CN108743995A - 一种无害化布鲁氏菌的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种无害化布鲁氏菌的检测方法，利用杀菌剂对细菌的杀灭作用，取患病动物的生殖器分泌物、眼睛分泌物、粪便或者组织器官，用消毒剂杀死可能的布鲁氏菌，而可能的布鲁氏菌DNA依然存留，经过实验室清洗手段可得到纯化布鲁氏菌DNA，再通过常规PCR、电泳等步骤实现布鲁氏菌的无害化检测。该方法具有无害化的最大优点，在检测准确度高、检测速度快等优点的基础上，让布鲁氏菌的检测变得更加安全、无毒，减少了饲养员、兽医人员、采样人员、实验室人员、防疫人员、屠宰人员以及市民的个人安全风险。
Description
技术领域
本发明涉及一种无害化布鲁氏菌的检测方法，属于生物检测技术领域。
背景技术
布鲁氏菌病(Brucellosis，也称布氏杆菌病，简称布病)是由布鲁氏菌属细菌引起的人兽共患的常见传染病。我国将其列为二类动物疫病。其病原是细胞内寄生的革兰氏阴性菌——布鲁氏菌(Brucella)。它主要引起人的波状热和慢性感染，引起反刍动物睾丸炎和流产等。根据抗原性和主要宿主把布鲁氏菌属的细菌分为6个种，20个生物型。在世界200多个国家和地区中，170多个国家和地区有人、畜布鲁氏菌病存在和流行。约占世界1/5～1/6的人受布鲁氏菌病威胁，全世界现约有500～600万人患布鲁氏菌病，年新发病人约有50万。在中国有25个省(市)、自治区的人、畜有布鲁氏菌病存在和流行，全国受布鲁氏菌病威胁的人口约有3.5亿，1200多个县市为布鲁氏菌病疫区，现有布鲁氏菌病患者30～50万，年新发病人数为5000～6000人，每年实际新病人数为25000～30000人。不同种类的布鲁氏菌大多具有不同宿主间交叉感染的能力，并具有极为明显的宿主危害倾向性。人和羊对羊布鲁氏菌高度易感，引起的危害也最为严重，而牛布鲁氏菌对人的易感性及危害性相对较轻，但对牛则高度易感，危害严重。猪布鲁氏菌对猪和人均表现出高度易感性，危害也较为严重。此病很难产生持久免疫，有布病史的人和动物再次接触病原时，也可能再次感染，因此对人类健康和畜牧业发展构成重大威胁。世界动物卫生组织(OIE)将布鲁氏菌病列为必须报告的动物疫病，我国将该病列为二类动物疫病。任宁宁等报道我国目前牛的流行率达到0-14.7％。陈颖钰等报道，实用虎斑平板凝集实验检测，河北牛的发病率高达35.8％(1227例)。国家卫生计生委联合发布《国家布鲁氏菌病防治计划(2016-2020年)》，实施分区管理，国家对布鲁氏菌病的诊断、防控给予足够的重视。
布鲁氏菌病的诊断主要采用虎斑平板凝集实验(RBPT)，试管凝集试验(SAT)，布病补体结合试验(CFT)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，(荧光偏振试验(FPA)等血清学诊断。但血清学诊断存在大量的假阳性，尤其对疫苗注射产生的抗体所产生的假阳性给给防控带来极大困扰。另一方面，检测诊断要采取血液样本，这对采集人员，实验人员带来潜在的感染风险。近十几年来，分子生物学诊断技术发展迅速，用于疾病的诊断，显示出了良好的应用前景。结合分子生物学诊断技术开发一种无害、低风险诊断势在必行。
发明内容
本发明目的是提供一种无害化布鲁氏菌的检测方法。本发明采用无传染性处理(无害化)样本，使用基因诊断，更为高效、精确，是一种行之有效的抗原学诊断方法。无传染性的巨大优势体现于，具有降低接触人员感染的风险，相对于其他方法，这对于布鲁氏菌的采样、检测有不可比拟的作用。
本发明利用消毒剂对细菌的杀灭作用，取患病动物或人的生殖器分泌物、眼睛分泌物、粪便或者组织器官，用消毒剂杀死可能的布鲁氏菌，而可能的布鲁氏菌DNA依然存留，经过实验室清洗手段可得到纯化布鲁氏菌DNA，再通过常规PCR、电泳等步骤实现布鲁氏菌的无传染性检测。
本发明令人惊奇地研究发现，用甲醛或多聚甲醛对待测样本进行处理，既可以彻底杀死待测样本中可能存在的布鲁氏菌，从而能够降低接触人员感染的风险，极大地提高安全性；还可以使得布鲁氏菌DNA依然完整存留，使纯化完整布鲁氏菌DNA成为可能，有利于实现布鲁氏菌的无传染性检测。其他消毒剂(例如84消毒液)造成病菌DNA降解不能进行结果判定，难以进行后续检测，因而甲醛或多聚甲醛具有无可比拟的技术优势。
本发明技术方案如下：
一种对疑似感染布鲁氏菌的样本进行无害化处理的方法，包括用有效量的甲醛或多聚甲醛对待测样本进行处理。进一步地，该处理是以处理至彻底杀死待测样本中可能存在的布鲁氏菌且不破坏布鲁氏菌DNA(即保留完整)为目标。基于该目标，本领域技术人员可以根据待测样本的类型及其数量选择适量的甲醛或多聚甲醛。
本发明还提供一种无害化布鲁氏菌的检测方法，包括如下步骤：
(1)无传染性采样，用甲醛或多聚甲醛杀灭样本中的布鲁氏菌；将无活布鲁氏菌的检测样本进行提取，获得基因组总DNA；
(2)以所获得基因组总DNA为模板，进行PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)；
(3)电泳；
(4)将待测样本DNA电泳条带判断检测结果，与布鲁氏菌DNA电泳条带进行对比，若出现阳性结果，则证明检测样本中含有布鲁氏菌；若出现阴性结果，则证明检测样本中不含布鲁氏菌。
进一步地，本发明所述甲醛为甲醛水溶液，例如10％福尔马林。
进一步地，本发明所述多聚甲醛为多聚甲醛水溶液；优选为4％多聚甲醛溶液(即4％PFA)。
所述4％多聚甲醛溶液(即4％PFA)可采用本领域常规方法配制。
本发明研究发现，4％多聚甲醛溶液对布鲁氏菌的杀灭效果最佳，可以彻底杀灭样本中含有的布鲁氏菌，大大降低给实验人员带来的潜在的感染风险，还不破坏布鲁氏菌DNA的完整性。
进一步地，本发明所述待测样本(或采样样本)包括动物或人的生殖器分泌物、眼睛分泌物、粪便、组织器官，还包括空气(气溶胶)等。
进一步地，本发明所述动物包括牛、羊、猪、狗、骆驼、鹿、犬、鼠等。
进一步地，本发明所述布鲁氏菌包括布鲁氏菌属的6个种，即羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)、牛种布鲁氏菌(Brucella abortus)、猪种布鲁氏菌(Brucellasuis)、绵羊附睾种布鲁氏菌(Brucella ovis)、犬种布鲁氏菌(Brucella canis)、沙林鼠种布鲁氏菌(Brucella neotomae)。
具体地，上述无害化布鲁氏菌的检测方法中，步骤(1)包括：
1)无传染性采取样本1g，滴加10ul的4％多聚甲醛溶液或10ul的10％福尔马林处理后，彻底杀死样本中活的布鲁氏菌；然后加入1×PBS(磷酸盐缓冲液)200ul+90％无水乙醇200ul，作用5min；
2)离心12000rpm，10min，取上清液；
3)DNA纯化，加Sequencing Binding Buffer等量，加到加到DNA提取试剂盒里，柱子里离心12000rpm，30s；
4)加Wash Buffer等量，离心12000r，30s；
5)重复步骤(4)一次；
6)加Elution Buffer等量，换一个新TUBE(离心管)，离心12000r，30s。
可采用本领域常规DNA提取试剂盒，例如购自宝生物工程(大连)有限公司。
进一步地，所述PCR条件：总反应为20ul体系，2×Taq酶10ul，上下游布鲁氏菌OMP引物(ATGCGCACTCTTC和GAACTTGTAGCCGATGCC)2ul，DNA 2-8ul。95℃作用5min，进入循环，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共计35个循环，然后72℃延伸7min；4℃forever。
所述电泳条件：1.5％琼脂糖凝胶电泳，电压90V，时间30min，EB(溴化乙锭)染色。紫外线仪拍照观察结果。
当本发明方法用于人体或动物离体组织器官或分泌物的检测时，检测结果不以判断人或动物是否患病为目的。
本发明方法也适用于已经死亡的人体或动物的离体组织器官或分泌物检测。
本发明方法利用消毒剂对细菌的杀灭作用，取患病动物的生殖器分泌物、眼睛分泌物、粪便或者组织器官，用消毒剂杀死可能的布鲁氏菌，而可能的布鲁氏菌DNA依然存留，经过实验室清洗手段可得到纯化布鲁氏菌DNA，再通过常规PCR、电泳等步骤实现布鲁氏菌的无传染性检测。该方法具有无传染性的最大优点，在检测准确度高、检测速度快等优点的基础上，让布鲁氏菌病的检测变得更加安全、无毒，减少了饲养员、兽医人员、采样人员、实验室人员、防疫人员、屠宰人员以及市民的个人安全风险。
本发明方法与现有技术方法相比，具有以下优势：
(1)所使用的样本无已经无传染性；
(2)检测速度快；
(3)该方法灵敏度高、准确性好、环境风险小；
(4)对布鲁氏菌扩增具有良好的特异性。
附图说明
图1-图3分别为实施例1-3的电泳结果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。若未特别指明，以下均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
所用仪器：ZR DNA Sequencing Clean-up Kit，PCR扩增仪，高速台式离心机，电泳仪，北；紫外透射反射分析仪，凝胶自动成像系统；Nano Drop超微量分光光度计(ThermoScientific)。
实施例1
分别采取(内蒙古通辽市阿古拉村)健康(即经检测确认无感染布鲁氏菌，编号：样本1)、疑似感染布鲁氏菌(编号：样本2)及确认感染布鲁氏菌(编号：样本3)的羊生殖器分泌物1g；分别滴加10ul的4％多聚甲醛溶液处理后，彻底杀死样本中可能的布鲁氏菌，用于检测备用。
分别将以上三种待测样本依次进行如下操作：
(1)1×PBS 200ul+90％无水乙醇200ul，5min；
(2)离心12000rpm，10min，取上清液；
(3)DNA纯化，加Sequencing Binding Buffer等量，加到DNA纯化试剂盒(宝生物)里离心12000rpm，30s；
(4)加Wash Buffer等量12000rpm，30s；
(5)重复步骤(4)一次；
(6)加Elution Buffer等量，换一个新TUBE(离心管)，离心12000r，30s。
(7)Nano Drop测浓度。
PCR总反应为20ul体系，2×Taq酶10ul，上下游布鲁氏菌OMP引物(ATGCGCACTCTTC和GAACTTGTAGCCGATGCC)2ul，DNA 8ul。95℃作用5min，进入循环，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共计35个循环，然后72℃延伸7min，4℃forever。
1.5％琼脂糖凝胶电泳，电压90V，时间30min，EB染色，紫外线仪拍照观察结果。
DNA的电泳条带实验结果见图1，其中：1-3分别代表样本1-3。
结果表明，样本1无任何DNA条带，样本2与样本3具有相同的DNA条带；判断样本2中含布鲁氏菌。
实施例2
分别采取(通辽阿古拉)健康(即经检测确认无感染布鲁氏菌，编号：样本1)、确认感染布鲁氏菌(编号：样本5)及三头疑似感染布鲁氏菌的羊(分别编号：样本2，样本3，样本4)生殖器分泌物1g；分别滴加10ul的4％多聚甲醛溶液处理后，彻底杀死样本中可能的布鲁氏菌，用于诊断备用。
分别将以上五种待测样本按实施例1相同的方法提取基因组总DNA。然后进行PCR。
经Nano Drop测浓度，样本1-5的DNA浓度分别为96ng/ul、110ng/ul、100ng/ul、120ng/ul和130ng/ul。
设置20ng/ul样本组、20ng/ul阳性对照组、空白阴性对照组。
CR总反应为20ul体系，2×Taq酶10ul，上下游布鲁氏菌OMP引物2ul，纯化DNA 2ul，加入纯水至总量20ul。95℃作用5min，进入循环，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共计35个循环，然后72℃延伸7min，4℃forever。
1.5％琼脂糖凝胶电泳，电压90V，时间30min，EB染色，紫外线仪拍照观察结果。
DNA的电泳条带实验结果见图2，其中：1-5分别代表样本1-5。
结果表明，样本1和样本2无任何DNA条带，即样本2动物未感染布鲁氏菌；样本3虽与样本5具有相同的DNA条带，但DNA电泳条带不清晰、颜色浅，检测结果可判断为弱阳性，即样本3动物有感染布鲁氏菌的可能性，需要进一步检测确认。判断样本4与样本5具有相同的DNA条带，样本4动物已感染布鲁氏菌。
实施例3
取确认感染布鲁氏菌的羊(通辽阿古拉)生殖器分泌物，分为3份，每份1g。以上3份检测样本分别使用500mg/L的84消毒液，4％多聚甲醛以及10％的福尔马林(编号分别是样本1、2和3))各10μl处理后，彻底杀死样本中可能的布鲁氏菌，用于检测备用。
分别将以上3种待测样本按实施例1相同的方法提取基因组总DNA。然后进行PCR。
经Nano Drop测浓度，样本1-3的DNA浓度分别为29ng/ul、106ng/ul、99ng/ul。
设置20ng/ul样本组、20ng/ul阳性对照组、空白阴性对照组。
CR总反应为20ul体系，2×Taq酶10ul，上下游布鲁氏菌OMP引物2ul，纯化DNA 2ul，加入纯水至总量20ul。95℃作用5min，进入循环，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共计35个循环，然后72℃延伸7min，4℃forever。
1.5％琼脂糖凝胶电泳，电压90V，时间30min，EB染色，紫外线仪拍照观察结果。
DNA的电泳条带实验结果见图3，其中：1-3分别代表样本1-3。
结果表明，样本1无任何DNA条带，即样本1检测不出布鲁氏菌；样本2与样本3具有相同的DNA条带，检测结果可判断为阳性，说明动物已感染布鲁氏菌。以上结果进一步说明84消毒液虽然能够杀灭病菌，但确破坏了DNA而不能用于后续检测。多聚甲醛和福尔马林既可用于杀灭病菌，同时还可以用于后续布鲁氏菌检测工作。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种对疑似感染布鲁氏菌的样本进行无害化处理的方法，其特征在于，包括用有效量的甲醛或多聚甲醛对待测样本进行处理；
优选地，以处理至彻底杀死待测样本中可能存在的布鲁氏菌且不破坏布鲁氏菌DNA为目标。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲醛为甲醛水溶液；所述多聚甲醛为多聚甲醛水溶液；优选地，所述多聚甲醛为4％多聚甲醛溶液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述待测样本包括动物或人的生殖器分泌物、眼睛分泌物、粪便、组织器官，还包括空气、气溶胶；和/或，
所述动物包括牛、羊、猪、狗、骆驼、鹿、犬、鼠。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述布鲁氏菌包括羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)、牛种布鲁氏菌(Brucella abortus)、猪种布鲁氏菌(Brucellasuis)、绵羊附睾种布鲁氏菌(Brucella ovis)、犬种布鲁氏菌(Brucella canis)、沙林鼠种布鲁氏菌(Brucella neotomae)。
5.一种无害化布鲁氏菌的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)无传染性采样，用甲醛或多聚甲醛杀灭样本中的布鲁氏菌；将无活布鲁氏菌的检测样本进行提取，获得基因组总DNA；
(2)以所获得基因组总DNA为模板，进行PCR；
(3)电泳；
(4)将待测样本DNA电泳条带判断检测结果，与布鲁氏菌DNA电泳条带进行对比，若出现阳性结果，则证明检测样本中含有布鲁氏菌；若出现阴性结果，则证明检测样本中不含布鲁氏菌。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述甲醛为甲醛水溶液；所述多聚甲醛为多聚甲醛水溶液；优选地，所述多聚甲醛为4％多聚甲醛溶液。
7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)包括：
1)无传染性采取样本1g，滴加10ul的4％多聚甲醛溶液或10ul的10％福尔马林处理后，彻底杀死样本中活的布鲁氏菌；然后加入1×PBS 200ul+90％无水乙醇200ul，作用5min；
2)离心12000rpm，10min，取上清液；
3)DNA纯化，加Sequencing Binding Buffer等量，加到DNA提取试剂盒里，离心12000rpm，30s；
4)加Wash Buffer等量，离心12000r，30s；
5)重复步骤(4)一次；
6)加Elution Buffer等量，换一个新TUBE，离心12000r，30s。
8.根据权利要求5-7任一项所述的检测方法，其特征在于，所述PCR条件：总反应为20ul体系，2×Taq酶10ul，上下游布鲁氏菌OMP引物2ul，DNA 2-8ul；95℃作用5min，进入循环，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共计35个循环，然后72℃延伸7min；和/或，所述电泳条件：1.5％琼脂糖凝胶电泳，电压90V，时间30min，EB染色。
9.根据权利要求5-8任一项所述的检测方法，其特征在于，采样样本包括动物或人的生殖器分泌物、眼睛分泌物、粪便、组织器官，还包括空气、气溶胶；和/或，
所述动物包括牛、羊、猪、狗、骆驼、鹿、犬、鼠。
10.根据权利要求5-9任一项所述的检测方法，其特征在于，所述布鲁氏菌包括羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)、牛种布鲁氏菌(Brucella abortus)、猪种布鲁氏菌(Brucella suis)、绵羊附睾种布鲁氏菌(Brucella ovis)、犬种布鲁氏菌(Brucellacanis)、沙林鼠种布鲁氏菌(Brucella neotomae)。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20181106 |