CN101570780B - 肉制品中布氏菌检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

肉制品中布氏菌检测试剂盒及检测方法，该试剂盒中包括浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶和PCR反应液；该PCR反应液中含10mM Tris·HCl、50mM KCl、25mM MgCl ₂、dNTP各2.5mM及布鲁氏菌属通用检测引物0.2mM。使用本发明的试剂盒及检测方法，可检测肉制品中布氏菌属6种布鲁氏菌，并进行6种布鲁氏菌的分种检测。本试剂盒特异性强，灵敏度高，可以检测到布鲁氏菌19CFU/mL。操作快捷、简便，且检测成本低。

Description

肉制品中布氏菌检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及肉制品中布鲁氏菌属及分种检测鉴定方法，包括羊布鲁氏菌，牛布鲁氏菌，猪布鲁氏菌，绵羊布鲁氏菌，狗布鲁氏菌，森林鼠布鲁氏菌6种布鲁氏菌的同时检测方法，尤其涉及利用PCR-DHPLC对肉制品中6种布鲁氏菌进行检测和分型的方法。还涉及检测所使用的组合物，即试剂盒。 

背景技术

现有的检测技术如细菌培养和生化鉴定、免疫学技术、PCR技术等均存在一些问题：常规的生化鉴定方法操作复杂，耗时长，往往一次检测实验只能鉴定一种或少数几种细菌；免疫学技术虽灵敏性高，但易污染，经常出现假阳性现象；PCR技术一般要与凝胶电泳技术联用，而电泳结果不能作为最终结论，还需要进行其他探针杂交实验。PCR-凝胶电泳检测方法虽然检测成本低，但反应产物电泳处理极易造成污染；特异性强，灵敏度高的实时荧光PCR方法，存在检测成本较高，荧光探针保存时间较短等问题。因此，上述检测方法不能满足同时快速检测多种细菌的需要。对于布鲁氏菌的鉴别急需一种稳定快速的方法。 

目前国内外对于布鲁氏菌的检测则更为落后，还主要依靠传统的增菌、分离、生化鉴定方法。培养鉴定和血清学检查是进行布鲁氏菌检验的重要方法。布鲁氏菌属分成六种，包括羊布鲁氏菌，牛布鲁氏菌，猪布鲁氏菌，绵羊布鲁氏菌，狗布鲁氏菌，森林鼠布鲁氏菌。布鲁氏菌对培养条件要求较高，生长缓慢，检测和鉴定周期长，而且传统培养生化检测方法检出率不高。布鲁氏菌属细菌营养要求较高，传统平板培养生长缓慢，初次分离需经5天到10天，甚至2周以上。用血清学反应鉴定布氏菌存在很多交叉反应，与布氏菌有共同抗原呈血清交叉反应的微生物近30种，其中最重要的是小肠结肠炎O:9型。而且布鲁氏菌分离鉴定过程中易造成实验室污染，是易发生实验室传染的烈性传染病的病原菌。因此建立快速检测和鉴定布鲁氏菌的检验方法势在必行。 

本发明运用通用引物PCR结合DHPLC技术进行布鲁氏菌属和6种布鲁氏 菌的同时检测。应用本发明的试剂盒，6种布鲁氏菌可以用一对引物就检测出来；在本发明的非变性DHPLC分析条件下，通用引物从样品中检测出布鲁氏菌属；在本发明的部分变性DHPLC分析条件下，进行布鲁氏菌的分种检测，分别检测出6种布鲁氏菌的类别。通用引物PCR反应克服了单一PCR反应中操作比较繁琐，交叉污染机会较多等缺点，可以在一个反应体系中同时扩增多个目的基因，操作简便快速。在一次操作过程中同时检测布鲁氏菌属各种布鲁氏菌，使得布鲁氏菌的检测时间、检测数量和检测水平上都发生了很大的飞跃。与一些传统的布鲁氏菌检测及鉴定方法如生化水平鉴定、免疫学技术、PCR技术的鉴定相比，极大的缩短了操作的时间，而且大大降低假阳性和假阴性结果的出现，使得结果更加准确、可靠。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于灵敏快速检测肉制品中布氏菌，包括羊布鲁氏菌，牛布鲁氏菌，猪布鲁氏菌，绵羊布鲁氏菌，狗布鲁氏菌和森林鼠布鲁氏菌6种布鲁氏菌的mPCR-DHPLC检测试剂盒。 

本发明所述的试剂盒包括浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶和PCR反应液；该PCR反应液中含10mM Tris·HCl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM及布鲁氏菌属通用检测引物0.2mM，所述的引物对序列为： 

上游引物：5’-TGGCTCGGTTGCCAATATTCAA-3’ 

下游引物：5’-CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG-3’ 

试剂盒保存条件：-20℃保存。 

本发明还提供了利用上述试剂盒检测上述这6种布氏菌并对其进行分种的方法，包括如下步骤： 

①取1ul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒中的PCR缓冲液和0.25μLTaq DNA聚合酶，灭菌超纯水38.75μL，总体积50μL；5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增： 

预变性：93℃，5min； 

进入循环：93℃变性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，40个循环； 

终止延伸：72℃，10min； 

4℃保存反应产物； 

②非变性条件下分析PCR产物，以检测布鲁氏菌属微生物，DHPLC检测条件如下： 

色谱柱：PS-DVB & C18 DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm； 

柱温：50℃； 

流动相(体积比)：0.0min，55.0％缓冲溶液A，45.0％缓冲溶液B， 

                0.5min，50.2％缓冲溶液A，49.8％缓冲溶液B， 

                2.4min，44.2％缓冲溶液A，55.8％缓冲溶液B， 

                4.3min，40.9％缓冲溶液A，59.1％缓冲溶液B， 

                6.1min，38.8％缓冲溶液A，61.2％缓冲溶液B， 

                8.0min，37.3％缓冲溶液A，62.7％缓冲溶液B， 

其中，缓冲溶液A为50ml TEAA和250μl乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；缓冲溶液B为50ml TEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液； 

流速：0.9mL/min； 

检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s； 

上样量：PCR产物5μL。 

③部分变性条件下分析PCR产物，以进行6种布氏菌的分种检测，DHPLC检测条件为： 

色谱柱：PS-DVB & C18 DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm； 

柱温：60℃； 

流动相(体积比)：0.0min，50.3％缓冲溶液A，49.7％缓冲溶液B， 

                0.5min，45.3％缓冲溶液A，54.7％缓冲溶液B， 

                5.0min，36.3％缓冲溶液A，63.7％缓冲溶液B， 

其中，缓冲溶液A为50ml TEAA和250μl乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；缓冲溶液B为50ml TEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液； 

流速：0.9mL/min； 

检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s； 

上样量：PCR产物5μL。 

本发明对6种布鲁氏菌同源序列进行比对分析，设计了布鲁氏菌属的通用引物，建立了PCR-DHPLC快速高通量检测f方法；同时针对6种布鲁氏菌基因片段的高度可变区，建立了DHPLC在部分变性条件下将存在序列差异的DNA片段分离开，快速鉴定布氏菌属的不同种；建立了在部分变性DHPLC检测条件下，6种布鲁氏菌特征基因型鉴别图谱库。 

同传统的检测方法相比，本发明的优点非常突出： 

(1)由于布氏菌与30余种微生物有共同抗原，故血清学等方法诊断人畜布氏菌病存在不同的血清交叉反应。其中以小肠结肠炎耶尔森氏菌与布氏菌交叉反应最突出。这个问题引起国内外多方关注，为鉴别两菌感染采用多种途径探索，但至今没有满意结果。因血清学及过敏反应很难鉴别两菌感染，本发明采用PCR-DHPLC技术对肉制品中布氏菌进行检测和分种的研究。 

(2)本发明试剂盒中的通用引物，PCR反应条件，在非变性DHPLC分析条件下，同时检测6种布鲁氏菌，完成肉制品中布氏菌属的检测。 

(3)本发明同时针对6种布鲁氏菌基因片段的高度可变区，建立了DHPLC部分变性条件下将存在序列差异的DNA片段分离开，快速鉴定布氏菌属的不同种；建立了在部分变性DHPLC检测条件下，六种布鲁氏菌特征基因型鉴别图谱库。 

(4)本发明的肉制品中布氏菌通用引物PCR-DHPLC检测试剂盒，快捷、简便、特异性强、灵敏度高、检测成本极大降低。 

附图说明

本发明附图7幅， 

图1是布鲁氏菌50℃非变性条件下PCR-DHPLC检测图谱，其中1～6分别是羊布鲁氏菌、猪布鲁氏菌、牛布鲁氏菌、绵羊布鲁氏菌、犬布鲁氏菌和森林鼠布氏菌； 

图2是猪布鲁氏菌60℃部分变性条件下PCR-DHPLC检测图谱； 

图3是森林鼠布鲁氏菌60℃部分变性条件下PCR-DHPLC检测图谱； 

图4是羊布鲁氏菌60℃部分变性条件下PCR-DHPLC检测图谱； 

图5是绵羊布鲁氏菌60℃部分变性条件下PCR-DHPLC检测图谱； 

图6是狗布鲁氏菌60℃部分变性条件下PCR-DHPLC检测图谱； 

图7是牛布鲁氏菌60℃部分变性条件下PCR-DHPLC检测图谱； 

上述附图中，横坐标均为保留时间(单位：分钟min)，纵坐标表示吸收峰信号强度(单位：毫伏mV)。 

具体实施方式

下面为本发明的具体实施例，其对本方法的建立及其应用作进一步的说明，但并不以任何形式限制本发明的内容。 

若无特殊说明，本部分所使用的主要试剂、仪器及其商品来源为：细菌基因组DNA小量纯化试剂盒(TakaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extractionkit)、Taq酶及PCR缓冲液等试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司；三乙胺乙酰盐(TEAA，色谱纯)购自Transgenomic公司；乙腈(色谱纯)购自Fisher公司；普通PCR仪PE24000(PerkinElmer公司，美国)；变性高效液相色谱仪NAV-99-4500(Transgenomic公司，美国)；高速离心机centrifuge 5804(Eppendorf公司，德国)。 

本专利研究所用标准菌株均购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)和中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)，详见表1。各菌株使用菌种保存管-80℃保存，活化培养等均按照相关的国家标准(GB)、检验检疫行业标准(SN)或国际权威标准方法进行。 

表1.试验菌种及其编号 

实施例1、肉制品中布氏菌检测试剂盒及检测方法的建立 

(1)肉制品中布氏菌检测试剂盒的建立 

本发明人对6种布鲁氏菌同源序列进行比对分析，设计了布鲁氏菌属的通用引物对： 

上游引物：5’-TGGCTCGGTTGCCAATATTCAA-3’ 

下游引物：5’-CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG-3’ 

在此基础上组装用于肉制品中布氏菌检测的试剂盒，该试剂盒中包括浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶和PCR反应液；该PCR反应液中含10mM Tris·HCl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM及上述布鲁氏菌属通用检测引物0.2mM。 

(2)肉制品中布氏菌检测及分种检测方法的建立： 

①待检样品的制备：采用试剂盒提取法制备待测样品DNA基因组： 

检测样品加入布鲁氏菌肉汤培养基分别在有氧和厌氧条件下，于37℃恒温培养48±3h，用布鲁氏菌肉汤培养基提取模板DNA。使用细菌基因组提取试剂盒提取其基因组DNA，制取PCR模板。标记，直接作为PCR模板或-20℃保存。 

②PCR扩增： 

取1ul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒中的PCR缓冲液和0.25μL TaqDNA聚合酶，灭菌超纯水38.75μL，总体积50μL；5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增： 

预变性：93℃，5min； 

进入循环：93℃变性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，40个循环； 

终止延伸：72℃，10min； 

4℃保存反应产物； 

③非变性条件下分析PCR产物，以检测布鲁氏菌属微生物，DHPLC检测条件如下： 

色谱柱：PS-DVB & C18 DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm； 

柱温：50℃； 

流动相(体积比)：0.0min，55.0％缓冲溶液A，45.0％缓冲溶液B， 

                0.5min，50.2％缓冲溶液A，49.8％缓冲溶液B， 

                2.4min，44.2％缓冲溶液A，55.8％缓冲溶液B， 

                4.3min，40.9％缓冲溶液A，59.1％缓冲溶液B， 

                6.1min，38.8％缓冲溶液A，61.2％缓冲溶液B， 

                8.0min，37.3％缓冲溶液A，62.7％缓冲溶液B， 

其中，缓冲溶液A为50ml TEAA和250μl乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；缓冲溶液B为50ml TEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液； 

流速：0.9mL/min； 

检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s； 

上样量：PCR产物5μL。 

④部分变性条件下分析PCR产物，以进行6种布氏菌的分种检测，DHPLC检测条件为： 

色谱柱：PS-DVB & C18 DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm； 

柱温：60℃； 

流动相(体积比)：0.0min，50.3％缓冲溶液A，49.7％缓冲溶液B， 

                0.5min，45.3％缓冲溶液A，54.7％缓冲溶液B， 

                5.0min，36.3％缓冲溶液A，63.7％缓冲溶液B， 

其中，缓冲溶液A为50ml TEAA和250μl乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；缓冲溶液B为50ml TEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液； 

流速：0.9mL/min； 

检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s； 

上样量：PCR产物5μL。 

步骤③检测布鲁氏菌属中羊布鲁氏菌，牛布鲁氏菌，猪布鲁氏菌，绵羊布鲁氏菌，狗布鲁氏菌和森林鼠布鲁氏菌的检测结果如附图1所示；特异性PCR 产物在50℃非变性条件下，6种布氏菌在目标产物处均出现一个单一的洗脱峰，基线平整，滞留时间一致，具有高度同一性，结果表明6种布氏菌检测结果都为阳性，结果为检出布鲁氏菌。 

步骤④检测布鲁氏菌属中羊布鲁氏菌，牛布鲁氏菌，猪布鲁氏菌，绵羊布鲁氏菌，狗布鲁氏菌和森林鼠布鲁氏菌的检测结果如附图2～7所示，图谱显示：对这6种布鲁氏菌的检测均达到了部分变性的差异检测效果。6种菌在60℃部分变性条件下，从各自差异基因位点不同程度地解链，随着片段的解链域不同，各自核苷酸片段在TEAA分子中的三个乙基与固定相C18表面的烷基发生疏水作用力相互吸引，通过流动相中的乙腈的梯度洗脱达到将不同性质的6种布鲁氏菌核苷酸片段分子的分离，因而各自出现了特异性的分型图谱，可以很明显地从检测图谱上将6种布鲁氏菌区分开来。 

实施例2、特异性试验 

取表1中所列的参考菌株DNA模板库，按照实施例所建立的方法分别进行检测。试验结果表明只有6种布鲁氏菌出现阳性吸收峰，其余菌种均无阳性吸收峰出现，对布鲁氏菌表现出很高的检测特异性。 

为了证实该阳性吸收峰为布鲁氏菌特异基因的片段，本发明将DHPLC的阳性吸收峰产物回收后进行了克隆和测序，结果与布鲁氏菌OMP的DNA序列比对，证明了DHPLC阳性吸收峰为布鲁氏菌OMP基因的片段。 

试验结果表明，布鲁氏菌通用PCR检测引物经PCR扩增，在DHPLC的50℃非变性分析条件下，可以特异性检测布鲁氏菌属的6种布鲁氏菌，具有很好的布鲁氏菌鉴定特异性，避免其它种属细菌的干扰反应。 

实施例3、灵敏度试验 

按照实施例1所建立的方法增菌方法，用比浊法定量所培养的复合增菌的菌液浓度，使用实施例1所建立的方法提取DNA并进行检测，试验结果如附图2所示，DHPLC峰型从高至低依次为：2.7×10⁴CFU/mL cfu/mL布鲁氏菌；2.2×10³cfu/mL布鲁氏菌；210cfu/mL布鲁氏菌；19cfu/mL布鲁氏菌。结果表明本发明方法检测限可达到约0.95pg/ul布鲁氏菌DNA，检测下限大约可检测到19个布鲁氏菌。 

实施例4、在实际样品检测中的应用 

将本发明的试剂盒和方法用于实际检验工作中，并与现有其他检测方法-《进出口动物源性食品中布鲁氏菌属检验方法第1部分：分离与计数方法》(SN/T 1942.1-2007)，《进出口动物源性食品中布鲁氏菌属检验方法第2部分：PCR检验方法》(SN/T 1942.2-2007)，进行比较，验证实用性和可靠性。自2007年10月至2008年8月的11个月期间，采用本发明的试剂盒和PCR-DHPLC方法快速筛选，同时采用检验检疫行业标准的培养鉴定方法和PCR法进行验证比较。检测实际样品，共检测6大类1782种样品，着重检测了各种肉制品。结果表明，用PCR-DHPLC方法筛选检出的3份阳性样本，采用经典的生化方法进行验证，均证实PCR-DHPLC方法检出为阳性。具体结果如下表(表2)所示： 

表2、3种方法验证检测的比较结果 

[0110] SEQUENCE LISTING 

<110>郑，秋月

<120>肉制品中布氏菌检测试剂盒及检测方法

<130>N/A

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

tggctcggtt gccaatattc aa                                    22

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

cgcgcttgcc tttcaggtct g                                     21 

Claims (1)

1.肉制品中布氏菌的检测方法，其特征在于包括如下步骤：

①取1ul待测样品DNA溶液，加入10ul PCR反应液和0.25μL浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶，灭菌超纯水38.75μL，总体积50μL；5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增：

预变性：93℃，5min；

进入循环：93℃变性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，40个循环；

终止延伸：72℃，10min；

4℃保存反应产物；

步骤①中所述的PCR反应液中含10mM Tris·HCl、50mM KCl、25mMMgCl2、dNTP各2.5mM及布鲁氏菌属通用检测引物0.2mM，所述的引物对序列为：

上游引物SEQ ID NO.1：5’-TGGCTCGGTTGCCAATATTCAA-3’

下游引物SEQ ID NO.2：5’-CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG-3’；

②非变性条件下分析PCR产物，以检测布鲁氏菌属微生物，DHPLC检测条件如下：

色谱柱：PS-DVB＆C18 DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；

柱温：50℃；

流动相，按体积比计：0.0min，55.0％缓冲溶液A，45.0％缓冲溶液B，

                    0.5min，50.2％缓冲溶液A，49.8％缓冲溶液B，

                    2.4min，44.2％缓冲溶液A，55.8％缓冲溶液B，

                    4.3min，40.9％缓冲溶液A，59.1％缓冲溶液B，

                    6.1min，38.8％缓冲溶液A，61.2％缓冲溶液B，

                    8.0min，37.3％缓冲溶液A，62.7％缓冲溶液B，

其中，缓冲溶液A为50ml TEAA和250μl乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；缓冲溶液B为50ml TEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；

流速：0.9mL/min；

检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；

上样量：PCR产物5μL；

③部分变性条件下分析PCR产物，以进行6种布氏菌的分种检测，DHPLC检测条件为：

色谱柱：PS-DVB&C18 DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；

柱温：60℃；

流动相，按体积比计：0.0min，50.3％缓冲溶液A，49.7％缓冲溶液B，

                    0.5min，45.3％缓冲溶液A，54.7％缓冲溶液B，

                    5.0min，36.3％缓冲溶液A，63.7％缓冲溶液B，

其中，缓冲溶液A为50ml TEAA和250μl乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；缓冲溶液B为50ml TEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；

流速：0.9mL/min；

检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；

上样量：PCR产物5μL。

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