CN107300618A

CN107300618A - 多种人兽共患病病原菌的同步快速检测试剂盒

Info

Publication number: CN107300618A
Application number: CN201710459664.8A
Authority: CN
Inventors: 李娟�; 李丽; 宋丹丹; 宋秀玲; 徐坤; 王娟; 赵超; 刘玉申; 翟玥; 曲笑锋; 张惠雯; 郭媛媛; 李新新
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2017-06-16
Filing date: 2017-06-16
Publication date: 2017-10-27

Abstract

本发明公开了多种人兽共患病病原菌的同步快速检测试剂盒，它包括：免疫磁珠、量子点荧光生物探针；所述的免疫磁珠是羧基化磁珠用EDC和NHS活化后，与三价卵黄抗体IgY偶联；所述的量子点荧光生物探针是不同颜色的荧光量子点，分别与抗大肠杆菌 O157:H7、抗单增李斯特菌、抗布鲁氏菌、抗副溶血弧菌兔多克隆抗体偶联；所述的三价卵黄抗体IgY是将大肠杆菌 O157:H7、单增李斯特菌和布鲁氏菌灭活后，免疫SPF鸡获得的；利用本发明制备的试剂盒进行四种病原菌的同步快速检测，具有特异性好、灵敏度高、重复性和稳定性好、检测时间短的优点，能够用于四种病原菌的同步快速定量检测。

Description

多种人兽共患病病原菌的同步快速检测试剂盒

技术领域

本发明涉及快速检测领域，具体是多种人兽共患病病原菌的同步快速检测试剂盒。

背景技术

近年来，随着畜牧业和旅游业的飞速发展，许多人兽共患传染病的流行病学特征发生了改变，传播速度更快、传播范围更广。人兽共患传染病不仅严重威胁人类和动物的健康，还给农牧业带来巨大经济损失。布鲁氏菌、大肠杆菌O157:H7和单增李斯特菌是诸多人兽共患病病原菌中发病率较高、对人兽危害较严重的三种病原菌。人类或动物往往通过摄入被这些细菌污染的食物而发病，建立对这些病原菌的同步快速准确检测方法已经成为了公共卫生检测领域的研究热点之一。

大肠杆菌O157:H7为肠杆菌科、埃希氏菌属，革兰氏阴性菌，是肠出血性大肠杆菌中最重要的一个血清型。大肠杆菌 O157:H7的生化特性与普通大肠杆菌相似，最适生长温度为37℃，不耐高温，在75℃水中1min就可被杀死，但是在低温环境中可以长时间存活。耐酸，对氯极其敏感，1ppm就可致其死亡。大肠杆菌O157:H7是一种重要的人兽共患病病原菌，感染剂量非常低，10个活菌就可能致病。人误食被该菌污染的牛肉、猪肉、牛奶、蔬菜、水等均可能患病。

单核细胞增生李斯特菌，简称单增李斯特菌，是一种革兰氏阳性菌，在营养丰富的环境中可形成荚膜。单增李斯特菌的生长温度范围较广，为-1.5 ~ 50℃，最适生长环境为30℃、pH 4.5~7.0，热抵抗力较弱，60℃ 30min可被灭活，对酒精等化学消毒剂及紫外线照射敏感。单增李斯特菌在自然环境中存在广泛，在植物、土壤、饲料、废弃物以及人或动物的粪便中都有可能存在，动物感染该菌的可能性较大。由于其能够在相对极端的环境如低温、高盐等环境中生长，可通过多种途径引起传播，除了污染食品原料，单增李斯特菌还有可能在食品加工、运输或冷冻保存过程中传播，导致人或动物患病。单增李斯特菌作为李斯特氏菌属中对人畜危害最大的一种病原菌，也是食品卫生中一种重要的食源性病原菌，人类可通过食入被单增李斯特菌污染的食物，如奶及奶制品、猪肉、牛肉、羊肉、海产品、蔬菜、腌制食品等感染该菌。单增李斯特菌的发病率相对其他人兽共患病病原菌而言，并不是很高，但是其病死率可高达30% ~ 40%，超过了沙门氏菌和肉毒杆菌。

布鲁氏菌是一种细胞内寄生的革兰氏阴性短杆菌，主要感染羊、牛、猪等多种家畜、野生动物以及人类，威胁畜牧业的发展和人体的健康，造成巨大的经济损失，也带来严重的公共卫生问题。不同种类的布鲁氏菌大多还具有交叉感染的能力。布鲁氏菌可通过呼吸道、消化系统、皮肤粘膜等多种途径侵入人体，家畜作为人类感染布鲁氏菌最主要的感染源，人类通过接触带菌的羊、牛、猪等牲畜，进食布鲁氏菌污染的奶及奶制品、肉及肉制品等，均可引起发病。

现有的针对人兽共患病病原菌的检测方法主要包括分离培养鉴定法、免疫学方法和分子生物学方法。由于待测样品基质复杂，往往是多种病原菌共同存在，且含量相对较低，在进行常规检测之前往往需要通过前增菌培养，不仅对操作人员带来潜在感染的威胁，同时检测时间较长，会延误疫情的控制。免疫磁分离技术是利用磁性微球与特异性生物大分子结合形成的免疫磁珠，其可以从待测样品中快速捕获目标病原菌，并借助外加磁场将其分离出来，一定程度上可以缩短前增菌培养时间，甚至取代前增菌培养，缩短样品的检测时间，提高检测效率。量子点荧光探针标记技术是将量子点通过共价结合或者物理吸附的方式与蛋白质多肽、核酸等生物大分子结合，利用量子点独特的光学性能对研究对象进行定性或者定量分析的技术。与传统的荧光染料相比，量子点具有激发光谱宽、发射光谱窄、量子产率高、荧光稳定性好的优点，还可实现一元激发多元发射的同时标记，在基础生物学研究、医学诊断和卫生检测研究领域具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的为解决针对现有人兽共患病病原菌检测方法存在的问题，而提供了多种人兽共患病病原菌的同步快速检测试剂盒。

多种人兽共患病病原菌的同步快速检测试剂盒，它包括：免疫磁珠、量子点荧光生物探针；所述的免疫磁珠是羧基化磁珠用EDC和NHS活化后，与三价卵黄抗体IgY偶联；所述的量子点荧光生物探针是不同颜色的荧光量子点，分别与不同的兔多克隆抗体偶联；

所述的兔多克隆抗体为抗大肠杆菌 O157:H7兔多克隆抗体、抗单增李斯特菌兔多克隆抗体和\或抗布鲁氏菌兔多克隆抗体；

所述的三价卵黄抗体IgY是将大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和布鲁氏菌灭活后，免疫SPF鸡获得的；

所述的荧光量子点的荧光发射波长分别为539nm、583nm和634nm；

所述的多种人兽共患病病原菌的同步快速检测试剂盒，还包括抗副溶血弧菌兔多克隆抗体；

所述的荧光量子点为绿色、黄色、红色或蓝色荧光量子点；

所述的兔多克隆抗体IgG蛋白浓度为0.5mg/mL；

所述的鸡卵黄抗体IgY是采用PEG6000法进行纯化的；

所述的荧光量子点为CdSe/ZnS量子点。

本发明提供了多种人兽共患病病原菌的同步快速检测试剂盒，它包括：免疫磁珠、量子点荧光生物探针；所述的免疫磁珠是羧基化磁珠用EDC和NHS活化后，与三价卵黄抗体IgY偶联；所述的量子点荧光生物探针是不同颜色的荧光量子点，分别与抗大肠杆菌 O157:H7、抗单增李斯特菌、抗布鲁氏菌、抗副溶血弧菌兔多克隆抗体偶联；所述的三价卵黄抗体IgY是将大肠杆菌 O157:H7、单增李斯特菌和布鲁氏菌灭活后，免疫SPF鸡获得的；利用本发明制备的试剂盒进行四种病原菌的同步快速检测，具有特异性好、灵敏度高、重复性和稳定性好、检测时间短的优点，能够用于四种病原菌的同步快速定量检测。

附图说明

图1 三种病原菌同步检测流程图；

图2 免疫磁珠在不同添加量下检测病原菌的荧光图谱；

图3 免疫磁珠在不同反应时间下检测病原菌的荧光图谱；

图4 量子点荧光生物探针在不同反应用量下检测病原菌的荧光图谱；

图5 量子点荧光生物探针在不同反应时间下检测病原菌的荧光图谱；

图6 三种病原菌同步检测的标准曲线；

图7 牛奶样品中三种病原菌在不同浓度下的荧光图谱；

图8 牛奶样品中三种病原菌同步检测的标准曲线；

图9 羊肉样品中三种病原菌在不同浓度下的荧光图谱；

图10羊肉样品中三种病原菌同步检测的标准曲线；

图11白菜样品中三种病原菌在不同浓度下的荧光图谱；

图12白菜样品中三种病原菌同步检测的标准曲线。

具体实施方式

实施例1三价卵黄抗体（IgY）的制备

取-80℃保存的大肠杆菌 O157:H7、单增李斯特菌和布鲁氏菌菌株，活化后分别在 LA平板上划线，分离单个菌落，37℃培养18~24h后，挑取单个菌落，接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养至对数中期。取 1 mL 菌液采用平板倾注法进行活菌计数，加入终浓度为1 %的甲醛溶液室温灭活30min，4℃过夜。次日将灭活的菌液3000 rpm离心10min，弃上清，收集菌体，用生理盐水重悬菌体，制成菌悬液，并将三种菌的终浓度均调整为2×10¹⁰CFU·mL^-1，置于4℃冰箱中保存备用。同时采用平板倾注法检验细菌是否完全灭活。取上述制备的三种菌悬液，根据细菌计数结果按照1:1:1比例混合，并调整菌液终浓度为2×10⁹CFU·mL^-1。按照体积加入等量的弗氏完全佐剂/弗氏不完全佐剂，置于磁力搅拌器上搅拌至完全乳化，即油包水状态，4 ℃放置一周后乳剂不分层，方可作为疫苗免疫实验动物。

SPF级健康高产蛋鸡2只，置于负压双层不锈钢隔离饲养箱中饲养一周，记录产蛋情况，无异常后，采用肌肉多点注射的方式将上述三价疫苗接种于鸡胸，每只鸡每次接种疫苗体积为1mL。首次免疫采用弗氏完全佐剂疫苗，之后每隔两周采用弗氏不完全佐剂疫苗进行加强免疫。每次免疫前均于鸡翅静脉采血，离心分离血清，用于血清抗体效价水平的监测。收集鸡蛋，按照日期编号，置于4℃冰箱保存。采用 PEG 6000 沉淀法提取所收集鸡蛋的IgY，具体分离提取步骤如下：用自来水洗净鸡蛋表面的污渍，75%酒精擦拭消毒两次，轻轻打破蛋壳，使用蛋黄分离器对卵黄和卵白进行初步分离；将卵黄置于滤纸上，轻轻翻滚，除去残留于卵黄膜表面的卵白，刺破卵黄膜，收集卵黄液，记录卵黄液的体积；加入二倍卵黄体积的PBS缓冲液和3.5 % PEG-6000（w/v），震荡混匀10min后4℃10000rpm 离心20min，去除卵黄中的卵黄颗粒；过滤上清，将滤液转移至新的离心管中，记录上清液体积，加入 8.5% PEG-6000（w/v），震荡混匀 10 min 后，4℃10000 rpm离心20 min，弃上清；用10 mL PBS缓冲液重悬沉淀，加入 12 % PEG-6000（w/v），震荡混匀10 min，4℃10000 rpm离心20 min，弃上清，沉淀即为 IgY；用 1.0 mL PBS缓冲液重悬沉淀，将IgY溶液转移至透析袋中，置于0.1 %生理盐水搅拌透析过夜后，置于 PBS 缓冲液继续透析4小时，采用超滤离心管将得到的IgY溶液浓缩至1.5 mL。

采用上述优化好的间接 ELISA 方法分别测定三价血清大肠杆菌 O157:H7、单增李斯特菌和布鲁氏菌的抗体效价（见表1），结果表明，随着免疫时间的延长，免疫后蛋鸡的血清中逐渐出现抗三种病原菌的抗体，抗体效价呈不断升高的趋势，在免疫后第8周，抗体效价达到最高，并趋于稳定；采用 PEG 6000沉淀法提取卵黄中的三价IgY，采用上述优化好的间接ELISA方法测定 IgY 对三种病原菌的抗体效价（见表2），结果表明，随着免疫时间的延长，三价IgY逐渐出现，且对三种病原菌的效价也逐渐升高，在免疫后第10周，三价IgY对三种病原菌的抗体均基本达到最高，且不再降低；采用 BCA 蛋白定量试剂盒测定所有提取的三价IgY的蛋白含量，从卵黄中提取的三价IgY的蛋白含量约为5.73~21.03 mg·mL^-1，其中第10周所提取的三价IgY的蛋白含量最高，为21.03 mg·mL^-1，并用PBS缓冲液将其蛋白浓度调整为0.5mg/mL，-20℃保存备用；以第10周所提取的三价IgY作为待测样品，采用间接ELISA方法鉴定其特异性，如表3所示，结果表明所制备的三价 IgY 仅与副溶血弧菌（ATCC17802）出现了交叉反应，与金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）、鼠伤寒沙门氏菌（ATCC 13311）、粪链球菌（ATCC 14506）、肺炎克雷伯菌（亚种）（ATCC 35657）、布氏柠檬酸杆菌（ATCC43162）、鲍氏志贺氏菌（ATCC 9207）、粘质沙雷氏菌（ATCC 13880）、阴沟肠杆菌（JL 08011）和奇异变形杆菌（JL 08017）等菌株均没有交叉反应，特异性良好；本实验采用SDS-PAGE法对第10周所提取的三价 IgY 的纯度进行鉴定，结果表明所提取的 IgY 的纯度较高。

实施例2 兔多克隆抗体的制备

三种人兽共患病病原菌兔多克隆抗体的制备：分别取实施例1中制备的大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和布鲁氏菌菌悬液，加入等体积的弗氏完全佐剂/弗氏不完全佐剂，置于磁力搅拌器上搅拌至完全乳化，即油包水状态，待4℃放置一周后乳剂不分层，即可作为疫苗，用来免疫健康雌性新西兰大白兔，适应性饲养一周后，无异常，采用背部皮下多点注射法进行免疫。初次免疫采用弗氏完全佐剂疫苗，之后采用同等剂量的弗氏不完全佐剂疫苗每隔1周进行加强免疫1次，共加强免疫4次，每只兔每次免疫接种1mL疫苗。每次免疫前均于兔耳缘静脉采血，分离血清，用于监测血清抗体水平的变化。最后一次免疫结束后10天，行颈动脉插管，收集血液，3500 rpm 离心10min，收集血清，保存于-20℃备用。采用饱和酸铵盐析沉淀法从兔血清中提取兔多克隆抗体；采用间接 ELISA 方法分别测定免疫大肠杆菌O157:H7疫苗、单增李斯特菌疫苗和布鲁氏菌疫苗后的兔血清及多克隆抗体效价，表4为免疫后兔血清及抗体效价结果，结果显示随着免疫次数的增加，血清抗体效价逐渐升高，在最后一次免疫结束后10天，血清中抗体效价均达到1:256000，大肠杆菌 O157:H7 兔多克隆抗体的效价为1:128000，单增李斯特菌兔多克隆抗体的效价为1:512000，布鲁氏菌菌兔多克隆抗体的效价为1:2048000；表5、6分别为大肠杆菌O157:H7和单增李斯特菌兔多克隆抗体特异性结果，结果表明，所制备的大肠杆菌O157:H7多克隆抗体与金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、鲍氏志贺氏菌（ATCC 9207）和粘质沙雷氏菌（ATCC 13880）出现了交叉反应，与其他菌没有出现交叉反应，特异性良好，所制备的单增李斯特菌多克隆抗体与金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）出现了较强的交叉反应，与粪链球菌（ATCC 14506）和粘质沙雷氏菌（ATCC13880）出现了交叉反应，与其他菌没有交叉反应，特异性良好；采用 BCA 蛋白定量试剂盒测定所提取的两种兔多克隆抗体的蛋白含量，所提取的大肠杆菌 O157:H7多克隆抗体的蛋白含量为 29.06 mg·mL^-1，所提取的单增李斯特菌多克隆抗体的蛋白含量为 38.27 mg·mL^-1，所提取的布鲁氏菌多克隆抗体的蛋白含量为 39.08mg·mL^-1，并用PBS缓冲液将其蛋白浓度调整为0.5mg/mL，-20℃保存备用；采用 SDS-PAGE 电泳检测两种多克隆抗体的纯度，可以观察到明显的重链条带和轻链条带，纯度较高。

副溶血性弧菌兔克隆抗体IgG的制备：取浓度为1×10⁹ CFU·mL^-1灭活菌液与等量的弗氏完全佐剂/弗氏不完全佐剂乳化完全，制备灭活疫苗。首次免疫取浓度为1×10⁹CFU·mL^-1弗氏完全佐剂疫苗免疫健康新西兰大白兔（由吉林大学基础医学院实验动物中心提供），采用背部皮下多点注射法，每只免疫2 mL，在第二周、第三周采用同等剂量的弗氏不完全佐剂疫苗对兔进行第二次免疫、第三次免疫。10天后，用灭活菌液加强免疫两次。每次免疫前兔耳缘静脉取血，测定血清效价。达到分离标准，兔心脏采血，分离血清，得到抗副溶血性弧菌的抗血清。采用饱和硫酸铵盐析沉淀法对所述的抗血清中的多克隆抗体IgG进行纯化；采用间接ELISA法对纯化后抗体的效价和特异性进行测定，表7为免疫前后兔血清及抗体效价测定结果，结果显示，随着免疫次数的增加，血清抗体效价逐渐升高，最终获得的副溶血性弧菌兔多克隆抗体效价可以达到1:1024000；表8为兔多克隆抗体IgG特异性结果，结果显示，制备的抗体特异性较好；采用BCA蛋白定量试剂盒对纯化后的IgG抗体的浓度进行测定，并用PBS缓冲液将其蛋白浓度调整为1mg/mL，-20℃保存备用。

实施例3三价卵黄抗体（IgY）间接 ELISA方法

为了更加准确的测定收集的IgY的效价，建立了检测三价血清和卵黄抗体抗三种不同病原菌的间接ELISA反应方法，具体步骤为：

以大肠杆菌 O157:H7作为包被抗原时，将大肠杆菌O157:H7菌悬液用抗原包被液进行1:800稀释，按每孔100μL 包被于96孔酶标反应板中，37℃ 孵育1h，弃去板中液体，加入PBST 缓冲液，300μL/孔进行洗涤，每次3 min，洗涤3次；每孔加入300μL 5 % 脱脂奶粉，37℃孵育 2 h，重复上述洗涤步骤；加入待测三价血清或者抗体，100μL/孔，37℃孵育0.5 h，重复上述洗涤步骤；将 HRP 标记的山羊抗鸡二抗进行 1:5000 稀释，按100μL/孔加入到96 孔酶标反应板中，37℃孵育 0.5 h，重复上述洗涤步骤；按 100μL/孔加入底物显色液，室温避光显色 5 min；每孔加入 50μL 终止液终止显色反应；采用全波段酶标仪读取 OD₄₅₀值，并进行结果分析。

以单增李斯特菌作为包被抗原时，将单增李斯特菌菌悬液用抗原包被液进行1:50稀释，按每孔 100μL包被于 96 孔酶标反应板中，37℃孵育1h，弃去板中液体，加入 PBST缓冲液，300μL/孔，拍洗三次；每孔加入 300μL 1 % BSA，37℃ 孵育1h，重复上述洗涤步骤；加入待测三价血清或者抗体，100μL/孔，37℃孵育0.5 h，重复上述洗涤步骤；将 HRP 标记的山羊抗鸡二抗进行 1:15000 稀释，按 100μL/孔加入到 96 孔酶标反应板中， 37℃孵育0.5 h，重复上述洗涤步骤；按 100μL/孔加入底物显色液，室温避光显色 25 min；每孔加入50μL 终止液终止显色反应；采用全波段酶标仪读取 OD₄₅₀值，并进行结果分析。

以布鲁氏菌作为包被抗原，将布鲁氏菌菌悬液用抗原包被液进行 1:50 稀释，按每孔100μL包被于 96 孔酶标反应板中，37℃孵育1h，弃去板中液体，加入 PBST 缓冲液，300μL/孔，拍洗三次；每孔加入 300μL 0.1 % BSA，37℃孵育2 h，重复上述洗涤步骤；加入待测三价血清或者抗体，100μL/孔，37℃孵育0.5 h，重复上述洗涤步骤；将HRP标记的山羊抗鸡二抗进行 1:20000稀释，按100μL/孔加入到96孔酶标反应板中，37℃孵育0.5 h，重复上述洗涤步骤；按 100μL/孔加入底物显色液，室温避光显色5min；每孔加入 50μL 终止液终止显色反应；采用全波段酶标仪读取OD₄₅₀值，并进行结果分析。

实施例4 兔多克隆抗体间接 ELISA 方法

建立了检测大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和布鲁氏菌的兔多克隆抗体血清抗体效价的间接 ELISA反应条件，具体步骤为：

将大肠杆菌 O157:H7 以1:400用包被液稀释，按每孔100μL包被于酶标反应板中，4 ℃过夜，PBST洗板3次；加入 5 % 脱脂奶粉进行封闭，300μL/孔 37℃ 孵育 60 min，PBST洗板3 次；将待测血清或抗体加入到酶标反应板，100μL/孔，37℃孵育30 min，PBST 洗板 3 次；HRP 标记的山羊抗兔二抗以 1:15000 稀释后，按100μL/孔加入酶标反应板，37℃ 孵育30min，PBST 洗板3次；加入显色液，100μL/孔室温避光显色5 min；加入终止液，50μL/孔；利用全波段酶标仪读取 OD₄₅₀ 值，并进行结果分析。

将单增李斯特菌以 1:400用包被液稀释，按每孔 100μL 包被于酶标反应板中，4℃ 过夜，PBST 洗板3次；加入5% 脱脂奶粉进行封闭，300μL/孔 37 ℃ 孵育 60 min，PBST洗板3次；将待测血清或抗体加入到酶标反应板，100μL/孔，37℃ 孵育 30 min，PBST 洗板3次；HRP 标记的山羊抗兔二抗以 1:10000 稀释后按 100μL/孔加入酶标反应板，37℃孵育30 min，PBST 洗板3次；加入显色液，100μL/孔室温避光显色 25 min；加入终止液，50μL/孔；利用全波段酶标仪读取 OD₄₅₀ 值，并进行结果分析。

将布鲁氏菌以 1:400用包被液稀释，按每孔 100μL 包被于酶标反应板中，4℃ 过夜，PBST 洗板3次；加入5% 脱脂奶粉进行封闭，300μL/孔 37 ℃ 孵育 60 min，PBST洗板3次；将待测血清或抗体加入到酶标反应板，100μL/孔，37℃ 孵育 30 min，PBST 洗板3次；HRP 标记的山羊抗兔二抗以 1:10000 稀释后按 100μL/孔加入酶标反应板，37℃孵育 30min，PBST 洗板3次；加入显色液，100μL/孔室温避光显色 25 min；加入终止液，50μL/孔；利用全波段酶标仪读取 OD₄₅₀ 值，并进行结果分析。

实施例5 免疫磁珠的制备

采用 EDC 和NHS 作为催化剂，将羧基磁珠与三价IgY偶联，制备能够同时捕获大肠杆菌O157:H7 、单增李斯特菌、布鲁氏菌和副溶血性弧菌的免疫磁珠，具体制备方法为：取100μL 羧基磁珠，用200μL MEST 缓冲液磁分离洗涤磁珠2次，去除上清液，分别加入200μL EDC溶液（10 mg·mL^-1，MEST缓冲液配制）和 200 μL NHS 溶液（10 mg·mL^-1，PBS MEST配制），室温旋转混合30min，磁分离去除上清，收集已活化磁珠，用 PBS 缓冲液磁分离洗涤2次，加入200μL PBS 缓冲液重悬磁珠。取上述已经活化后的磁珠若干份，磁分离去除PBS缓冲液，分别加入不同蛋白量的三价IgY，并定容至200μL，室温置于旋转混合仪上反应 120 min，磁分离，收集上清，采用紫外可见光分光光度计测定上清液的A₂₈₀，同时测定反应前不同浓度抗体溶液的 A₂₈₀，采用公式1计算抗体偶联率。用 PBS 缓冲液洗涤磁珠2次，加入 200 μL0.1% BSA溶液（w/v，PBS缓冲液配制）封闭磁珠上未与抗体偶联的位点，室温旋转混合 60min，PBS 缓冲液磁分离洗涤2次，加入200μL PBS 缓冲液重悬磁珠，即得到免疫磁珠，4℃保存备用。

实施例6 四种量子点荧光生物探针的制备

采用 EDC和NHS 作为催化剂，将四种不同发射波长的荧光量子点分别与大肠杆菌O157:H7 兔多克隆抗体、单增李斯特菌兔多克隆抗体、布鲁氏菌和副溶血性弧菌兔多克隆抗体偶联，制备四种具有不同发射波长的量子点荧光生物探针。

1、绿色量子点荧光生物探针的制备

取30 μL绿色荧光量子点，加入200 μL EDC 溶液（10 mg·mL^-1, PBS 缓冲液配制）和200 μL NHS 溶液（10 mg·mL^-1, PBS缓冲液配制），室温旋转混合30 min活化量子点，12000rpm离心10 min，弃上清，收集沉淀，用PBS缓冲液离心洗涤2次。分别加入不同蛋白质量的大肠杆菌O157:H7兔多克隆抗体，用PBS缓冲液定容至 200 μL，置于旋转混合仪上反应 120min，12000 rpm离心10 min，收集上清，采用紫外-可见光分光光度计测定波长为280 nm处的吸光度值（A₂₈₀），同时测定反应前不同浓度抗体溶液的A₂₈₀，采用公式1计算抗体偶联率。用PBS离心洗涤沉淀2次，加入200μL 0.1% BSA溶液（w/v, PBS缓冲液配制）封闭量子点表面未与抗体偶联的位点，室温旋转混合 60 min，12000 rpm离心 10 min，弃上清，收集沉淀，用 PBS 缓冲液离心洗涤2次，用200 μL PBS缓冲液重悬沉淀，4℃保存备用。

2、黄色量子点荧光生物探针的制备

取45 μL黄色荧光量子点，加入200μL EDC溶液（10 mg·mL^-1, PBS缓冲液配制）和200μL NHS溶液（10mg·mL^-1, PBS缓冲液配制），室温旋转混合30 min活化量子点，12000 rpm离心10 min，弃上清，收集沉淀，用PBS缓冲液离心洗涤 2 次。分别加入不同蛋白质量的单增李斯特菌兔多克隆抗体，用PBS缓冲液定容至200μL，置于旋转混合仪上反应 120 min，12000 rpm离心10 min，收集上清，采用紫外可见光分光光度计测定A₂₈₀，同时测定反应前不同浓度抗体溶液的A₂₈₀，采用公式1计算抗体偶联率。用 PBS 缓冲液离心洗涤沉淀2次，加入200μL 0.1% BSA 溶液（w/v, PBS缓冲液配制）封闭量子点表面未与抗体偶联的位点，室温旋转混合60 min，12000rpm 离心10 min，弃上清，收集沉淀，用PBS缓冲液离心洗涤 2 次，用 200 μL PBS 缓冲液重悬沉淀，4℃保存备用。

3、红色量子点荧光生物探针的制备

取7 μL 红色荧光量子点，加入200 μL EDC溶液（10 mg·mL^-1, PBS缓冲液配制）和200μL NHS溶液（10 mg·mL^-1, PBS缓冲液配制），室温旋转混合 30 min活化量子点，12000 rpm离心10 min，弃上清，收集沉淀，用PBS缓冲液离心洗涤2次。分别加入不同蛋白量的布鲁氏菌兔多克隆抗体，用PBS缓冲液定容至200 μL，置于旋转混合仪上反应120min，12000 rpm离心10 min，收集上清，采用紫外可见光分光光度计测定 A₂₈₀，同时测定反应前不同浓度抗体溶液的A₂₈₀，采用公式1计算抗体偶联率。用 PBS 缓冲液离心洗涤沉淀 2 次，加入 200 μL0.1% BSA 溶液（w/v，PBS缓冲液配制）封闭量子点表面未与抗体偶联的位点，室温旋转混合60min，12000rpm离心10 min，弃上清，收集沉淀，用 PBS 缓冲液离心洗涤2次，用 200 μLPBS 缓冲液重悬沉淀，4℃保存备用。

4、蓝色量子点荧光生物探针的制备

取10 uL蓝色荧光量子点于1.5 mL棕色进样瓶中，加入用MEST缓冲液配制的5mg/mLEDC和NHS各200μL，漩涡混匀后，利用垂直混合仪在25℃下活化30min。活化结束后将溶液转移至微量离心管中，12000 rpm 离心5min。弃去上清并用PBST清洗1遍，活化后的量子点重悬于400μL的PBST中。加入所制备的副溶血性弧菌鸡卵黄抗体IgY 120μg，漩涡混匀后利用垂直混合仪在25℃下避光反应2 h。偶联反应结束后，将量子点溶液移至微量离心管中，12000 rpm 离心5min，弃去上清并用PBST清洗1遍。加入1mL 1%的BSA，涡旋混匀后利用垂直混合仪在25℃下继续避光孵育1h进行封闭。封闭结束后，将量子点溶液转移至1.5 mL的EP管中，12000 rpm 离心5min，弃去上清并用PBST清洗1遍。最后重悬于400μL的PBS溶液中，4℃保存备用。

实施例7 PBS 缓冲液的制备

PBS 缓冲液（0.01 mol·L^-1 pH 7.4）：分别称取 Na₂HPO₄·12H₂O 3.63 g、KH₂PO₄ 0.20g、NaCl 8.0 g、KCl 0.20 g，加蒸馏水定容至1000mL，调 pH为7.4 后，121℃高压灭菌 20min，4℃ 保存备用。

实施例8 三种病原菌混悬液的制备

将大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和布鲁氏菌菌悬液用 PBS 缓冲液稀释至1×10⁸CFU·mL^-1，各取1.0 mL，加入到7.0 mL PBS 缓冲液中混匀，最终三种病原菌混悬液中每种菌的浓度均为1×10⁷ CFU·mL^-1。以此菌悬液作为储备液，利用PBS缓冲液进行10倍倍比稀释，则可以得到三种菌浓度分别为1×10⁶ CFU·mL^-1、1×10⁵ CFU·mL^-1、1×10⁴ CFU·mL^-1、1×10³ CFU·mL^-1、1×10² CFU·mL^-1和 1×10¹ CFU·mL^-1的三种病原菌混悬液。

实施例9三种病原菌同步检测方法的建立

采用免疫磁珠和量子点荧光生物探针对待测样品中的大肠杆菌 O157:H7、单增李斯特菌和布鲁氏菌进行同步检测，检测流程图如图1所示。当待测样品中含有这三种病原菌时，会与免疫磁珠发生抗原-抗体反应，形成免疫磁珠-病原菌复合物，在外加磁场的作用下可将免疫磁珠-病原菌复合物从待测样品基质中分离出来。之后同时加入三种不同荧光发射波长的量子点荧光生物探针，量子点荧光生物探针表面的兔多克隆抗体会与相应的病原菌发生特异性结合，形成免疫磁珠-病原菌-量子点荧光生物探针复合物，采用荧光分光光度计测定对应荧光发射峰的荧光信号，进而实现对三种病原菌的定量检测。当待测样品中仅含有其中一种病原菌或任意组合的两种病原菌时，则能够在相应荧光发射峰的位置检测到荧光强度，进而实现单一病原菌或任意两种病原菌的定量检测。当待测样品中不含有这三种病原菌时，则不会形成免疫磁珠-病原菌复合物和免疫磁珠-病原菌-量子点荧光生物探针复合物，通过磁分离洗涤除去未能参加反应的量子点荧光生物探针后，最终无法检测到荧光信号或者荧光信号强度相对较低。为了获得最佳检测效果，对免疫磁珠用量、免疫磁珠富集时间、量子点荧光生物探针用量和反应时间进行优化。

1. 免疫磁珠反应用量的优化

分别取 25μL、50μL、100μL、150μL、200μL、300μL、400μL和500μL的免疫磁珠，加入100μL三种菌液浓度均为1×10⁵ CFU·mL^-1的混悬液，置于旋转混合仪上室温反应 60 min，磁分离去除上清，PBS 缓冲液洗涤磁珠-病原菌复合物两次后，同时加入三种量子点荧光生物探针各200μL，继续反应60 min，磁分离去除上清，PBS缓冲液洗涤磁珠-病原菌-量子点荧光生物探针复合物两次后，加入200μL PBS 缓冲液重悬磁珠-病原菌-量子点荧光生物探针复合物，采用荧光分光光度计测定激发波长为380 nm 时的发射图谱，并记录三个不同荧光发射峰的荧光强度。荧光图谱如图2所示，随着加入的免疫磁珠用量增加，荧光强度均出现了先升高后降低的趋势，当加入的免疫磁珠为50μL时，三个荧光发射峰的荧光强度均最高，且三个峰的峰位置相互分离。因此，选择50μL作为免疫磁珠的最佳用量。

2. 免疫磁珠反应时间的优化

取最佳用量的的免疫磁珠8份，加入 100μL三种菌液浓度均为1×10⁵ CFU·mL^-1的混悬液，分别置于旋转混合仪上反应15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min和120 min，磁分离去除上清，PBS缓冲液洗涤磁珠-病原菌复合物两次后，同时加入三种量子点荧光生物探针各 200μL，继续反应 60min，磁分离去除上清，PBS 缓冲液洗涤磁珠-病原菌-量子点荧光生物探针复合物两次后，加入200μL PBS缓冲液重悬磁珠-病原菌-量子点荧光生物探针复合物，采用荧光分光光度计测定激发波长为 380 nm时的发射图谱，并记录三个不同荧光发射峰的荧光强度。荧光图谱如图3所示，随着免疫磁珠反应时间的延长，荧光强度先升高后降低，当反应时间为60min时，荧光强度最强，且三个峰的峰位置相互分离。因此，选择60min 作为免疫磁珠的最佳富集时间。

3. 量子点荧光生物探针反应用量的优化

取最佳用量的的免疫磁珠8份，加入100μL上述三种病原菌的混悬液，置于旋转混合仪上反应最佳时间，磁分离去除上清，PBS 缓冲液洗涤磁珠-病原菌复合物两次后，同时加入等体积的三种量子点荧光生物探针，每种量子点荧光生物探针的体积分别为25μL、50μL、100μL、150μL、200μL、300μL、400μL和 500μL，继续反应60min，磁分离去除上清，PBS 缓冲液洗涤磁珠-病原菌-量子点荧光生物探针复合物两次后，加入 200μL PBS 缓冲液重悬磁珠-病原菌-量子点荧光生物探针复合物，采用荧光分光光度计测定激发波长为380 nm时的发射图谱，并记录三个不同荧光发射峰的荧光强度。荧光图谱如图4所示，随着量子点荧光生物探针用量增加，荧光强度出现了先急剧升高后平缓的趋势，当加入的三种量子点荧光生物探针的体积均为 200μL 时，三个荧光发射峰的荧光强度均较高且相差最小，三个荧光发射峰的峰位置相互分离。因此，选择 200μL作为量子点荧光生物探针的最佳用量。

4. 量子点荧光生物探针反应时间的优化

取最佳用量的免疫磁珠8份，加入100μL上述三种病原菌的混悬液，置于旋转混合仪上反应最佳时间，磁分离去除上清，PBS缓冲液洗涤磁珠-病原菌复合物两次后，同时加入等体积的三种量子点荧光生物探针，继续反应不同时间，分别设置反应时间为15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min 和120 min，磁分离去除上清，PBS 缓冲液洗涤磁珠-病原菌-量子点荧光生物探针复合物两次后，加入200μL PBS缓冲液重悬磁珠-病原菌-量子点荧光生物探针复合物，采用荧光分光光度计测定激发波长为380nm时的发射图谱，并记录三个不同荧光发射峰的荧光强度。荧光图谱如图5所示，随着量子点荧光生物探针标记时间的延长，荧光强度先急剧升高后变得平缓，当反应时间为 60 min 时，三个荧光发射峰的荧光强度均较高且相差最小，三个发射峰的峰位置相互分离。因此，选择 60 min 作为量子点荧光生物探针的最佳标记时间。

5. 三种病原菌同步检测方法的效果评价

（1）检测限的测定

取若干份 50 μL 的免疫磁珠，加入 150 μL PBS 缓冲液将体积补充至 200 μL 后，加入 100 μL从 10⁷ CFU·mL^-1到 10¹ CFU·mL^-1十倍比稀释的四种病原菌菌悬液，同时设不加病原菌的空白对照，置于旋转混合仪上室温反应 60 min，用 PBS 缓冲液磁分离洗涤三次，去上清，加入四种量子点荧光生物探针各 200 μL，室温旋转混合反应 60 min，用 PBS缓冲液磁分离洗涤三次，去上清，最终用 200 μL PBS 缓冲液重悬反应产物，采用荧光分光光度计测定荧光强度，记录荧光值，并进行结果分析。检测限的判定标准：以空白样品荧光强度的2.1倍作为阳性检测结果的判定标准，大于空白样品荧光强度的2.1倍所对应的最低病原菌稀释浓度为本方法的检测限。结果如图6和表9所示，所建立的检测方法线性良好，对大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌、布鲁氏菌和副溶血性弧菌的最低检测限（Limits ofdetection, LODs）依次为 10³ CFU·mL^-1、10³ CFU·mL^-1、10⁴ CFU·mL^-1、10⁴ CFU·mL^-1。

（2）准确度实验

采用加标回收实验评价所建立的检测方法分别对大肠杆菌 O157:H7、单增李斯特菌和布鲁氏菌检测的准确度，具体操作如下：取若干份免疫磁珠，分别加入浓度为 10⁵ CFU·mL^-1的三种病原菌的菌悬液，按照建立好的检测程序进行检测，采用荧光分光光度计测定荧光强度，计算加标回收率。当加入大肠杆菌 O157:H7 浓度为 10⁵CFU·mL^-1时，测得的荧光光强度为249.172，计算得大肠杆菌 O157:H7 的浓度为10^4.96 CFU·mL^-1，回收率为 91.20%；当加入单增李斯特菌浓度为 10⁵ CFU·mL^-1时，测得的荧光光强度为 312.583，计算得单增李斯特菌的浓度为 10^5.09 CFU·mL^-1，回收率为109.65 %；当加入布鲁氏菌浓度为 10⁵CFU·mL^-1时，测得的荧光光强度为 271.907，计算得布鲁氏菌的浓度为 10^4.97 CFU·mL^-1，回收率为 93.33 %，三种病原菌的回收率均处于 90 % ~ 110 % 范围内，说明方法的准确度良好，具体结果见表10。

（3）重复性实验

分别用建立好的检测程序检测浓度为 10⁵ CFU·mL^-1和 10⁶ CFU·mL^-1的三种病原菌的混悬液，每次实验设定三个平行样品，平行进行三次实验，测定荧光强度，计算变异系数（Coefficient of Variation, CV）。所得到的变异系数均低于 10 %，说明结果所建立的检测方法稳定性较好，具体结果见表11。

（4）特异性实验

取拟进行交叉反应的菌株，包括副溶血弧菌（ATCC 17802）、金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、鼠伤寒沙门氏菌（ATCC 13311）、粪链球菌（ATCC 14506）、布氏柠檬酸杆菌（ATCC43162）、鲍氏志贺氏菌（ATCC 9207）、粘质沙雷氏菌（ATCC 13880）、阴沟肠杆菌（JL 08011）和奇异变形杆菌（Proteus mirabilis, JL08017），用 PBS 缓冲液调整菌悬液浓度为 1×10⁵CFU·mL^-1。取若干份50μL的免疫磁珠，加入150μL PBS 缓冲液将体积补充至200μL后，分别加入上述病原菌的菌悬液，同时设不含任何病原菌的PBS缓冲液作为空白对照，设定同时含有三种病原菌的混悬液作为阳性对照，按照已优化的检测条件进行检测，采用荧光分光光度计测定荧光强度，记录荧光值，进行结果分析。结果见表12，采用荧光值/空白荧光 ≥2.1 作为阳性结果的判定标准，结果表明所建立的检测方法与粘质沙雷氏菌（ATCC 13880）有交叉反应，与其他菌株均没有交叉反应，说明所建立的三种病原菌同步快速检测方法特异性较好。

实施例10 试剂盒的制备

由实施例5所描述的免疫磁珠、实施例6所描述的三种量子点荧光生物探针、实施例7所描述的缓冲液、实施例8所描述的三种病原菌混悬液的同步快速检测三种病原菌的试剂盒。

实施例11 模拟样品的检测

1. 牛奶模拟样的制备及检测

从超市购买超高温灭菌纯牛奶用于制备牛奶模拟样，具体为用纯牛奶作为稀释液，配制浓度为10⁷CFU·mL^-1、10⁶ CFU·mL^-1、10⁵CFU·mL^-1、10⁴CFU·mL^-1、10³CFU·mL^-1、10²CFU·mL^-1 和 10¹CFU·mL^-1系列稀释的三种病原菌的菌悬液，同时采用不添加任何细菌的纯牛奶作为空白对照，利用所建立的检测方法进行检测，采用荧光分光光度计测定荧光强度，荧光图谱如图7所示，随着加入菌液浓度的增加，荧光强度逐渐升高。以病原菌浓度的对数作为横坐标，以荧光强度作为纵坐标，绘制所建立的检测方法检测三种病原菌的标准曲线，并计算检测限，结果如图8和表13所示，所建立的检测方法线性良好，对大肠杆菌 O157:H7、单增李斯特菌和布鲁氏菌的最低检测限均为10³ CFU·mL^-1。

2. 羊肉模拟样的制备及检测

从超市购买羊肉，称取10g加入到10mL生理盐水中，4℃浸泡24h，过滤收集浸出液，用浸出液作为稀释液，将大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌及布鲁氏菌进行稀释，用羊肉浸出液作为稀释液，配制浓度为10⁷CFU·mL^-1、10⁶CFU·mL^-1、10⁵CFU·mL^-1、10⁴CFU·mL^-1、10³CFU·mL^-1、10²CFU·mL^-1和10¹CFU·mL^-1系列稀释的三种病原菌的菌悬液，同时采用不添加任何细菌的羊肉浸出液作为空白对照，采用所建立的检测方法进行检测，利用荧光分光光度计测定荧光强度。荧光图谱如图9所示，随着加入菌液浓度的增加，荧光强度逐渐升高。以病原菌浓度的对数作为横坐标，以荧光强度作为纵坐标，绘制所建立的检测方法检测三种病原菌的标准曲线，并计算检测限，结果如图10和表14所示，所建立的检测方法线性良好，对大肠杆菌 O157:H7、单增李斯特菌和布鲁氏菌的最低检测限依次为 10⁴ CFU·mL^-1、10³ CFU·mL^-1 和 10⁴ CFU·mL^-1。

3. 白菜模拟样的制备及检测

从超市购买大白菜一颗，剪碎后放入注射器中，挤压注射器，收集白菜汁，用菜汁作为稀释液，用白菜汁作为稀释液，配制浓度为10⁷CFU·mL^-1、10⁶CFU·mL^-1、10⁵CFU·mL^-1、10⁴CFU·mL^-1、10³CFU·mL^-1、10²CFU·mL^-1和10¹CFU·mL^-1系列稀释的三种病原菌的菌悬液，同时采用不添加任何细菌的白菜汁作为空白对照，采用所建立的检测方法进行检测，采用荧光分光光度计测定荧光强度。荧光图谱如图11所示，随着加入菌液浓度的增加，荧光强度逐渐升高。以病原菌浓度的对数作为横坐标，以荧光强度作为纵坐标，绘制所建立的检测方法检测三种病原菌的标准曲线，并计算检测限，结果如图12和表15所示，所建立的检测方法线性良好，对大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和布鲁氏菌的最低检测限依次为10³CFU·mL^-1、10⁴CFU·mL^-1和10⁵ CFU·mL^-1。

Claims

1.多种人兽共患病病原菌的同步快速检测试剂盒，它包括：免疫磁珠、量子点荧光生物探针，其特征在于：所述的免疫磁珠是羧基化磁珠用EDC和NHS活化后，与三价卵黄抗体IgY偶联；所述的量子点荧光生物探针是不同颜色的荧光量子点，分别与不同的兔多克隆抗体偶联；

所述的三价卵黄抗体IgY是将大肠杆菌 O157:H7、单增李斯特菌和布鲁氏菌灭活后，免疫SPF鸡获得的。

2.根据权利要求1所述的多种人兽共患病病原菌的同步快速检测试剂盒，所述的荧光量子点的荧光发射波长分别为539 nm、583 nm 和 634 nm。

3.根据权利要求1或2所述的多种人兽共患病病原菌的同步快速检测试剂盒，其特征在于：它还包括抗副溶血弧菌兔多克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的多种人兽共患病病原菌的同步快速检测试剂盒，其特征在于：所述的荧光量子点为绿色、黄色、红色或蓝色荧光量子点。

5.根据权利要求4所述的多种人兽共患病病原菌的同步快速检测试剂盒，其特征在于：所述的兔多克隆抗体IgG蛋白浓度为0.5mg/mL。

6.根据权利要求5所述的多种人兽共患病病原菌的同步快速检测试剂盒，其特征在于：所述的鸡卵黄抗体IgY是采用PEG6000法进行纯化的。

7. 根据权利要求6所述的多种人兽共患病病原菌的同步快速检测试剂盒，其特征在于：所述的荧光量子点为CdSe/ZnS 量子点。