CN101886133B - 空肠弯曲菌的实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种空肠弯曲菌的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。所述引物和TaqMan探针，是根据空肠弯曲菌鞭毛蛋白A(flaA)基因保守区域的保守区域设计的，用以定量检测临床病人粪便样本、猴、犬粪便样本以及小型猪回盲部内容物样本中空肠弯曲菌的核酸拷贝数，上游引物序列SEQ ID NO：1，下游引物序列SEQ ID NO：2；TaqMan探针序列SEQ ID NO：3。本发明对控制人和动物源性相关生物制品的质量及进出口动物检验检疫领域中有具有较大的实际意义，能够保证相关生物制品的质量。本发明的检测方法及试剂盒可用于弯曲菌病的诊断及生物制品的空肠弯曲菌检定，应用前景广阔。

Description

空肠弯曲菌的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域中细菌的分子生物学检测方法，特别是涉及空肠弯曲菌的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。

背景技术

弯曲菌病(Campylobacteriosis)是由弯曲菌(Campylobacter)引起的人兽共患传染病。有致病性的弯曲菌有3种，即空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、结肠弯曲菌(Campylobacter coli)和胎儿弯曲菌(Campylobacter fetus)。以空肠弯曲菌危害最大。自1972年Dekeyser等首次从腹泻病人粪便中分离出空肠弯曲菌以来，迄今世界各地都证实空肠弯曲菌为人类急性胃肠炎最重要的病原菌之一(ButzlerJP，Dereume JP，Barbier P，et al.Digestive origin of Campylobacter septicemias.Nouv Presse Med.1977，6(12)：1033-1035.)。在一些发达国家，由空肠弯曲菌引起的腹泻已超过沙门氏菌和志贺氏菌。在发展中国家，空肠弯曲菌是儿童腹泻死亡的重要病原。许多家禽、家畜和野生动物为该菌宿主(带菌率为50％～90％不等)，人类主要通过饮用被污染的水源、乳制品及食物或与动物直接接触而感染，感染后可引起流产、死胎、菌血症、脑膜炎、胆囊炎、心内膜炎、反应性关节炎、莱特尔综合征、格-巴氏综合征等(Workman SN，Mathison GE，Lavoie MC.Pet dogs and chicken meatas reservoirs of Campylobacter spp.in Barbados.J Clin Microbiol，2005，43(6)：2642-2650.Broman T，Palmgren H，Bergstrom S，et al.Campylobacter jejuniin black-headed gulls(Larus ridibundus)：prevalence，genotypes，andinfluence on C.jejuni epidemiology.J Clin Microbiol，2002，40(12)：4594-4602.Meyer A，Stallmach T，Goldenberger D，et al.Lethal maternal sepsiscaused by Campylobacter jejuni：pathogen preserved in placenta and identifiedby molecular methods.Mod pathol，1997，10(12)：1253-12568.Dingle KE，VanDen Braak N，Colles FM，et al.Sequence typing confirms that Campylobacterjejuni strains associated with Guillain-Barre and Miller-Fisher syndromes areof diverse genetic lineage，serotype，and flagella type.J Clin Microbiol，2001，39(9)：3346-3349.Hannu T，Kauppi M，Tuomala M，et al.Reactive arthritisfollowing an outbreak of Campylobacter jejuni infection.J Rheumatol，2004，31(3)：528-530.)。

空肠弯曲菌为革兰氏染色阴性、无芽孢、弯曲或螺旋样小杆菌，大小约为(0.2～0.5)μm×(0.5～8.0)μm。两端尖细，菌体呈弧形、S形或海鸥展翅形，菌体一端或两端有较菌体长2～3倍的单根鞭毛，呈螺旋状或投掷标枪样的运动。在陈旧培养基中放置时间过长或培养环境不适时，则变成球状菌，失去动力和生长能力。空肠弯曲菌为微需氧菌(5％氧气，10％二氧化碳，85％氮气)，最佳生长温度为42℃，在25℃不生长。不氧化或发酵碳水化合物，从氨基酸循环中间产物而不从碳水化合物获得能量。抵抗力不强，对热敏感60℃ 5min即可灭活。经紫外线照射5min也能使该菌致死(方喜业，邢瑞昌，贺争鸣，主编.实验动物质量控制.中国标准出版社.2008，346-414.)。

通过前期大量流行病学调查及监测数据分析，高正琴等已经发现在中国动物中存在不同程度的空肠弯曲菌的感染(高正琴，贺争鸣，岳秉飞，等.中国小型猪细菌分离鉴定及药敏试验.中国人兽共患病学报.2010，26(1)：46-52.高正琴，贺争鸣，张强，等.中国小型猪空肠弯曲菌的首次分离及其鉴定.中国比较医学杂志.2009，19(11)：47-50.)。

虽然，常规细菌学方法可以检出空肠弯曲菌，得出确定性诊断结论，但该菌所需分离培养条件要求苛刻，需要几个月的时间才能完成全部鉴定，不能满足快速检测的要求。此外，使空肠弯曲菌从其他弯曲菌的种区别开来的主要试验是马尿酸钠盐水解试验。在42℃下、用选择性培养基分离培养到的菌株，氧化酶阳性，具有显微镜下的形态学特征，并且马尿酸水解试验阳性，即可确定为空肠弯曲菌。在特定的时空下，有些空肠弯曲菌菌株并不分泌马尿酸酶，生化鉴定时马尿酸水解试验呈阴性，这样势必会造成这些空肠弯曲菌菌株的漏检。随着免疫学技术的不断成熟和发展，出现了血清凝集反应、免疫电泳、补体结合试验、免疫荧光、酶联免疫吸附试验、放射免疫分析方法等诊断方法。但所有这些方法均不能严格区分疫苗免疫和野毒株自然感染诱导的血清学反应，易出现假阳性和假阴性，使这些方法的应用受到限制。

1985年，美国Cetus公司和加利福尼亚大学联合创建了一种核酸体外扩增技术-聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，它的原理类似于DNA的体内复制。不久，PE-Cetus公司推出了第一台PCR热循环仪，使PCR技术的自动化成为现实。由于PCR技术具有的高度敏感性、特异性以及操作简便、适用样品的广泛性，所以它及其相关技术的发展速度惊人，并广泛应用于众多领域。

2006年，高正琴等人建立了空肠弯曲菌套式PCR检测方法，用于动物源性样本的检测，显示出良好的特异性和敏感性，对保证相关生物制品的安全具有重要意义(高正琴，张强，邢进，等.空肠弯曲菌套式PCR检测方法的建立及初步应用.中国比较医学杂志.2006，16(12)：727-730.)。

随着社会的发展、科技的进步、人们健康期望值的增高，由空肠弯曲菌引起的弯曲菌病的防制已愈来愈受到重视。为了做好弯曲菌病的诊断、疫情监测、流行病学调查，控制弯曲菌病的流行，优良的检测技术是防制的先决条件。传染性疾病中实时荧光定量PCR技术作为病原体检测的新技术，实现了对病原体由定性到定量的检测，目前已广泛应用于感染性疾病的诊断和其他分子生物学研究领域，开辟了细菌性疾病及细菌污染物早期诊断和检测的新途径(Nonnenmacher C，Dalpke A，Rochon J，Flores-de-Jacoby L，Mutters R，Heeq K.Real-Time polymerase chain reactionfor detection and quantification of bacteria in periodontal patients.JPeriodontol，2005，9(76)：1542-1549.)。

1996年，由Heid等建立的实时定量PCR是一种新的核酸绝对定量技术。在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR过程，是定量检测基因表达最灵敏、最可靠的方法(Heid CA，Stevens J，Livak KJ，et al.Real timequantitative PCR.Genome Res.1996，6(10)：985-994.)。

实时荧光定量PCR技术的基本原理是，PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告基因和一个淬灭荧光。当探针完整时，报告基因发射的荧光信号被淬灭基因吸收；随着PCR的进行，当引物延伸至探针位置时，Taq酶发挥其5′→3′外切酶活性，将探针5′端的荧光分子从探针上切割下来，淬灭分子失去对荧光分子的淬灭作用，从而使荧光分子发出荧光，切割的荧光分子数与PCR产物的数量成正比。因此，根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。同常规PCR法相比，实时荧光定量PCR还具有以下几个优点：(1)有效解决PCR污染问题，从配好PCR反应液到结果分析完成，整个过程均在单管中进行，不须打开管盖，避免了PCR产物对实验室的污染。(2)自动化程度高，PCR反应及其后的结果分析均由计算机来完成。(3)特异性强，因为荧光信号的产生不仅依赖于靶模板同探针的杂交，而且同时强烈依赖于靶模板的扩增，二者缺一不可，故不存在非特异性扩增现象。(4)PCR反应的实时监控，由于传统定量方法都是终点检测，而终点检测在靶模板浓度较高时结果并不真实，实时荧光定量PCR技术有效的解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品C_T值的计算，根据标准曲线获得定量结果。

然而，在实际应用中是否能够利用以及如何利用实时荧光定量PCR技术仍存在需攻克的技术难题，例如探针的设计、检测的灵敏度等等，目前仍未见探针法实时荧光定量PCR技术用于临床腹泻病人粪便样本和猴、犬粪便样本以及小型猪回盲部内容物样本中空肠弯曲菌的定量检测。

因此，为了实现临床样本中空肠弯曲菌的定量检测，分析人和动物的空肠弯曲菌感染状况，进一步提高检测的灵敏度，建立空肠弯曲菌的探针法实时荧光定量PCR检测方法，以及研制相应的检测试剂变得十分迫切。

发明内容

本发明提供了用于对空肠弯曲菌进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针。

本发明所提供的引物和TaqMan探针，是根据空肠弯曲菌鞭毛蛋白A(flaA)基因保守区域的保守区域设计的，用以定量检测临床腹泻病人粪便样本和猴、犬粪便样本以及小型猪回盲部内容物样本中空肠弯曲菌的核酸拷贝数。

具体来讲，所述引物的上游引物具有序列表中SEQ ID NO：1的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列；所述TaqMan探针具有序列表中SEQID NO：3的核苷酸序列。

所述TaqMan探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团(R)，3’端标记有淬灭荧光基团(Q)。

所述报告荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为NFQ。

本发明的第二个目的是提供一种灵敏度较高且可准确定量的空肠弯曲菌的实时荧光定量PCR检测方法。

本发明所提供检测方法，是以本发明的引物和TaqMan探针进行的实时荧光定量PCR检测方法。

所述20μL实时荧光定量PCR反应体系可包括：TaqMan探针+引物1μL(TaqMan探针浓度250nM，上、下游引物浓度各为900nM)，样品cDNA 1μL(1μg/mL)，无RNA酶水8μL，Taqman Mix(TaqMan Gene Expression Master Mix 4369016，购自美国应用系统(ABI)公司)10μL。

所述实时荧光定量PCR反应条件可为：先50℃ 2min；然后95℃ 10min；最后95℃ 15sec，60℃ 1min，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

所述检测方法还包括标准曲线的建立，方法为：用含有目的片段的质粒作为标准品，将其10倍系列稀释成Ⅰ：1.1×10¹⁰拷贝/μL；Ⅱ：1.1×10⁹拷贝/μL；Ⅲ：1.1×10⁸拷贝/μL；Ⅳ：1.1×10⁷拷贝/μL；Ⅴ：1.1×10⁶拷贝/μL；Ⅵ：1.1×10⁵拷贝/μL；Ⅶ：1.1×10⁴拷贝/μL；Ⅷ：1.1×10³拷贝/μL；Ⅸ：1.1×10²拷贝/μL；Ⅹ：1.1×10¹拷贝/μL；Ⅺ：1.1×10⁰拷贝/μL。将质粒作为模板进行实时荧光定量PCR检测，得到用于空肠弯曲菌检测的标准曲线。

所述标准曲线的20μL实时荧光定量PCR反应体系包括：TaqMan探针+引物1μL(TaqMan探针浓度250nM，上、下游引物浓度各为900nM)，质粒DNA 1ul(0.000324mg/mL)，无RNA酶水8μL，Taqman Mix(TaqMan Gene Expression Master Mix 4369016，购自美国应用系统(ABI)公司)10μL；实时荧光定量PCR反应条件与上述相同。

本发明的第三个目的是提供一种用于对空肠弯曲菌进行实时荧光定量PCR检测的试剂盒。

本发明所提供的试剂盒，包括上述用于对空肠弯曲菌进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针。

本发明提供了一种空肠弯曲菌的实时荧光定量PCR检测方法及其专用引物和TaqMan探针。该方法是以待检样品中的空肠弯曲菌核酸为检测对象，准确度及精密度均较好。本发明具有以下优点：

1、首次建立了空肠弯曲菌探针法实时荧光定量PCR检测方法，利用此检测方法可以对临床腹泻病人粪便样本和猴、犬粪便样本以及小型猪回盲部内容物样本中的空肠弯曲菌进行检测。

2、本检测方法与空肠弯曲菌的其它常规检测方法如细菌的分离培养鉴定、全菌ELISA法和嵌套式PCR相比，灵敏度较高，具有取样便捷，检测效率得到了很大的提高，并且有效的防止了污染。

3、本检测方法与空肠弯曲菌的其它常规检测方法，如细菌的分离培养鉴定、全菌ELISA法和嵌套式PCR相比，具有操作程序简单易用的特点，并可进一步制成检测试剂盒，操作程序化，适合大面积推广和应用。

4.本检测方法不仅能够评价人和动物的空肠弯曲菌感染状况，同时也为空肠弯曲菌的流行病学、致病机理等相关领域的研究提供了依据。

5.本检测方法也可用于动物源性生物制品中外源性空肠弯曲菌的污染监测，为生物制品的安全性检测提供了有效工具。

综上所述，本发明能快速、准确地检测出人(临床腹泻病人粪便样本)和动物(猴、犬粪便样本和小型猪回盲部内容物样本)的空肠弯曲菌，对保障动物质量和人类健康具有重要意义。本发明对控制人和动物源性相关生物制品的质量及进出口动物检验检疫领域中有具有较大的实际意义，能够保证相关生物制品的质量，对于控制空肠弯曲菌传播和人民用药安全意义重大。本发明的检测方法及试剂盒可用于弯曲菌病的诊断及生物制品的空肠弯曲菌检定，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为10倍系列稀释pMD-CJ-flaA质粒标准品的空肠弯曲菌探针法实时荧光定量PCR检测扩增曲线

图2为空肠弯曲菌的实时荧光定量PCR检测的标准曲线

图3为空肠弯曲菌探针法实时荧光定量PCR检测20份样本的荧光扩增曲线

图4为空肠弯曲菌探针法实时光定量PCR检测特异性的荧光扩增曲线

具体实施方式

下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中末注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人所编《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商建议的条件。所用引物及TaqMan探针由美国应用系统(ABI)公司合成，所有序列测定工作均由宝生物工程(大连)有限公司完成。

实施例1、用于对空肠弯曲菌(CJ)进行实时荧光定量PCR检测的引物及TaqMan探针的设计

参照GenBank收录的空肠弯曲菌Campylobacter jejuni subsp.jejuni NCTC 11168株基因组全序列(GeneBank：NC_002163)，将与空肠弯曲菌基因组结构极为相似的结肠弯曲菌和胎儿弯曲菌分别进行序列比对，选择鞭毛蛋白A(flaA)基因保守区域，采用ABI Primer Express 3.0实时荧光定量PCR引物设计软件，设计合成TaqMan探针及引物。探针的荧光标记选择FAM(5’端)作为报告发光基团，NFQ(3’端)为淬灭基团。序列如下：

上游引物(CJ-1)：5’-AACCTGAGCCTGCAGAAACATTAT-3’(序列表中SEQ ID N0：1)；

下游引物(CJ-2)：5’-CCACAGGTTTTGCAAACGCTATA-3’(序列表中SEQ ID NO：2)。

TaqMan探针：5’FAM-AAAGTTGCGAAGCAG-NFQ 3’(序列表中SEQ ID NO：3)。

实施例2、空肠弯曲菌的实时荧光定量PCR检测

一、标准曲线的建立

1、构建pMD-CJ-flaA重组质粒

1.1目的基因-空肠弯曲菌鞭毛蛋白A(flaA)基因的克隆

1.1.1空肠弯曲菌基因组DNA的提取

以下操作必须严格按照要求在P2实验室负压生物安全柜内进行。

(1)无菌条件下取空肠弯曲菌感染性腹泻病人粪便样本100mg(或猴、犬粪便100mg或小型猪回盲部内容物样本100mg)，置入5mL无菌离心管中，加入3mL灭菌PBS(pH7.6)，充分混匀，室温静置5min；以无菌注射器吸取取上清，经微孔滤膜(0.45μm)过滤去除大的杂菌和相关残渣，滤液置入1.5mL无菌离心管中，4℃、12000r/min离心5min，弃上清，留细菌沉淀。

(2)加500μL抽提缓冲液(50mM Tris，pH 8.0；25mM EDTA，100mM NaCl；1％Triton X-100)、50μL SDS(10％)和50μL蛋白酶K(10mg/mL)，置55℃水浴1h。

(3)加入500μL Tris饱和酚，充分混匀，4℃、12000r/min离心5min。

(3)取上清，加入500μL氯仿/异戊醇(24：1)，混匀，4℃、12000r/min离心5min。

(4)取上清，加入1/10体积的乙酸铵(3mol/L，pH 5.2)和等体积的异丙醇，混匀，4℃、12000r/min离心5min。

(5)弃上清，用75％乙醇洗涤沉淀的DNA，将离心管敞口在室温空气中干燥10min等待乙醇挥发干净。

(6)将DNA沉淀溶于100μL灭菌去离子水中，加1μL RNaseA(10mg/mL)，37℃水浴30min。-40℃保存备用。

1.1.2PCR扩增

PCR的反应体系为50μL，依次加入下列成分：5μL 10×EX Buffer(MgCl₂ Plus，TaKaRa Ex Taq，购自宝生物工程(大连)有限公司)、4μL dNTP Mixture(10mM)、0.5μL正向引物：CTACATCACGGATTTGCGATTC(50pmol)、0.5μL反向引物：ATGAAAGAAAACTATGGCCGCT(50pmol)、0.25μL EX Taq(5unit/μL，购自宝生物工程(大连)有限公司)、5μL DNA、34.75μL灭菌去离子水。

PCR反应条件为：94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，共30个循环。

1.1.3琼脂糖凝胶电泳检测

配制1％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭)。取PCR扩增产物5μL，与1μL的6×载样缓冲液混匀，加到凝胶孔格中。电泳缓冲液为1×TAE缓冲液，电泳条件为110V恒压/30min，凝胶成像系统下拍摄记录电泳结果。结果得到了637bp的目的条带，用Agarose Gel DNA Purification Kit(琼脂糖凝胶回收试剂盒，购自宝生物工程(大连)有限公司)回收并纯化。

1.2空肠弯曲菌鞭毛蛋白A(flaA)基因重组质粒的构建

将步骤1.1克隆的空肠弯曲菌鞭毛蛋白A(flaA)基因片段与pMD18-T载体(购自宝生物工程(大连)有限公司)进行连接，连接反应体系为：2×Rapid LigationBuffer 5μL(宝生物工程(大连)有限公司试剂盒)，pMD18-T载体0.5μL(浓度50ng/μL)，目的基因4μL(45μg/mL)，T4DNA Ligase 0.5μL(5U/μL)。然后将连接产物热转化至E.coli Competent Cell JM109中，涂布LB平板，37℃过夜培养。将选定的含有阳性克隆的单菌落进行培养，提取质粒DNA，用EcoR I和Sal I限制性内切酶进行酶切鉴定并测序。酶切结果获得了637bp的目的条带及pMD18-T质粒条带，与预期结果相符。测序结果表明获得了序列及插入位置均正确的含目的基因的重组质粒，命名为pMD-CJ-flaA。测定质粒DNA浓度，计算拷贝数，结果拷贝数为1.1×10¹¹拷贝/μL，-40℃保存。

2、标准品检测

将pMD-CJ-flaA质粒DNA作为模板进行空肠弯曲菌探针法实时荧光定量PCR检测，建立标准曲线。具体操作如下：将质粒DNA进行10倍系列稀释成Ⅰ：1.1×10¹⁰拷贝/μL；Ⅱ：1.1×10⁹拷贝/μL；Ⅲ：1.1×10⁸拷贝/μL；Ⅳ：1.1×10⁷拷贝/μL；Ⅴ：1.1×10⁶拷贝/μL；Ⅵ：1.1×10⁵拷贝/μL；Ⅶ：1.1×10⁴拷贝/μL；Ⅷ：1.1×10³拷贝/μL；Ⅸ：1.1×10²拷贝/μL；Ⅹ：1.1×10¹拷贝/μL；Ⅺ：1.1×10⁰拷贝/μL。每个稀释度重复平行试验3次。

标准品检测反应体系为20μl，依次加入下列成分：TaqMan探针+引物1μL(TaqMan探针浓度250nM，上、下游引物浓度各为900nM))，质粒DNA 1μL(0.0003219mg/mL)，无RNA酶水8μL，Taqman Mix(TaqMan Gene Expression Master Mix 4369016，购自美国应用系统(ABI)公司)10μL。

标准品检测反应条件为：先50℃2min；然后95℃10min；最后95℃15s，60℃1min，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

标准品探针法实时荧光定量PCR扩增曲线如图1所示(Ⅰ：1.1×10¹⁰拷贝/μL；Ⅱ：1.1×10⁹拷贝/μL；Ⅲ：1.1×10⁸拷贝/μL；Ⅳ：1.1×10⁷拷贝/μL；Ⅴ：1.1×10⁶拷贝/μL；Ⅵ：1.1×10⁵拷贝/μL；Ⅶ：1.1×10⁴拷贝/μL；Ⅷ：1.1×10³拷贝/μL；Ⅸ：1.1×10²拷贝/μL；Ⅹ：1.1×10¹拷贝/μL；Ⅺ：1.1×10⁰拷贝/μL。)。

3、标准曲线的绘制

根据所得C_T值与其对应的标准品的对数值绘制标准曲线(图2)，由图2可知，实时荧光定量PCR检测空肠弯曲菌的线性范围是10¹⁰～10¹，标准曲线的相关系数R平方值为0.999(y＝-3.2897x+39.667)，荧光定量PCR反应的扩增效率为101.3627％。标准曲线显示：本发明建立的空肠弯曲菌探针法实时荧光定量PCR检测方法有10个数量级的线性检测范围，进一步说明该检测方法的具有非常高的灵敏度。

二、空肠弯曲菌探针法实时荧光定量PCR检测20份临床样本

将1份临床确诊的空肠弯曲菌感染性腹泻病人粪便样本DNA和11份猴、6份犬粪便样本DNA以及2份小型猪回盲部内容物样本DNA作为模板进行空肠弯曲菌探针法实时荧光定量PCR检测。每份样本重复平行试验3次。

临床样本检测体系为20μL，依次加入下列成分：TaqMan探针+引物1μL(TaqMan探针浓度250nM，上、下游引物浓度各为900nM)，样品DNA 1μL(1μg/mL)，无RNA酶水8μL，Taqman Mix(TaqMan Gene Expression Master Mix 4369016，购自美国应用系统(ABI)公司)10μL。

检测反应条件为：先50℃2min；然后95℃10min；最后95℃15s，60℃1min，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

探针法实时荧光定量PCR检测检测20份临床样本扩增曲线如图3所示，图3中，标号1曲线对应1份腹泻病人粪便样本，标号2～12之间的曲线对应11份猴粪便样本，标号13～18之间的曲线对应6份犬粪便样本，标号19～20的曲线对应2份小型猪回盲部内容物样本。结果显示：所有样本DNA为模板均出现了目的荧光扩增曲线。

试验一、空肠弯曲菌探针法实时荧光定量PCR检测方法的重复性分析

空肠弯曲菌探针法实时荧光定量PCR检测方法的重复性分析方法为：将含空肠弯曲菌鞭毛蛋白A(flaA)基因的重组质粒pMD-CJ-flaA的DNA分别进行10倍系列稀释后，各取1μL作为模板，采用上述反应体系进行实时荧光定量PCR检测，在同一次检测设4个重复管，每份样本重复平行试验3次，计算批内变异系数；上述标准阳性样本于-70℃保存，间隔1个月，定期复检，在同一次检测设4个重复管，每份样本重复平行试验3次，计算批间变异系数。试验结果取C_T平均值，通过统计计算C_T标准差(SD)、C_T变异系数(CV)。

重复性分析结果结果见表1：批内重复测定其变异系数CV值小于0.81％，批间重复测定CV值小于0.62％，均说明本发明建立的空肠弯曲菌探针法实时荧光定量PCR检测方法的稳定性良好。

表1  空肠弯曲菌探针法实时荧光定量PCR检测方法的重复性试验结果

试验二、空肠弯曲菌探针法实时荧光定量PCR检测方法的特异性

将空肠弯曲菌NCTC 11168株(购自美国标准菌种收藏所，ATCC，American TypeCulture Collection)DNA、肠炎沙门氏菌50041株(购自中国医学细菌保藏管理中心)DNA、小肠结肠炎耶尔氏菌52302株(购自中国医学细菌保藏管理中心)DNA、福氏志贺菌51573株(中国医学细菌保藏管理中心)DNA、大肠埃希菌44711株(购自中国医学细菌保藏管理中心)DNA作为模板进行探针法实时荧光定量PCR检测，评价反应系统的特异性。反应体系及反应条件与实施例2相同。每份样本重复平行试验3次。

探针法实时荧光定量PCR检测特异性扩增曲线如图4所示，结果显示：以空肠弯曲菌NCTC 11168株DNA为模板出现了目的荧光扩增曲线(见标号①曲线)，而以肠炎沙门氏菌50041株DNA、小肠结肠炎耶尔氏菌52302株DNA、福氏志贺菌51573株DNA、大肠埃希菌44711株DNA为模板没有出现目的荧光扩增曲线(见标号②～⑤之间的线条或空白)。结果说明：本发明用于对空肠弯曲菌进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针的特异性良好，定量反应体系特异性良好。

实施例3、空肠弯曲菌探针法实时荧光定量PCR检测试剂盒

将用于对空肠弯曲菌进行实时荧光定量PCR检测CJ TaqMan assay mix 50μL(TaqMan探针浓度250nM，上、下游引物浓度各为900nM)、CJ TaqMan mix 500μL、CJ阳性质控品(pMD-CJ-flaA重组质粒)50μL、CJ阴性质控品50μL以及无RNA酶水500μL共同包装，得到空肠弯曲菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒。

Claims (4)

1.用于对空肠弯曲菌进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针，是根据空肠弯曲菌鞭毛蛋白A(flaA)基因保守区域的保守区域设计的，用以定量检测临床病人粪便样本、猴、犬粪便样本以及小型猪回盲部内容物样本中空肠弯曲菌的核酸拷贝数；所述引物的上游引物为序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸，下游引物为序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸；所述TaqMan探针为序列表中SEQ ID NO：3所示的核苷酸。

2.根据权利要求1所述的引物和TaqMan探针，其特征在于：所述TaqMan探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。

3.根据权利要求2所述的引物和TaqMan探针，其特征在于：所述报告荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为NFQ。

4.一种用于对空肠弯曲菌进行实时荧光定量PCR检测的试剂盒，包括权利要求1-3任一项所述用于对空肠弯曲菌进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针。

Images