CN112538543B - 用于检测沙门氏菌属的特异性引物及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测沙门氏菌属的特异性引物及其试剂盒，属于致病菌检测技术领域。本发明从沙门氏菌基因组中发现了一段549bp长度的STM1410基因序列，该基因序列与获取的570个沙门氏菌种属基因组均有高度的同源性，与非沙门氏菌基因组没有同源序列，可以作为靶标用于沙门氏菌属的单基因PCR检测以及沙门氏菌的鉴定。以STM1410基因序列作为靶标，本发明还设计了一组特异性引物，采用本发明的特异性引物可以实现对沙门氏菌属的特异性、高灵敏性检测，能够满足兽医公共卫生以及食品安全等领域对沙门氏菌的快速检测要求。

Description

用于检测沙门氏菌属的特异性引物及其试剂盒
技术领域
本发明涉及致病菌检测技术领域，具体涉及用于检测沙门氏菌属的特异性引物及其试剂盒。
背景技术
沙门氏菌(Salmonella)是一类对人和畜禽健康构成极大危害的革兰氏阴性致病菌，分布广泛，血清型繁多，目前已检出沙门氏菌血清型2500余种，我国已有292个血清型报道(彭海滨，2006)。根据不同血清型共有的遗传相似性，将沙门氏菌分为两个种类：邦氏沙门氏菌(Salmonella bongori)和肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)，共有2500多个血清型，肠炎沙门氏菌占致病性沙门氏菌血清型的90％以上(Liu等，2018)。
沙门氏菌是造成人畜共患的胞内寄生菌，存在于人类、各种动物以及环境中，可引起感染并导致不同的疾病。沙门氏菌病是最常见和广泛分布的食源性疾病之一，由沙门氏菌引起，感染者通过使用受污染的生肉、家禽、蛋、乳制品等或者由于与感染或携带者个体的密切接触而感染。沙门氏菌每年都给畜禽养殖业和食品加工等行业造成重大的经济损失，引发各类公共卫生问题。
在我国，沙门氏菌病已成为危害畜禽和人类的主要细菌病之一。对沙门氏菌属的快速准确的检测是净化和防治沙门氏菌病的关键一步。传统的沙门氏菌分离鉴定方法主要包括预增菌，选择性增菌，选择性培养，PCR验证等流程进行，整个鉴定过程相对复杂，耗时费力。
PCR作为病原检测的一种方法，表现出巨大的应用潜力，具有快速、灵敏、特异等优点。但研究发现，已有的沙门氏菌的单基因PCR检测存在一些缺陷，包括某些沙门氏菌菌株中不存在特定的靶基因，导致假阴性结果。一些研究报告说，某些肠炎沙门氏菌(S.enterica)血清型中不存在invA。例如，肠炎沙门氏菌亚种Saintpaul。即基于invA的PCR检测，未检测到肠炎沙门氏菌Saintpaul血清型(Cohen等，1996；Malorny等，2004)。拉恩等(1992)还发现沙门氏菌血清型，沙门氏菌Senftenberg血清型也不能用invA基因扩增鉴定。此外，在Aabo等(1993)的研究中发现，在PCR分析中靶向fimA基因时，除两株血清型为亚利桑那(Arizonae)的沙门氏菌外，所有被测试的沙门氏菌均能成功鉴定。Moore和Feist(2007)开发了针对stn基因的
Figure BDA0002839423420000011
RT-PCR，并成功检测出267株肠炎沙门氏菌和邦戈沙门氏菌。但是，三株金黄色柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)获得了假阳性结果，这降低了测定的特异性。造成以上缺陷的根本原因主要是选择的PCR检测目标基因种属特异性不强，不能保证所有常见沙门氏菌均具有。
综上所述，已有研究还未能找到所有沙门氏菌菌株都携带的共有基因，降低了这种单重沙门氏菌检测PCR分析的检测准确性，难以实现对沙门氏菌属的特异性检测。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供用于检测沙门氏菌属的特异性引物及其试剂盒。采用本发明的特异性引物及其试剂盒可以实现对沙门氏菌属的特异、灵敏检测，能够满足兽医公共卫生以及食品安全等领域对沙门氏菌的快速检测要求。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供沙门氏菌STM1410基因作为靶标在如下(1)或(2)中的应用：
(1)沙门氏菌属单基因检测；
(2)沙门氏菌鉴定；
所述沙门氏菌STM1410基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
上述应用中，所述沙门氏菌属单基因检测包括：常规PCR、实时荧光定量PCR和/或环介导等温扩增LAMP。
本发明的第二方面，提供用于检测沙门氏菌属的特异性引物，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；具体如下：
STM1410-idF：5’-AGTTGGATCGTCTTCTTGAC-3’；(SEQ ID NO.2)
STM1410-idR：5’-CTCGGTAAGAGAAGTCTTCG-3’。(SEQ ID NO.3)
本发明的第三方面，提供上述特异性引物在制备检测沙门氏菌属的试剂或试剂盒中的应用。
本发明的第四方面，提供含有上述特异性引物的PCR检测试剂盒。
进一步的，所述PCR检测试剂盒中还包括：PCR扩增缓冲体系、阳性对照和阴性对照。
优选的，所述PCR扩增缓冲体系为2×Es Taq Master Mix。该PCR扩增缓冲体系具有扩增效率高、错配率低的优良性能，整个反应体系非常稳定，并能最大限度的减少认为误差和污染。
优选的，所述阳性对照为沙门氏菌菌属菌株基因组DNA或是含有SEQ ID NO.1所示序列的载体；所述阴性对照为无菌ddH2O。
本发明的第五方面，提供一种利用上述PCR检测试剂盒检测沙门氏菌属的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样品的基因组DNA，利用上述PCR检测试剂盒进行PCR扩增；
(2)将步骤(1)中PCR扩增后的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若待测样品的PCR扩增产物在410bp位置出现单一电泳条带，则说明待测样品中含有沙门氏菌属细菌；若待测样品的PCR扩增产物没有出现相应的单一电泳条带，则说明待测样品中不含有沙门氏菌属细菌。
优选的，步骤(1)中，采用20μL反应体系进行PCR扩增，所述20μL反应体系包括：2xEs Taq Master Mix 10μL、10μM的SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物各0.5μL、模板溶液1μL，最后用灭菌的ddH2O补足到20μL。
优选的，步骤(1)中，PCR扩增的反应程序为：先94℃预变性5min，之后开始扩增循环，每个循环的程序为：94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环共35个，循环结束后，72℃延伸7min，降温至4℃，结束。
本发明的有益效果：
(1)本发明从沙门氏菌基因组中发现了一段549bp长度的STM1410基因序列，该基因序列与获取的570个沙门氏菌种属基因组均有高度的同源性，与非沙门氏菌基因组没有同源序列，可以作为靶标用于沙门氏菌属的单基因PCR检测以及沙门氏菌的鉴定。
(2)以STM1410基因序列作为靶标，本发明还设计了一组特异性引物，采用本发明的特异性引物可以实现对沙门氏菌属的特异性、高灵敏性检测。
附图说明
图1：本发明的沙门氏菌属STM1410基因特异性检测结果；图中，M：DL2000 DNAMarker，1：鼠伤寒沙门氏菌CVCC541,2：鼠伤寒沙门氏菌CVCC2229，3：猪霍乱沙门氏菌CIVC21493，4：甲副伤寒沙门氏菌CMCCB50001，5：乙副伤寒沙门氏菌CMCCB50094，6：丙副伤寒沙门氏菌CICC21512，7：阿贡纳沙门氏菌CICC21586，8：都柏林沙门氏菌CICC21497，9：波茨坦沙门氏菌CICC21500，10：山夫登堡沙门氏菌CICC21502，11：火鸡沙门氏菌CICC21501，12：阿伯丁沙门氏菌CICC21492，13：鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028，14：鸡白痢沙门氏菌CVCC526，15：肠炎沙门氏菌CVCC3377，16：金黄色葡萄球菌，17：粪肠球菌，18：肺炎克雷伯菌，19：绿脓杆菌，20：大肠杆菌。N：阴性对照。
图2：以鼠伤寒沙门氏菌基因组为标准，模拟进行的沙门氏菌灵敏度评价试验检测结果；其中，M：DL2000DNA Marker，1-17分别对应模板浓度100ng/μL、10ng/μL、5ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、50pg/μL、25pg/μL、5pg/μL、1pg/μL、500fg/μL、100fg/μL、50fg/μL、40fg/μL、30fg/μL、20fg/μL、10fg/μL、0fg/μL。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分所介绍的，沙门氏菌分布广泛，血清型种类繁多，现有的沙门氏菌单基因PCR检测方法，由于选择的PCR检测目标基因种属特异性不强，不能保证所有常见的沙门氏菌均具有，导致出现假阴性的检测结果；此外，所选择的PCR检测目标基因还可能与非沙门氏菌基因组有一定的同源序列，会导致出现假阳性的检测结果。
因此，现有技术还难以实现通过单基因PCR的方法对沙门氏菌属中所有常见的沙门氏菌进行准确检测，容易出现假阴性或假阳性的检测结果。
基于此，为获得种属特异性强的目标基因，本发明对沙门氏菌属的基因组进行了生物信息学分析和深入研究，最终确定沙门氏菌基因组中一段549bp长度的STM1410基因序列(SEQ ID NO.1)作为沙门氏菌属的特征基因。
为验证该特征基因的种属特异性，本发明基于GenBank中Nucleotide collection(nr/nt)数据库，通过blastn本地比对软件分析发现，SEQ ID NO.1所示的STM1410基因在获取的共570个沙门氏菌种属基因组均有高度同源序列，其中313个同源性100％，174个同源性99％，72个同源性98％，11个同源性91-97％。用invA基因和fimA基因序列分别不能鉴定的Saintpaul、Senftenberg和Arizonae血清型中也均含有STM1410同源序列，其中，SEQ IDNO.1所示的STM1410基因序列与Saintpaul血清型菌株同源性高达99.818％、与Senftenberg血清型菌株同源性高达98.543％，与Arizonae血清型菌株同源性高达91.758％。
基于GenBank Nucleotide collection(nr/nt)数据库，本发明还选用在线blastn比对分析，条件设定数据库排除物种Salmonella(taxid:590)时，搜索结果为零，即没有相似的其他物种序列。即基于在线数据库，与所有非沙门氏菌基因组比对，没有同源序列，即理论上不会有假阳性扩增结果。
根据GenBank全库序列比对分析结果，沙门氏菌STM1410基因(SEQ ID NO.1所示)属于沙门氏菌种属中特有的基因组序列，高度保守，所有沙门氏菌序列同源性均大于91％；而且与非沙门氏菌基因组相比无同源序列，因此可以选用STM1410基因(SEQ ID NO.1所示)序列作为目标序列，用于沙门氏菌种属单基因PCR检测。基于STM1410基因序列(SEQ IDNO.1所示)在沙门氏菌属中的高度保守性，可以开发基于检测沙门氏菌基因组DNA作为检测底物的系列沙门氏菌鉴定方法，比如PCR、实时荧光定量PCR和环介导等温扩增LAMP等方法。
以STM1410基因序列作为靶标，本发明还设计了一组特异性引物，采用本发明的特异性引物可以实现对沙门氏菌属的特异性、高灵敏性检测。
本发明在试验过程中还优化了PCR条件，在试剂盒的临床应用中最大限度减少操作，既保证灵敏度，又最大限度降低各种污染，确保结果的科学、精确。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：细菌基因组试剂盒购自湖南艾科瑞生物工程有限公司，2×Es Taq Master Mix购自北京康为世纪生物科技有限公司，DL2000 DNA Marker购自上海捷瑞生物工程有限公司。
本发明实施例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件，如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；或者按照制造厂商建议的条件。
实施例1：沙门氏菌属特征基因的种属特异性验证
在GenBank中对STM1410基因进行生物信息学分析，最终确定STM1410基因(SEQ IDNO.1所示)为沙门氏菌属的特征基因。
GenBank选用blastn本地比对软件分析STM1410基因(SEQ ID NO.1所示)，应用Nucleotide collection(nr/nt)数据库本地比对，共获取570个沙门氏菌种属基因组比对结果，313个同源性100％，174个同源性99％，72个同源性98％，11个同源性91-97％(表1所示)。
表1：同源性比对结果
Figure BDA0002839423420000051
Figure BDA0002839423420000061
Figure BDA0002839423420000071
Figure BDA0002839423420000081
Figure BDA0002839423420000091
Figure BDA0002839423420000101
Figure BDA0002839423420000111
Figure BDA0002839423420000121
Figure BDA0002839423420000131
Figure BDA0002839423420000141
Figure BDA0002839423420000151
Figure BDA0002839423420000161
Figure BDA0002839423420000171
GenBank选用在线blastn，应用Nucleotide collection(nr/nt)数据库在线比对分析，当数据库排除物种Salmonella(taxid:590)时，搜索结果为零，即没有相似的其他物种序列。
依据GenBank全库序列比对分析结果，沙门氏菌STM1410基因(SEQ ID NO.1所示)属于沙门氏菌种属中特有的基因组序列，高度保守，所有沙门氏菌序列同源性均大于91％，因此可以选用STM1410基因(SEQ ID NO.1所示)序列作为鉴定沙门氏菌的目标序列。
实施例2：引物设计
根据STM1410基因，设计特异性引物。该基因序列549bp在沙门氏菌种属中高度保守，引物可以基于这个序列长度进行设计。原则上扩增全长549bp也可以，但考虑到需要选择序列上适合引物设计的位置减少引物错配、发卡结构及引物二聚体，以及选择长度适中、控制整个PCR扩增反应的时长；且大小适合下游核酸电泳鉴定区分，避免引物二聚体(大小<100bp左右)可能造成的干扰。因此本发明优化了引物设计条件，优化设计的引物由上海生工公司合成，引物序列如下：
STM1410-idF：5’-AGTTGGATCGTCTTCTTGAC-3’；(SEQ ID NO.2)
STM1410-idR：5’-CTCGGTAAGAGAAGTCTTCG-3’。(SEQ ID NO.3)
实施例3：试剂盒的组成及特异性、灵敏度考察
1.试剂盒的组成：
本实施例的试剂盒为单基因PCR检测试剂盒，用于检测沙门氏菌属。试剂盒中含有：实施例2设计的SEQ ID NO.2所示的上游引物(10μM)和SEQ ID NO.3所示下游引物(10μM)，2xEs Taq Master Mix、阳性对照和阴性对照；其中，阳性对照为沙门氏菌菌株的基因组DNA或者是含有SEQ ID NO.1所示序列的载体，所述的阴性对照为无菌的ddH2O。
试剂盒的使用方法为：
步骤一，提取待测样品的基因组DNA，使用所述的试剂盒进行PCR扩增；
步骤二，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，判断样品中是否有沙门氏菌属，所述判断具体为：如果样品组电泳结果在410bp位置出现单一的扩增条带，而阴性对照组在相应位置没有出现，则说明样品中含有沙门氏菌；如果样品组没有出现相应的单一扩增条带，阴性对照组在相应位置也没有出现，则样品中不含有沙门氏菌。
其中，步骤一中所述PCR扩增所采用的检测体系为20μL反应体系，包括：2xEs TaqMaster Mix 10μL，10μM的上下游引物各0.5μL，模板溶液1μL，最后用灭菌的ddH2O补足到20μL。
步骤一中所述PCR扩增所采用的扩增程序为：先94℃预变性5min，之后开始扩增循环，每个循环的程序为：94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环共35个，循环结束后，72℃延伸7min，降温至4℃，结束。
2.试剂盒的特异性考察：
2.1实验用菌株：
实验菌株见表2，其中5株非沙门氏菌菌株为临床常见的致病菌，由山东农业大学人畜共患细菌病实验室分离得到。
表2：实验菌株
Figure BDA0002839423420000181
Figure BDA0002839423420000191
注：c：本实验室保存。
2.2实验方法：
(1)DNA模板制备：
将表2所列出的细菌菌株划线复苏，挑取单菌落于5ml LB肉汤中，37℃，220rpm过夜培养，之后按照细菌基因组提取试剂盒说明书步骤提取细菌基因组DNA，-20℃保存备用。
(2)PCR检测方法特异性评价：
PCR检测方法如下，配制如下反应体系：2×Es Taq Master Mix 10μL，上下游引物浓度10μM，各加入0.5μL，模板1μL，以无菌ddH2O作为模板作为反映的阴性对照，加入灭菌的ddH2O补足20μL，混匀。然后按照以下PCR循环参数进行扩增：先94℃预变性5min，接着作35个循环，每个循环的程序包括94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环结束后在72℃延伸7min，最后降温至4℃，PCR反映结束。反应产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条件为120V电压，150mA电流。
2.3实验结果：
图1显示了所用菌株的检测结果，对鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌和肠炎沙门氏菌等各种血清型的沙门氏菌都可以扩增出特异的条带，但是对其他5株常见的非沙门氏菌属致病菌的扩增结果均为阴性。结果表明本发明设计的引物及试剂盒扩增沙门氏菌属时具有良好的特异性。
3.试剂盒的灵敏度考察：
3.1实验方法：
步骤一：测定鼠伤寒沙门氏菌基因组的浓度，单位ng/μL。按照比例，用无菌ddH2O稀释一定的倍数，分别制成以下浓度的模板：100ng/μL、10ng/μL、5ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、50pg/μL、25pg/μL、5pg/μL、1pg/μL、500fg/μL、100fg/μL、50fg/μL、40fg/μL、30fg/μL、20fg/μL、10fg/μL、0fg/μL。并且计算出每种浓度下每μL模板含有的基因组拷贝数。
步骤二：按照上述PCR体系配制PCR反应体系，进行PCR反应，以及琼脂糖凝胶电泳。
3.2实验结果：
图2显示检测沙门氏菌灵敏度实验结果。结果显示，可以检测到沙门氏菌最小模板质量为500fg，约90个基因组拷贝数。模板数更低浓度时，PCR扩增结果为阴性，表示本发明的PCR方法在检测沙门氏菌中具有良好的灵敏度。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东农业大学
<120> 用于检测沙门氏菌属的特异性引物及其试剂盒
<130> 2020
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 549
<212> DNA
<213> STM1410
<400> 1
gtgttgcaac tttatcgtta tttctggcaa cctgctcgtt acgctgtacc ggaatggctg 60
gataagctgg gctttcatct ttcaaactgc tggcgttatg gcgatcggcc cgagttggat 120
cgtcttcttg acagagcgtt aaatagacta agaggaagct ctgttattcc agcctgttta 180
aatgacaggc aaaaacggca ggttcgtctt gcgccgcgta tatcggcatt tgcctttggg 240
ctgggattat tcaaactcag gtgtagtgac tattttatgc taccagagta tcggcaattg 300
cttctacagt ggtttagcga ggatgagatc tggcagctat atggttggtt ggggcaaaga 360
gatggcaaat tacttcctcc gcaagtgatg caacaaactg cattgcagat cggtaccgcc 420
attcttaatc gggaagcgca tgacgatgcg gttttacatg cgctattagt attattaccc 480
cctccgcagc gtatactttg gccgaagact tctcttaccg agattatctt catggagcat 540
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ctcggtaaga gaagtcttcg 20

Claims (4)

1.特异性引物在制备检测沙门氏菌属的试剂盒中的应用；所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中包括：PCR扩增缓冲体系、阳性对照和阴性对照。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述阳性对照为沙门氏菌菌属菌株基因组DNA或是含有SEQ ID NO.1所示序列的载体；所述阴性对照为无菌ddH2O。
4.特异性引物在制备检测沙门氏菌属的试剂中的应用；所述特异性引物的序列如SEQID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
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