等译的《分子克隆实验指南》，第四版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过市购获得的常规产品。

实施例1、液态芯片制备

一、设计并合成引物

根据GenBank中高致病性禽流感病毒的基质蛋白基因M(KT717285.1)、新城疫病毒的大聚合酶蛋白基因L(EU419634.1)、传染性喉气管炎病毒的感染细胞蛋白基因ICP4(KM214367.1)、传染性支气管炎病毒的基质蛋白基因M(HQ018917.1)、传染性法氏囊病毒的囊膜蛋白基因VP2～Vp4(AY333088.1)、马立克病毒的致瘤基因Meq(AF493556.1)、腺病毒的衣壳蛋白基因Hexon(KX640912.1)、巴氏杆菌的Kmt基因(CP004392.1)、沙门菌的侵袭蛋白invA基因(M90846.1)、致病性大肠杆菌编码葡萄糖苷酸酶的uidA基因(CP017440.1)、单增李斯特菌的溶血素蛋白hly基因(HG813249.1)、以及柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美尔球虫的ITS序列(AF446075.1和FJ449694.1)。分别针对上述十三种对禽类病原的基因进行序列同源性比较，选择其保守区域，通过primer plex P2273多重引物软件设计候选引物。

其上游引物具有F1-F2-F3的序列，其中F1的序列与用于液态芯片结果读取的配伍微球所连接的序列反向互补，F3的序列与待检病原的特异基因序列互补，F2为(CH2)n间臂，其中n≥3；优选n为12或18，特别优选18；下游引物为与待检病原的特异基因序列互补的R序列，并在5′端标记生物素。以下spacer18均表示(CH2)18间臂，即n＝18。

(1)高致病性禽流感病毒引物：

AIV-F：

5'-tacttctttactacaatttacaac-Spacer18-CAGCGATTCAAGTGATCCTCTC-3'(小写字母表示F1，为微球连接序列的反向互补核酸序列(SEQ ID NO:1)；大写字母表示F3，为根据各病原具体蛋白基因序列设计的引物(SEQ ID NO:2))

AIV-R：5'-Biotin-CTGCCGATAYTCTTCCCTCAT-3'(SEQ ID NO:3)

(2)新城疫病毒引物：

NDV-F：5'-caaacaaacattcaaatatcaatc-Spacer18-GCMGTCAACATATACACCTCAT-3'

(小写字母表示F1，为微球连接序列的反向互补核酸序列(SEQ ID NO:4)；大写字母表示F3，为根据各病原具体蛋白基因序列设计的引物(SEQ ID NO:5))

NDV-R：5'-Biotin-AGAGCYACACCGCCRATAA-3'(SEQ ID NO:6)

(3)传染性喉气管炎病毒引物：

ILTV-F：5'-caaacaaacattcaaatatcaatc-Spacer18-GTCAAGAAGTGGTGAGGAAGTC-3'(小写字母表示F1，为微球连接序列的反向互补核酸序列(SEQ ID NO:7)；大写字母表示F3，为根据各病原具体蛋白基因序列设计的引物(SEQ ID NO:8))

ILTV-R：5'-Biotin-GGAAGAGGAGGAAGAGGTAAGG-3'(SEQ ID NO:9)

(4)传染性支气管炎病毒引物：

IBV-F：5'-atctcaattacaataacacacaaa-Spacer18-AARTCACGCTCAAGTTCAAGAC-3'(小写字母表示F1，为微球连接序列的反向互补核酸序列(SEQ ID NO:10)；大写字母表示F3，为根据各病原具体蛋白基因序列设计的引物(SEQ ID NO:11))

IBV-R：5'-Biotin-GCATTGTTCCTCTCCTCATCTG-3'(SEQ ID NO:12)

(5)传染性法氏囊病毒引物：

IBDV-F：5'-aatttcttctctttctttcacaat-Spacer18-AGGGTCAGGGCTAATTGTCTTT-3'(小写字母表示F1，为微球连接序列的反向互补核酸序列(SEQ ID NO:13)；大写字母表示F3，为根据各病原具体蛋白基因序列设计的引物(SEQ ID NO:14))

IBDV-R：5'-Biotin-TGTCAGTTCACTCAGGCTTCC-3'(SEQ ID NO:15)

(6)马利克病毒引物：

MAR-F：5'-cacttaattcattctaaatctatc-Spacer18-TGTTACCGAGCCGTGTACC-3'(小写字母表示F1，为微球连接序列的反向互补核酸序列(SEQ ID NO:16)；大写字母表示F3，为根据各病原具体蛋白基因序列设计的引物(SEQ ID NO:17))

MAR-R：5'-Biotin-CCCGAATACAAGGAATCCTGTT-3'(SEQ ID NO:18)

(7)腺病毒引物：

ADV-F：5'-tcatcactttctttactttacatt-Spacer18-CTTCTACCTCTCGCACACCTT-3'(小写字母表示F1，为微球连接序列的反向互补核酸序列(SEQ ID NO:19)；大写字母表示F3，为根据各病原具体蛋白基因序列设计的引物(SEQ ID NO:20))

ADV-R：5'-Biotin-TGATGTCGCACTGGCTCAT-3'(SEQ ID NO:21)

(8)巴氏杆菌引物：

Pm-F：5'-aatcaacacacaataacattcata-Spacer18-TGTAAACGAACTCGCCACTTT-3'(小写字母表示F1，为微球连接序列的反向互补核酸序列(SEQ ID NO:22)；大写字母表示F3，为根据各病原具体蛋白基因序列设计的引物(SEQ ID NO:23))

Pm-R：5'-Biotin-CCAATCTGCTTCCTTGACAAC-3'(SEQ ID NO:24)

(9)沙门菌引物：

Sal-F：5'-caatttacatttcactttcttatc-Spacer18-GTTCGTCATTCCATTACCTACC-3'(小写字母表示F1，为微球连接序列的反向互补核酸序列(SEQ ID NO:25)；大写字母表示F3，为根据各病原具体蛋白基因序列设计的引物(SEQ ID NO:26))

Sal-R：5'-Biotin-CGGCATCGGCTTCAATCA-3'(SEQ ID NO:27)

(10)致病性大肠杆菌引物：CTAAATCACATACTTAACAACAAA

Eco-F：5'-ctaaatcacatacttaacaacaaa-Spacer18-ACGCTCACACCGATACCAT-3'(小写字母表示F1，为微球连接序列的反向互补核酸序列(SEQ ID NO:28)；大写字母表示F3，为根据各病原具体蛋白基因序列设计的引物(SEQ ID NO:29))

Eco-R：5'-Biotin-TATCCAGCCATGCACACTGA-3'(SEQ ID NO:30)

(11)单增李斯特菌引物：

Lis-F：5'-ttaacaacttatacaaacacaaac-Spacer18-CGGCAACCTCGGAGACTTA-3'(小写字母表示F1，为微球连接序列的反向互补核酸序列(SEQ ID NO:31)；大写字母表示F3，为根据各病原具体蛋白基因序列设计的引物(SEQ ID NO:32))

Lis-R：5'-Biotin-CCAAGARATGTTGAATTGAGCA-3'(SEQ ID NO:33)

(12)柔嫩艾美耳球虫引物：

ET-F：5'-aactttctctctctattcttattt-Spacer18-TCGTCTTTGGCTGGCTATTC-3'(小写字母表示F1，为微球连接序列的反向互补核酸序列(SEQ ID NO:34)；大写字母表示F3，为根据各病原具体蛋白基因序列设计的引物(SEQ ID NO:35))

ET-R：5'-Biotin-CAGAGAGTCGCCGTCACAGT-3'(SEQ ID NO:36)

(13)毒害艾美尔球虫引物：

EN-F：5'-ctatcatttatctctttctcaatt-Spacer18-AACGCCGGTATGCCTCGTCG-3'(小写字母表示F1，为微球连接序列的反向互补核酸序列(SEQ ID NO:37)；大写字母表示F3，为根据各病原具体蛋白基因序列设计的引物(SEQ ID NO:38))

EN-R：5'-Biotin-GTACTGGTGCCAACGGAGA-3'(SEQ ID NO:39)

上述引物送上海生工生物工程有限公司合成，引物均经过HPLC纯化，按各自的摩尔数计算，用双蒸水溶解成10μM贮存液备用。采用上述十三种病原的13对引物以提取的病原DNA或反转录的cDNA为模板分别进行PCR扩增，经2％的琼脂凝胶电泳，其结果见图1，其中泳道M为TaKaRa公司生产的Code No.3590DNA Marker；泳道1～13分别对应上方标注的核酸样本。从图1可以看出，各对引物均能扩增出清晰的目的性条带，目的性条带大小均为约100～250bp。

二、荧光标记的MagPlex-Tag微球

根据禽类十三种病原蛋白基因的引物序列与Luminex^TM公司现有MagPlex-Tag荧光微球及其所偶联的核苷酸序列进行比对，挑选如下十三种荧光MagPlex-Tag微球，编号为：14、15、17、22、28、43、44、48、51、53、63、67和72。见表1：

表1：十三种禽类病原病所使用的微球编码及其所偶联的核苷酸序列

实施例2、液态芯片特异性检测

利用本单位保存的RNA病毒高致病性禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和传染性法氏囊病毒分离株的cDNA，DNA病毒传染性喉气管炎病毒、腺病毒和马立克病毒分离株的基因组DNA，病原细菌巴氏杆菌、沙门菌、致病性大肠杆菌和单增李斯特菌分离株的基因组DNA，以及柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美尔球虫分离株的DNA进行了液态芯片技术的特异性检测。

具体操作为：首先采用实施例1所述的引物进行PCR扩增；PCR的扩增体系包括2×TaKaRa Premix Taq^TM 25μL，13对上下游引物浓度分别为0.2μM～1.0μM，本单位保存的RNA病毒cDNA模板1μL，或DNA病毒或细菌或球虫DNA模板1μL，补水至50μL；反应条件为94℃预变性10min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；72℃10min。

所述与微球杂交为：取2.6μL实施例1所述的微球，加入17.4μL的1×杂交缓冲液，混匀；加入5μL的PCR产物；加入70～75μL用1×杂交缓冲液稀释125倍的streptavidin-R-phycoerythrin，37℃孵育30min。

所述仪器分析为：在Luminex ^TM 200仪器上读取荧光中位数MFI值；参与计数的各荧光标记的微球均≥100个，表明用于计数的荧光微球数量有效，所产生的MFI值有效可信；各个荧光标记微球的空白对照的MFI值＜100；根据读数进行结果判定：当样品的MFI值与空白样品的MFI值的比值≥3时结果判为阳性，如果其比值＜2时判为阴性，如果2≤比值＜3时结果判为可疑。

对禽类十三种病原核酸的检测结果显示：本液态芯片技术可分别对高致病性禽流感病毒、新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、马立克病毒、腺病毒、巴氏杆菌、沙门菌、致病性大肠杆菌、单增李斯特菌、以及柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美尔球虫十三种病原有特异性扩增和阳性检出，引物和荧光微球均不存在非特异性的交叉反应(图2)。

实施例3、液态芯片敏感性检测

根据同源分析后选定的13种禽类病原特异检测基因的保守区序列，设计相应的阳性核酸引物，其中扩增两种球虫阳性核酸的引物通用，各引物序列见表2：

表2：各病原阳性标准品扩增的引物及其序列

利用上述引物分别对本单位保存的高致病性禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和传染性法氏囊病毒分离株的cDNA，传染性喉气管炎病毒、腺病毒、马立克病毒、巴氏杆菌、沙门菌、致病性大肠杆菌和单增李斯特菌、以及柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美尔球虫的基因组DNA进行PCR扩增并纯化，获得各基因保守序列，连接入pMD18-T载体，转化至大肠杆菌DH5α中。挑取阳性克隆增菌后提取质粒，通过DNA测序以鉴定插入了目标序列。然后通过测定质粒浓度进行阳性核酸拷贝数的换算，以制备标准品，其浓度至少大于10⁸拷贝/μL。标准品可用于敏感性测定，也可作为阳性对照。

将每种病原标准品10⁸拷贝/μL的质粒分别作10倍梯度稀释，稀释至10拷贝/μL，然后再分别作为模板，按照实施例2中提及的方法进行PCR反应，与特异性荧光标记的MagPlex-Tag微球杂交，并通过在Luminex ^TM200仪器上读取荧光MFI值进行结果判定，以确定每个反应所能检出的最低拷贝数。结果表明当标准品(即阳性核酸)低至10拷贝/μL时，各反应体系均可以检测到有效MFI值，特别是高致病性禽流感病毒、新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、马立克病毒、巴氏杆菌、沙门氏菌、李斯特菌以及两种球虫的阳性核酸在低至单拷贝时，仍可检测到有效MFI值，证明该检测方法具有很高的灵敏度(图3)。

实施例4：运用液相芯片对死亡禽类进行检测

对本单位临床收集的疑似马立克病毒和大肠杆菌混合感染致死的鸡只(A组)，以及新城疫病毒和传染性支气管炎病毒混合感染的鸡只(B组)，利用所构建的液态芯片方法进行致死病原检测。

首先利用TaKaRa公司生产的MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit和Bacterial Genomic DNA Extraction Kit提取两组死亡鸡只肺脏和脾脏组织中的病毒RNA/DNA和细菌基因组DNA，所提取的B组病毒DNA/RNA利用TaKaRa公司生产的PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser进行反转录获得病毒cDNA。然后配制并优化PCR反应体系：2×TaKaRa Premix Taq^TM 25μL，上下游引物浓度分别为0.2μM～1.0μM(此处的引物A组样品可以仅挑选马立克病毒引物和大肠杆菌引物，B组样品可以仅挑选新城疫病毒引物和传染性支气管炎病毒引物，两组样品也可以挑选包括疑似病原在内同时含有其它病原的任意几对引物)，DNA或cDNA模板5μL(此处A组样品提取的病毒DNA和细菌DNA各2.5μL；B组样品反转录后的cDNA 5μL)，补水至50μL。随后按照实施例2中提及的方法进行PCR反应：即94℃预变性10min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；72℃10min。反应结束后，按照实施例2中的方法，将5μL PCR扩增产物与对应的特异性荧光标记的MagPlex-Tag微球杂交，并通过在Luminex ^TM 200仪器上读取荧光MFI值进行结果判定。结果显示，通过所构建的液态芯片方法，在此死亡鸡只肺脏和脾脏组织中均能检测到马立克病毒和大肠杆菌阳性。

可见，所构建的液态芯片方法，可以用于快速、通量、有效地检测死亡禽类样本中的病原，也可根据实际情况对这十三种病原进行自由增减，由于检测具有很好的特异性和敏感性，故任意组合检测时，结果均会可靠。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施仅局限于这些。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国动物卫生与流行病学中心

<120> 一种检测致禽类死亡病原的液态芯片

<160> 52

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tacttcttta ctacaattta caac 24

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagcgattca agtgatcctc tc 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctgccgatay tcttccctca t 21

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caaacaaaca ttcaaatatc aatc 24

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcmgtcaaca tatacacctc at 22

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agagcyacac cgccrataa 19

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caaacaaaca ttcaaatatc aatc 24

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtcaagaagt ggtgaggaag tc 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggaagaggag gaagaggtaa gg 22

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atctcaatta caataacaca caaa 24

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aartcacgct caagttcaag ac 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcattgttcc tctcctcatc tg 22

<210> 13

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aatttcttct ctttctttca caat 24

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agggtcaggg ctaattgtct tt 22

<210> 15

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgtcagttca ctcaggcttc c 21

<210> 16

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cacttaattc attctaaatc tatc 24

<210> 17

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tgttaccgag ccgtgtacc 19

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cccgaataca aggaatcctg tt 22

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tcatcacttt ctttacttta catt 24

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cttctacctc tcgcacacct t 21

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tgatgtcgca ctggctcat 19

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

aatcaacaca caataacatt cata 24

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tgtaaacgaa ctcgccactt t 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ccaatctgct tccttgacaa c 21

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

caatttacat ttcactttct tatc 24

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gttcgtcatt ccattaccta cc 22

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cggcatcggc ttcaatca 18

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ctaaatcaca tacttaacaa caaa 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

acgctcacac cgataccat 19

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

tatccagcca tgcacactga 20

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ttaacaactt atacaaacac aaac 24

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

cggcaacctc ggagactta 19

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ccaagaratg ttgaattgag ca 22

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

aactttctct ctctattctt attt 24

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

tcgtctttgg ctggctattc 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

cagagagtcg ccgtcacagt 20

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

ctatcattta tctctttctc aatt 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

aacgccggta tgcctcgtcg 20

<210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

gtactggtgc caacggaga 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gttgtaaatt gtagtaaaga agta 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gtgtgttatt tgtttgtaaa gtat 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gattgatatt tgaatgtttg tttg 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tttgtgtgtt attgtaattg agat 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

aatttcttct ctttctttca caat 24

<210> 45

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

gatagattta gaatgaatta agtg 24

<210> 46

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aatgtaaagt aaagaaagtg atga 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tatgaatgtt attgtgtgtt gatt 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gataagaaag tgaaatgtaa attg 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tttgttgtta agtatgtgat ttag 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gtttgtgttt gtataagttg ttaa 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aaataagaat agagagagaa agtt 24

<210> 52

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

aattgagaaa gagataaatg atag 24

Claims

1.一种用于检测致禽类死亡的病原的液态芯片，其特征在于，所述的液态芯片包含有检测引物和偶联核苷酸片段的微球，所述的与微球偶联的核苷酸片段能与检测引物中的F1片段互补配对；

所述的检测引物，其上游引物具有F1-F2-F3的序列，其中F1的序列与用于液态芯片结果读取的配伍微球所连接的序列反向互补，F3的序列与待检病原的特异基因序列互补，F2为（CH₂）n间臂，其中n为18；

下游引物为与待检病原的特异基因序列互补的R序列，并在5′端标记生物素；

所述的检测引物包含有：

检测新城疫病毒的引物，上游引物中F1的序列为SEQ ID NO:4，F3的序列为SEQ ID NO:5，下游引物的序列为SEQ ID NO:6；

检测传染性法氏囊病毒的引物：上游引物中F1的序列为SEQ ID NO:13，F3的序列为SEQID NO:14，下游引物的序列为SEQ ID NO:15；

检测马立克病毒的引物：上游引物中F1的序列为SEQ ID NO:16，F3的序列为 SEQ IDNO:17，下游引物的序列为SEQ ID NO:18；

检测腺病毒的引物：上游引物中F1的序列为SEQ ID NO:19，F3的序列为SEQ ID NO:20，下游引物的序列为SEQ ID NO:21；

检测巴氏杆菌的引物：上游引物中F1的序列为SEQ ID NO:22，F3的序列为SEQ ID NO:23，下游引物的序列为SEQ ID NO:24；

检测沙门菌的引物：上游引物中F1的序列为SEQ ID NO:25，F3的序列为SEQ ID NO:26，下游引物的序列为SEQ ID NO:27；

检测致病性大肠杆菌的引物：上游引物中F1的序列为SEQ ID NO:28，F3的序列为SEQID NO:29，下游引物的序列为SEQ ID NO:30；

检测单增李斯特菌的引物：上游引物中F1的序列为SEQ ID NO:31，F3的序列为SEQ IDNO:32，下游引物的序列为SEQ ID NO:33；

检测柔嫩艾美耳球虫的引物：上游引物中F1的序列为SEQ ID NO:34，F3的序列为SEQID NO:35，下游引物的序列为SEQ ID NO:36；

检测毒害艾美尔球虫的引物：上游引物中F1的序列为SEQ ID NO:37，F3的序列为SEQID NO:38，下游引物的序列为SEQ ID NO:39。

2. 如权利要求1所述的液态芯片，其特征在于，所述的与微球偶联的核苷酸片段，其序列为SEQ ID NO:40-52。

3.一种检测禽类病原的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有权利要求1所述的液态芯片。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有PCR反应液、待检测的禽类病原特异基因的质粒DNA阳性对照样品、稀释液和杂交液。