CN106978510A - 一种鸭新型腺病毒Eva Green实时荧光定量PCR检测的引物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鸭新型腺病毒的Eva Green实时荧光定量PCR检测引物，属于动物病毒分子生物学领域。本发明包括特异性引物的设计、标准质粒的构建、实时荧光定量PCR扩增方法的建立和优化，样本DNA提取及结果检测判定。本发明特异性引物检测灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，最低可检测18.4个拷贝，可用于检测临床样本中鸭新型腺病毒的感染及其程度。

Description

一种鸭新型腺病毒Eva Green实时荧光定量PCR检测的引物

技术领域

本发明涉及一种鸭新型腺病毒的Eva Green实时荧光定量PCR检测引物，属于动物病毒分子生物学领域。

背景技术

根据国际病毒分类委员会（ICTV）分类，腺病毒科下设5个属，分别为富AT腺病毒属、禽腺病毒属、鱼腺病毒属、哺乳动物腺病毒属和唾液酸酶病毒属。其中富AT腺病毒属有5个种，分别为牛腺病毒D型、绵羊腺病毒D型、袋鼠腺病毒A型、蛇腺病毒A型和鸭腺病毒A型Duck adenovirus A（也称鸭腺病毒1型，Duck adenovirus 1）（就是经典鸭腺病毒）。

腺病毒(Adenovirus)为线性双链DNA病毒，基因组约35 kb，是家禽和野鸟常见病原，许多腺病毒可以在健康禽体内复制，症状非常轻微，然而有些腺病毒(如火鸡出血性肠炎病毒等)则能够引起较高的发病率和死亡率。近年来，对禽腺病毒的研究主要集中在Ⅰ、Ⅲ亚群禽腺病，但大多数禽腺病毒对禽类的致病作用尚未完全确定。某些种腺病毒株具有肝细胞嗜性，并且能够在特定的情况下导致严重的肝损伤、包涵体肝炎。

鸭新型腺病毒，也称鸭2型腺病毒（duck adenovirus 2，DAd V-2），是区别用经典鸭腺病毒的一种鸭群新型腺病毒，1982年最初由Bouquet等在法国分离得到，2015年陈峰等应用宏基因组学分离、鉴定出国内首株鸭2型腺病毒。该病主要发生在20～30日龄鸭中，以肝和脾肿大、出血为主要特征，死亡率约为7％。目前，国内外对鸭新型腺病毒的研究报道较少，有关该病的病原特性、流行状况、致病性和生物学特性等还不清楚。

实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。荧光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料，非饱和荧光染料的典型代表就是现在最常用的SYBR GreenⅠ；饱和荧光染料有EvaGreen、LC Green等。实时荧光定量过程中一个反应发出的全部荧光信号与出线的双链DNA量呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。当前国内外尚未见利用Eva Green 实时荧光定量PCR检测鸭新型腺病毒的方法相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

发明内容

本发明的目的是填补现有尚未见利用Eva Green 实时荧光定量PCR检测鸭新型腺病毒的方法相关研究报道空白，提供一种鸭新型腺病毒Eva Green实时荧光定量PCR检测的引物和方法。该方法灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，最低可检测18.4个拷贝，可用于对临床样本中鸭新型腺病毒的分子流行病学调查及其感染程度分析，为明确鸭新型腺病毒的分子流行病学特点及其致病机理提供检测方法和手段。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种鸭新型腺病毒Eva Green实时荧光定量PCR检测的引物，所述引物序列如下：

上游引物：5’- CGTTCCACATTCAAGTTC -3’，

下游引物：5’- GTACCCATTCGTAAGTGTA -3’。

其目的扩增片段为84 bp。

所述的引物用于鸭新型腺病毒的Eva Green实时荧光定量PCR检测方法为：

（1）定量标准质粒的构建与制备

以提取的鸭新型腺病毒核酸DNA为模板，用上游引物（引物序列为：5’-ACGATTCTGGAGTATGTTCTGGTA -3’）和下游引物（引物序列为：5’-CTGCAAAACCATATTGGGATCCTT -3’）进行PCR扩增含有靶序列的基因片段（目的片段大小为779bp）。

使用PCR扩增试剂（2×PCR Master MIX）推荐的50 μL体系进行扩增，其中2×PCRMaster Mix反应液 25 μL、上下游引物（引物浓度为10 μmol·L^-1）各1 μL、提取的核酸模板DNA 2 μL，补充灭菌去离子水21μL至终反应体系50 μL。混匀后进行PCR扩增，扩增条件为95℃预变性5 min后进入循环，94 ℃变性50 s 、53 ℃退火30s、72 ℃延伸50 s，35个循环结束后，72℃终延伸10 min。

反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定，利用Universal DNA 纯化回收试剂盒将符合实验扩增预期的目的条带割胶回收，利用克隆载体（pEASY-T1 Simple CloningKit）将胶回收片段进行克隆。转化DH5a克隆感受态细胞后涂布平板过夜，随机挑取12份单菌落，摇菌14h后，提取相应的质粒，进行双酶切鉴定符合预期后，送由上海博尚生物技术有限公司进行序列测定，序列测定结果经BLAST分析明确其为鸭新型腺病毒序列，将该阳性重组质粒作为阳性标准质粒。

(2)提取的待检样品核酸DNA，与标准质粒按照以下实时荧光定量PCR反应体系和程序进行扩增：

用紫外分光光度计测定阳性标准品于微量核酸测定仪260 nm处光吸收值（A260），计算DNA拷贝数，随后将标准阳性样本进行连续10倍系列稀释，以拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标建立标准曲线。

Eva Green实时荧光定量PCR检测方法优化出的20 μL 最佳反应体系为：EvaGreen 混合液10 μL、上、下游引物（10 μmol/L）各0.3 μL、模板2 μL、水补足至20 μL。最佳反应条件为：95 ℃ 2 min预变性；95℃ 10 s、58℃ 15 s，共40个循环，循环结束后，做出熔解曲线。

提取的待检样品的结果判定，当待测样品实时荧光定量PCR检测结果又“S”型扩增曲线，Ct值＜35，且从熔解曲线分析可见，在Tm=（79.23±0.24）℃出现单一的特异性峰，无引物二聚体及非特异性产物，即可判定待检样品为鸭新型腺病毒感染阳性。

有益效果：

本发明采用Eva Green实时荧光定量PCR方法进行鸭新型腺病毒检测，具有以下优点和效果：

1、检测快速、高效：该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，反应结束后即可通过和实时荧光定量PCR机器自带的进行结果判定。从核酸提取到结果判定仅需2.5h，且一次可以同时进行96个样品检测。对临床收集的85份鸭病料进行检测后发现，检测到2份鸭新型腺病毒感染阳性。

2、定量准确：通过制备标准品、绘制标准曲线，可根据检测待检样品中鸭新型腺病毒的Ct值，可直接对其感染鸭新型腺病毒进行准确定量。

3、灵敏度高：最低可检测18.4个拷贝，较常规PCR检测灵敏度提高100倍。

4、特异性强：和鸭群中的常见传染病如鸭大肠杆菌病、鸭传染性浆膜炎、鸭巴氏杆菌病、鸭病毒性肠病毒、番鸭呼肠孤病毒、水禽细小病毒和经典鸭腺病毒均无反应信号，仅对鸭新型腺病毒检测出现单一的特异性峰，无引物二聚体及非特异性产物。

5、重复性好：Eva Green实时荧光定量PCR方法进行鸭新型腺病毒检测的组内变异系数为0.33-1.41%，组间变异系数0.43-1.88%，表明建立的Eva Green实时荧光定量PCR方法重复性好。

附图说明

图1 Eva Green实时荧光定量检测鸭新型腺病毒的PCR方法的扩增曲线。

图2 Eva Green实时荧光定量检测鸭新型腺病毒的PCR方法的标准曲线。

图3 Eva Green实时荧光定量检测鸭新型腺病毒的PCR方法的特异性。

具体实施方式

下面实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1

1、引物设计与合成

参考鸭新型腺病毒（GenBank登录号NC_024486）的Hexon基因特征，设计Eva Green实时荧光定量检测鸭新型腺病毒的PCR方法的特异性引物F1和R1，其中F1和R1引物序列为：

上游引物F1：5’- CGTTCCACATTCAAGTTC -3’，

下游引物R1：5’- GTACCCATTCGTAAGTGTA -3’。

其目的扩增片段为84 bp。

1、标准品的构建

以常规方法提取鸭新型腺病毒基因组DNA。设计跨过Eva Green实时荧光定量检测鸭新型腺病毒的PCR方法的特异性引物F1和R1的区域的用于制备标准品质粒的引物（DAV2-F2和DAV2-R2），其上游引物DAV2-F2（引物序列为：5’-ACGATTCTGGAGTATGTTCTGGTA -3’）和下游引物DAV2-R2（引物序列为：5’-CTGCAAAACCATATTGGGATCCTT -3’）进行PCR扩增含有靶序列的基因片段（目的片段大小为779bp）。使用PCR扩增试剂（2×PCR Master MIX）推荐的50μL体系进行扩增，其中2×PCR Master Mix反应液 25 μL、上下游引物（DAV2-F2和DAV2-R2）（引物浓度为10 μmol·L^-1）各1 μL、提取的核酸模板DNA 2 μL，补充灭菌去离子水21μL至终反应体系50 μL。混匀后进行PCR扩增，扩增条件为95 ℃预变性5 min后进入循环，94 ℃变性50 s 、53 ℃退火30s、72 ℃延伸50s，35个循环结束后，72℃终延伸10 min。反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定，利用Universal DNA 纯化回收试剂盒将符合实验扩增预期的目的条带割胶回收，利用克隆载体（pEASY-T1 Simple Cloning Kit）将胶回收片段进行克隆。转化DH5a克隆感受态细胞后涂布平板过夜，随机挑取12份单菌落，摇菌14h后，提取相应的质粒，进行双酶切鉴定符合预期后，送由上海博尚生物技术有限公司进行序列测定，将序列测定结果经BLAST分析明确其为鸭新型腺病毒序列，将该阳性重组质粒作为标准质粒。

3、实时荧光定量PCR反应

优化出的20 μL 最佳反应体系为：Eva Green 混合液10 μL、上、下游引物（10 μmol/L）各0.3 μL、模板2 μL、水补足至20 μL。最佳反应条件为：95 ℃ 2 min预变性；95℃ 10 s、58℃ 15 s，共40个循环，循环结束后，做出熔解曲线。

4、 实时荧光定量PCR标准曲线

对阳性标准品的扩增曲线和标准曲线显示，实时荧光定量PCR对鸭新型腺病毒最低检测限为1.84×10¹拷贝/反应， 并且在1.84×10¹~1.84×10⁷拷贝/反应范围内有很好的线性关系，相关系数为0.999，扩增效率为99.9%。

4、实时荧光定量PCR溶解曲线

实时荧光定量PCR反应结束后，观察扩增曲线，判断建立的方法有无特异性扩增（没有扩增曲线，溶解曲线的检测结果没有意义）。实时荧光定量PCR反应结束后做出的溶解曲线，直接在和实时荧光定量PCR仪器连接的电脑上软件进行分析，可直接对鸭新型腺病毒感染情况进行判断，判断方法为：

若在Tm=（79.23±0.24）℃出现单一的特异性峰判为鸭新型腺病毒阳性；其他情况均判为阴性。

5、特异性检测

和鸭群中的常见传染病如鸭大肠杆菌病、鸭传染性浆膜炎、鸭巴氏杆菌病、鸭病毒性肠病毒、番鸭呼肠孤病毒、水禽细小病毒和经典鸭腺病毒均无荧光反应信号，仅对鸭新型腺病毒检测出现单一的特异性峰，无引物二聚体及非特异性产物。

6、重复性试验

Eva Green实时荧光定量检测鸭新型腺病毒的PCR方法检测标准阳性样品的组内变异系数为0.33-1.41%，组间变异系数0.43-1.88%（结果见表1），表明建立的Eva Green实时荧光定量PCR方法重复性好。

表1实时荧光定量PCR变异系数

7、临床应用

使用建立的Eva Green实时荧光定量检测鸭新型腺病毒的PCR方法对临床收集的85份鸭病料进行检测后发现，检测到2份鸭新型腺病毒感染阳性，阳性率为2.35%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种鸭新型腺病毒Eva Green实时荧光定量PCR检测的引物

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgttccacat tcaagttc 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtacccattc gtaagtgta 19

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acgattctgg agtatgttct ggta 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctgcaaaacc atattgggat cctt 24

Claims (1)

1.一种鸭新型腺病毒的Eva Green实时荧光定量PCR检测引物，其特征在于，所述引物序列如下：

上游引物：5’- CGTTCCACATTCAAGTTC -3’，

下游引物：5’- GTACCCATTCGTAAGTGTA -3’；

其目的扩增片段为84 bp。