CN106645718B - 一种病原性副溶血弧菌快速检测试纸 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种病原性副溶血弧菌快速检测试纸，其中硝酸纤维素膜上从靠近金标垫一侧开始设有依次排列的四条检测线T1、T2、T3、T4和一条质控线C，其中四条检测线T1、T2、T3、T4分别是副溶血弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外产物和全菌破碎蛋白；靠近吸水垫的质控线C为羊抗兔IgG。本发明提取病原菌多种抗原蛋白特异地排列组合起来，在试纸上与待检测样品同时进行反应，并在检测线T4上特别设置了全菌破碎蛋白，解决了其他菌的共同抗原导致的免疫交叉反应干扰结果判定的问题，可以准确地区分阳性结果和交叉反应。

Description

一种病原性副溶血弧菌快速检测试纸

技术领域

本发明属于病原微生物检测制品技术领域，具体涉及一种水产动物病原性副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的快速检测试纸。

背景技术

副溶血弧菌是一种革兰氏阴性嗜盐菌，广泛分布于盐湖以及鱼、虾蟹和贝类等海产品中，食用被副溶血弧菌污染的食物可引起肠胃功能紊乱、急性肠胃炎、败血病等疾病，是常见的引起食物中毒或食源性疾病的病原菌。副溶血弧菌属于弧菌属，已报道的海水养殖动物病原弧菌有20多种，由于近年来养殖水域生态变化，弧菌已成为海水养殖动物的主要病原菌之一，且常发生多种(血清型或亚种)弧菌的混合感染，其中副溶血弧菌与哈维氏菌弧菌、溶藻弧菌是海洋生物尤其是海水鱼类弧菌病的主要致病菌，给水产养殖业造成巨大经济损失。有效快速的检测诊断是及早预防和控制该病原菌传播以及食源性中毒与疾病发生的关键。

目前常用的副溶血弧菌的检测方法有免疫酶联反应、环介导等温扩增技术(LAMP)、聚合酶链式反应(PCR)、实时定量PCR等，但这些技术在实用性上皆有一定的局限，耗时长，操作复杂，需要专业设备和技术人员，不适用于普通养殖人员在现场对副溶血弧菌的实时检测。胶体金免疫层析试纸具有易于携带、操作简便快捷、结果肉眼可见、不需要专业人员和设备、经济实用等优点，是一种十分有发展前景的现场快速检测技术，近年来在生物医学领域特别是医学检验中得到广泛应用。水产动物中虽已制备多种养殖动物病原的单(多)克隆抗体，但现场快速检测试纸技术未能得到很好地开发，目前仅有几种病毒性和细菌性病原的快速检测试纸，尚无副溶血弧菌胶体金快速检测试纸。

细菌是多种抗原成分组成的复合体，其抗原包括菌体抗原、鞭毛抗原、荚膜抗原和菌毛抗原等，可诱导机体产生抗体，因此，可利用抗原-抗体特异性反应原理以达到确诊病原的目的。但是，因分类地位相近，弧菌间甚至弧菌与其他属病原菌之间常具有共同的抗原性蛋白，导致不同菌之间存在交叉免疫反应性，从而对检测结果的准确判定造成干扰，因此，排除其他菌的交叉反应的干扰而准确判定某种病原菌感染是免疫学技术检测病原时需要解决的关键问题。通常的解决方案是通过筛选病原菌独有的抗原成分或特异性抗体，但是共同抗原的存在增加了筛选难度，工作量较大。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便、快速、特异性强的水产动物病原性副溶血弧菌快速检测试纸，其检测结果肉眼可见，不需要专业仪器设备，适用于养殖现场的虾类、蟹类、鱼类等病原性副溶血弧菌的快速检测。

本发明提供的病原性副溶血弧菌快速检测试纸，包括载体板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫和吸水垫位于载体板的两端，硝酸纤维素膜位于载体板的中部；样品垫与硝酸纤维素膜交界处设有载有金标兔抗副溶血弧菌抗体的金标垫，金标垫一端边缘重叠在样品垫之下，另一端边缘重叠在硝酸纤维素膜之上；硝酸纤维素膜上从靠近金标垫一侧开始设有依次排列的四条检测线T1、T2、T3、T4和一条质控线C，其中四条检测线T1、T2、T3、T4分别是副溶血弧菌的外膜蛋白(T1)、鞭毛蛋白(T2)、胞外产物(T3)和全菌破碎蛋白(T4)；靠近吸水垫的质控线C为羊抗兔IgG。

所述的兔抗副溶血弧菌抗体，制备方法如下：

将副溶血弧菌扩大培养，并将病原菌浓度调至1×10⁸CFU/mL，福尔马林灭活后，分4次免疫纯种新西兰大白兔；第一次混入弗氏完全佐剂，背部皮下注射免疫，间隔一周后加强免疫，将副溶血弧菌与弗氏不完全佐剂混匀，背部皮下注射免疫，间隔两周后重复一次；最后一次于耳缘静脉免疫，一周后取血，分离得到血清，辛酸-硫酸铵法纯化得到兔抗副溶血弧菌抗体。

所述副溶血弧菌外膜蛋白，制备方法如下：

副溶血弧菌扩大培养，离心后磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤、重悬至原体积1/25，加入少量10％蔗糖，混匀后-20℃下作用15min；室温下加入等体积0.4％Triton-X100，作用一段时间后离心取上清，加入2.5倍体积冰乙醇-20℃过夜；离心取沉淀，洗涤重悬后，加入等体积KI溶液，37℃作用1h；离心取上清，加入2.5倍体积冰乙醇-20℃过夜；离心取沉淀，重悬后透析、冻干得到副溶血弧菌外膜蛋白。

所述的副溶血弧菌鞭毛蛋白，制备方法如下：

副溶血弧菌扩大培养，离心后PBS洗涤、重悬至原体积1/20，用1mol/L HCl调整pH＝2.0，搅拌30min；低温离心取上清，然后低温超高速离心再取上清；用1mol/L NaOH调整pH中性，加入(NH₃)₂SO₄，4℃放置过夜；低温超高速离心，取沉淀，重悬后透析、冻干得到副溶血弧菌鞭毛蛋白。

所述的副溶血弧菌胞外产物，制备方法如下：

将副溶血弧菌接种于液体培养基中培养24h，取液体培养物涂布于预先放置了一层玻璃纸的固体琼脂平板上，37℃培养36h；每平板用少量PBS洗下菌体，收集后4℃下高速离心；上清液经微孔滤膜过滤，加入(NH₄)₂SO₄，4℃放置过夜；低温离心取沉淀，重悬后透析、冻干得到副溶血弧菌胞外产物。

所述的副溶血弧菌全菌破碎液，制备方法如下：

副溶血弧菌扩大培养，将菌液置于超声波破碎仪中低温破碎10min，所得即为全菌破碎液，冻干得到副溶血弧菌全菌破碎蛋白。

本发明提取病原菌多种抗原蛋白特异地排列组合起来，在试纸上与待检测样品同时进行反应，并在检测线T4上特别设置了全菌破碎蛋白，解决了其他菌的共同抗原导致的免疫交叉反应干扰结果判定的问题，可以准确地区分阳性结果和交叉反应。

附图说明

图1：本发明副溶血弧菌快速检测试纸条的结构示意图。

1.样品垫；2.金标垫；3.硝酸纤维素膜；4.吸水垫；5.载体底板；6.检测线T1；7.检测线T2；8.检测线T3；9.检测线T4；10.质控线C。T1、T2、T3、T4线分别为外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外产物和全菌蛋白。C线为羊抗兔IgG。

图2：本发明副溶血弧菌快速检测试纸条的检测结果示意图。

Ⅰ：副溶血弧菌阳性结果；Ⅱ：副溶血弧菌阴性结果；Ⅲ：副溶血弧菌阴性结果，但有其他菌的免疫交叉反应；Ⅳ：试纸失效或本次操作出现问题。

图3：本发明副溶血弧菌快速检测试纸检测5种弧菌的结果图。

Ⅰ：鳗弧菌检测结果；Ⅱ：鱼肠弧菌检测结果；Ⅲ：溶藻弧菌检测结果；Ⅳ：哈维氏弧菌检测结果；Ⅴ：PBS检测结果；Ⅵ：副溶血弧菌检测结果。

图4：本发明副溶血弧菌快速检测试纸最低检测限图。

图5：本发明的实施例5中试纸条实际应用的检测结果图。

具体实施方式

申请人在研究中发现，副溶血弧菌的鱼抗血清与其外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外产物和全菌蛋白皆发生特异性反应，说明这些蛋白具有较好的抗原性；另外，其鱼抗血清与副溶血弧菌反应最强烈，但与鳗弧菌、溶藻弧菌、鱼肠道弧菌、河流弧菌和哈维氏弧菌等其他弧菌存在程度不等的交叉反应，这是因为其他弧菌与副溶血弧菌具有某些共同抗原，共同抗原在免疫检测过程中会导致交叉反应，从而对阳性结果的判定造成干扰。

副溶血弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外产物和全菌蛋白全部能够同时与副溶血弧菌的抗血清发生阳性反应，但其他菌的抗血清只能与共同抗原发生阳性反应，因此，所有抗原全部发生反应即为阳性，部分抗原发生反应则为交叉反应，依此可以准确排除交叉反应对阳性结果的干扰，保证检测结果的准确性。

在上述分析的结果上，申请人将副溶血弧菌四种特异性抗原组分作为试纸条的四条检测线，其中，T4检测线特别设计为全菌蛋白，如果待测样品中含有副溶血弧菌，则与检测线上的四种抗原竞争结合金标垫上的金标兔抗副溶血弧菌抗体，待测样品液扩散到金标垫时，金标兔抗副溶血弧菌抗体与待检样品中副溶血弧菌结合，形成金标抗体-菌复合物，并封闭金标抗体中副溶血弧菌特异性抗原的结合位点，阻止金标抗体与硝酸纤维素膜上检测线T1、T2、T3和T4上的抗原蛋白结合，则T1-T4线皆无红色条带出现，结果为阳性；当复合物扩散至质控线(C线)处，被该处的羊抗兔IgG所俘获，聚集而形成肉眼可见的条带。相反，若待测样品中不含有副溶血弧菌，待测样品液扩散至金标垫时未形成金标抗体-菌复合物，金标抗体与T1、T2、T3和T4线上的四种抗原反应而形成肉眼可见的条带，4条检测线全部显色，结果为阴性。如果待测样品中含有其他具有共同抗原的病原菌，金标副溶血弧菌抗体与其共同抗原结合形成金标抗体-菌复合物，则T1-T3线中1-3条线因含有的共同抗原不与金标副溶血弧菌抗体反应而颜色变浅或者不显色，由于T4线上特别设置了副溶血弧菌全菌蛋白，其中含有的共同抗原不与金标副溶血弧菌抗体反应，从而T4线颜色变浅，但是T4线上还含有除共同抗原以外的副溶血弧菌其他抗原蛋白，其与金标抗体反应从而使T4线一定显现红色，因此，只要出现C线及T4线显色、T1-T3线中1条或几条线不显色，则检测结果为其他菌的交叉反应。本发明通过在检测层上设置副溶血弧菌的多种抗原组分作为多条检测线，其中T4检测线上特别设置全菌蛋白，实现在无需筛选副溶血弧菌特有抗原/抗体、不排除掉其他病原菌可能含有的共同抗原的情况下，准确鉴别副溶血弧菌阳性结果与交叉反应；尤其在其他病原菌与副溶血弧菌含有多种共同抗原情况下，因在T4线上设置全菌蛋白而确保将交叉反应与副溶血弧菌阳性进行准确鉴别。

一、本发明的试纸的制备方法如下：

(1)金标垫的制备

①胶体金及金标兔抗的制备

采用微波炉-柠檬酸三钠还原法制得颗粒大小为20nm的胶体金，用0.1mol/L碳酸钾溶液调节胶体金pH值为8.4；将兔抗副溶血弧菌按合适的比例加入胶体金中，再加入BSA，离心纯化后用金标保存液悬起，即为金标兔抗液体。

②金标垫的制备

将制成的金标兔抗液体喷涂在玻璃纤维上，并冷冻干燥。

(2)硝酸纤维素膜的检测层设计与制备

检测层是根据抗原芯片原理设计。利用抗原芯片法原理，将病原菌的多种抗原组分排列在一起与病原菌抗体同时进行反应，则该菌的所有抗原成分皆与该菌的抗体发生阳性反应，而其他菌只有共同抗原与该菌抗体发生交叉反应，可以依此区分病原菌感染与交叉反应，所以检测层设计为病原菌多种抗原组分同时使用。另外，考虑到所检测病原菌与其他菌含有多种共同抗原的情况，特别设置一条检测线使其一定含有除共同抗原以外的抗原组分，以便能够准确区别交叉反应与阳性结果。由此，分别将不同浓度的副溶血弧菌四种抗原组分，按照一定间距和一定顺序喷涂于硝酸纤维膜上作为检测线T1、T2、T3和T4，且T4线特别设置为全菌破碎蛋白；将羊抗兔IgG喷涂于硝酸纤维膜上作为质控线；晾干，于封闭液中浸泡后洗涤并干燥。

(3)副溶血弧菌快速检测试纸的制作

在载体板上依次贴上硝酸纤维素膜、吸水垫、金标垫和样品垫，再用切条机切成3.75mm宽的试纸条，装入塑料卡盒后，密封于铝箔袋中保藏。

二、在本发明中，副溶血弧菌快速检测试纸的最低检测限的研究方法如下：

将纯化好的病原菌用PBS调至四个浓度梯度，用副溶血弧菌快速检测试纸检测菌液。当某个浓度时，检测线T1-T4出现全部或部分显色，则这个浓度的高一级浓度为检测试纸的最低检测限。

三、在本发明中，副溶血弧菌快速检测试纸的检测副溶血弧菌四种抗原蛋白的特异性并确定抗原划线浓度的操作如下：

将制备好的四种副溶血弧菌抗原蛋白包被96孔酶标板中，每个蛋白设三个平行，并以无菌PBS作为阴性对照，4℃过夜。吸出包被液，用含0.05％Tween-20的PBS洗涤，每次5min，洗3次。每孔加入3％牛血清白蛋白(BSA)，37℃封闭1h，洗涤3次。每孔加入兔抗溶藻弧菌抗体(1:2000稀释)，37℃孵育1h，洗涤3次。每孔加入碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG(1:8000稀释)，37℃孵育1h，洗涤3次。每孔加入底物显色液于暗处反应10-20min，加入NaOH溶液终止显色反应，检测405nm处的OD值。

以包被PBS为阴性对照，测定波长为405nm时各孔的光吸收值，计算各实验孔与阴性对照的光吸收值之比(P/N)，当P/N≥2.1时为阳性，计算四种抗原蛋白间的P/N比值，并根据结果确定副溶血弧菌快速检测试纸检测层四条检测线的划线浓度比例。

四、利用副溶血弧菌快速检测试纸对待测样品进行检测，步骤如下：平放本发明试纸检测卡，向样品孔中滴加检测样品液100μl，等待10～15min，肉眼观察检测结果，根据检测线T1、T2、T3和T4显色情况来判断是否感染副溶血弧菌。

检测结果判定：

Ⅰ：C线呈现红色条带，T1、T2、T3、T4线皆不显色，结果为副溶血弧菌阳性；

Ⅱ：C线呈现红色条带，T1、T2、T3、T4线皆出现红色条带，结果为副溶血弧菌阴性，或者该菌浓度低于试纸检测限；

Ⅲ：C线呈现红色条带，T4检测线显红色，T1、T2、T3线中1-3条线不显色，结果为副溶血弧菌阴性，但感染了与副溶血弧菌抗原存在交叉反应的其他病原菌，结果判定为其他菌的交叉反应。

Ⅳ：C线不显色，试纸失效或本次操作出现问题，检测结果无效。

下面通过具体实施例来进一步说明本发明。

实施例中所需仪器以及试剂：

冷冻离心机(Sigma公司)；高速冷冻离心机(美国Beckman公司)；超高速离心机(日本Hitachi公司)；喷膜仪XYZ3060(Biodot公司)；半自动贴膜仪LM5000(Biodot公司)；切条仪(Biodot公司)；柠檬酸三钠(购自中国上海试剂一厂，分析纯)；氯金酸(购自Sigma公司，分析纯)，羊抗兔IgG(购自索莱宝公司)；牛血清白蛋白(购自Sigma公司)；Tween-20(购自索莱宝公司)；硝酸纤维素膜(购自Whatman公司)。

实施例1：副溶血弧菌快速检测试纸金标垫的制备

1.兔抗副溶血弧菌抗体的制备、纯化及效价测定

(1)兔抗副溶血弧菌抗体的制备

①37℃下将副溶血弧菌扩大培养24h，0.01mol/L无菌PBS洗涤3次，重悬菌液，调整至1×10⁸CFU/mL。向菌液中加入一定量的福尔马林，灭活24h。次日取菌液平板划线检查灭活程度。

②分四次免疫新西兰大白兔，每次间隔一周。第一次免疫，取菌液按照1:2(v:v)混合弗氏完全佐剂，背部6点注射，每点0.2mL。第二次免疫，取菌液按照1:2(v:v)混合弗氏不完全佐剂，背部6点注射，每点0.2mL。后两次免疫不加佐剂，每次注射0.6mL菌液。

③第四次免疫一周后，心脏穿刺取全血。取血后，室温下倾斜放置1h，4℃静置过夜。次日，4℃下10,000×g离心15min，弃沉淀，获得血清。

(2)兔抗副溶血弧菌抗体的纯化

①向血清加入4倍体积0.06mol/L pH＝4.0醋酸缓冲液，用0.01mol/L NaOH调整血清稀释液至pH＝4.5。

②室温下边搅拌边缓慢滴加正辛酸，加入量为每1mL血清稀释液加25μL正辛酸，滴加后继续搅拌30min。

③4℃下10,000×g离心30min，弃沉淀，收集上清液。上清液用0.45pm微孔滤膜除去悬浮物后，量体积。

④按照10％体积加入0.1mol/L无菌PBS，并用5mol/L NaOH调整pH＝7.4。

⑤上清液4℃遇冷后测量液体总体积，保持4℃下按照277g/L缓慢加入(NH₄)₂SO₄粉末(终浓度达45％饱和度)边加便搅拌，加完后继续搅拌30min，4℃静置过夜。

⑥次日4℃下10,000×g离心15min，弃上清，收集沉淀。沉淀用少量0.01mol/L PBS溶解(为原血清体积的1/10)，透析24h，中途需更换两次透析液。冻干，称重，并调至合适浓度，保存于-80℃。

(3)抗体效价测定

酶标板每孔加入100μL 5×10⁷CFU/mL副溶血弧菌菌液包被过夜。次日弃去板内液体，用含0.05％Tween-20的0.01mol/L磷酸缓冲液(PBST，pH＝7.4)洗涤酶标板，每孔加入200μL 3％牛血清白蛋白(BSA)，37℃封闭1h；洗涤酶标板，依次加入100μL梯度稀释的兔抗副溶血弧菌抗体(表1)，设置3个平行，阴性对照加100μL 0.01mol/L PBS，37℃孵育1h；用PBST洗涤酶标板，每孔加入100μL AP标记羊抗兔IgG抗体37℃孵育1h；洗涤酶标板，每孔加入200μL底物显色液(含1mg/mL pNPP，0.5mol/L氯化镁以及体积比为10％的二乙醇胺)避光发色5min，用酶标仪测定OD₄₀₅值。结果显示，兔抗副溶血弧菌抗体的效价为1×10⁵(表1)。

表1兔抗副溶血弧菌抗体的效价测定

2.胶体金标记兔抗副溶血弧菌抗体的制备

(1)胶体金的制备

取0.01％氯金酸溶液100mL，高档火沸腾2min，迅速一次性加入少量1％柠檬酸三钠溶液，放入微波炉中用中档火继续加热3min后，取出冷却至室温并补充损失水分，制得颗粒大小20nm的胶体金。用0.1mol/L碳酸钾溶液和0.1mol/L盐酸调节pH值至8.4后，室温中进行抗体标记步骤或保存于4℃。

(2)胶体金标记兔抗副溶血弧菌抗体的制备

取胶体金按照适当比例加入兔抗副溶血弧菌抗体，连续搅拌20min，室温静置10min。加入终浓度为1％BSA，连续搅拌15min，室温静置10min。将上述溶液经4℃下1,200×g离心15min，弃沉淀取上清液。上清经4℃13,500×g离心30min，弃上清取沉淀，沉淀用金标抗体洗涤液(含1％BSA，0.01mol/L PBS，pH＝8.4)洗涤，再离心，仔细吸去上清液，将沉淀用金标抗体保存液(含3％蔗糖，1％BSA，0.2％Tween-20和0.02％NaN₃的0.01mol/L PBS，pH＝8.4)重悬至原体积1/10，即为金标兔抗副溶血弧菌抗体，避光保存于4℃或立即进行下一步骤。

3.金标垫的制备

将金标兔抗副溶血弧菌抗体液体均匀喷涂于玻璃纤维上，冷冻干燥，避光密封保存于4℃。

实施例2：副溶血弧菌快速检测试纸检测层的制备及试纸组装

1.副溶血弧菌外膜蛋白的制备

①37℃下扩大培养副溶血弧菌，4℃下8,000×g离心15min，洗去培养基，并用0.01mol/L PBS重悬洗涤3次，最后加入PBS浓缩至原体积1/25。

②向收集的菌液中加入少量10％蔗糖溶液，混匀后，在-20℃中处理15min。加入等体积0.4％Triton X-100(PBS)，在室温下混匀，作用10min。4℃下12,000×g离心15min，取上清。加入2.5倍体积冰乙醇，混匀后，在-20℃下放置过夜。次日，4℃12,000×g离心15min，高速离心取沉淀。

③沉淀经Tris-NaCl(pH＝7.4)洗涤后，加入等体积0.6mol/L KI溶液，混匀后，37℃水浴1h。4℃下12,000×g离心15min，取上清。加入2.5倍体积冰乙醇，混匀后，在-20℃下放置过夜。次日，4℃下12,000×g离心15min，取沉淀。用10mL 0.01mol/L PBS重悬后，于超纯水中透析24h，每6h换一次超纯水。冻干后，溶于PBS调至合适浓度，并冻存于-80℃。

2.副溶血弧菌鞭毛蛋白的制备

①37℃下扩大培养副溶血弧菌，4℃下1,500×g离心30min，洗去培养基，0.01mol/L PBS重悬洗涤3次，最后加入无菌生理盐水浓缩至原体积1/25。

②用1mol/L HCl将收集的菌液pH调整至2.0，室温下不断搅拌30min，并且保持pH＝2.0。4℃下1,500×g离心30min，取上清。4℃下533,000×g离心上清液1h，弃沉淀，取上清。上清液用1mol/L NaOH调整pH至7.2，并缓慢地加入(NH₄)₂SO₄至终浓度为2.67mol/L，冰浴搅拌30min。将混合液4℃放置过夜。次日，4℃下533,000×g离心15min，弃上清，取沉淀，并溶于一定量0.01mol/L PBS中，透析24h，每6h换一次透析液。冻干后，溶于PBS中调制合适浓度，并保存于-80℃。

3.副溶血弧菌胞外产物的制备

①将副溶血弧菌接种于营养琼脂液体培养基，37℃摇床培养24h。取1mL液体培养物涂布在预先放置了一层玻璃纸的营养琼脂平板上，37℃培养24-48h。

②每平板用6mL 0.01mol/L PBS洗下菌体，收集菌悬液在4℃下7,000×g离心30min，上清经0.22pm微孔滤膜过滤取出剩余菌体后，加入终浓度为2.0mol/L的(NH₄)₂SO₄，室温下搅拌1h，4℃沉降过夜。次日，4℃下10,000×g离心1h取沉淀，溶于一定量0.01mol/LPBS中，于超纯水中透析24h，每6h换一次超纯水冻干后后，溶于PBS中调制合适浓度，并冻存于-80℃。

4.副溶血弧菌全菌破碎蛋白的制备

将副溶血弧菌接种于营养琼脂液体培养基，37℃扩大培养24h。4℃下5,000×g，离心15min，0.01mol/L PBS洗涤重悬3次。将菌液调整至1×10⁸CFU/mL，超声波破碎机破碎(Sonics&Materials；振幅39％；pulse on，3sec；pulse off，3sec)至液体澄清，即为副溶血弧菌破碎菌样品，用PBS调整至适合浓度，冻存于-80℃。

5.双抗夹心ELISA检测副溶血弧菌四种抗原蛋白的特异性并确定抗原划线浓度

①将制备好的四种副溶血弧菌抗原蛋白包被96孔酶标板中(100μL/孔)，每个蛋白设三个平行，并以无菌PBS作为阴性对照，4℃过夜。

②吸出包被液，用含0.05％Tween-20的PBS(PBST：含0.05％Tween-20的0.01mol/LPBS，pH＝7.4)洗涤，每次5min，洗3次。

③每孔加入200μL 3％的牛血清白蛋白(PBS配制)，37℃封闭1h，同②法洗涤3次。

④每孔加入100μL兔抗副溶血弧菌抗体(1:2,000稀释)，37℃孵育1h，同②法洗涤3次。

⑤每孔加入100μL碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG(1:8,000稀释)，37℃孵育1h，同②法洗涤3次。

⑥每孔加入200μL底物显色液，暗处反应10-20min，每孔加入50μL 2mol/L NaOH溶液终止显色反应，检测405nm处的OD值。

以包被PBS为阴性对照，测波长为405nm时各孔光吸收值，计算各实验孔与阴性对照光吸收值之比(P/N)，当P/N≥2.1时为阳性，计算四种抗原蛋白间的P/N值的比值，根据结果确定副溶血弧菌快速检测试纸检测层四条检测线的划线浓度比例。所得的T1、T2、T3、T4线上四种抗原蛋白的划线浓度分别为外膜蛋白0.8mg/mL、鞭毛蛋白0.3mg/mL、胞外产物1.0mg/mL、全菌破碎蛋白0.4mg/mL。

6.副溶血弧菌快速检测试纸检测层的制备

用0.01mol/L PBS将副溶血弧菌外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外产物和全菌破碎蛋白的浓度分别调整至0.8mg/mL、0.3mg/mL、1.0mg/mL和0.4mg/mL，用喷膜仪分别将外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外产物和全菌破碎蛋白喷涂于硝酸纤维素膜上作为检测线T1、T2、T3和T4，四条检测线之间相距1.5mm。用0.01mol/L PBS调整羊抗兔IgG的浓度为0.5mg/mL，将其喷涂于硝酸纤维膜上作为质控线(C线)，质控线与检测线T4相距5mm，质控线靠近吸水垫(图1：4)，检测线T1靠近样品垫(图1：1)。将包被好的硝酸纤维素膜室温干燥后，在37℃下封闭液(含3％BSA，0.01mol/L PBS，pH＝7.4)浸泡1h，PBST漂洗3次，每次5min，干燥。

7.副溶血弧菌快速检测试纸的制作

在载体底板(图1：5)的一面一次粘贴上硝酸纤维素膜(图1：3)、金标垫(图1：2)、样品垫(图1：1)和吸水垫(图1：4)，组装成试纸条整板。其中硝酸纤维膜上端边缘重叠于吸水垫边缘之下，而硝酸纤维素膜下端边缘则在金标垫上端边缘之下，样品垫的上端边缘重叠在金标垫的下端边缘之上(图1)。

将组装好的试纸条整版用切条机裁成3.75mm宽的试纸条，装入包装卡壳中，并密封保存于有干燥剂的铝箔袋中。

实施例3：副溶血弧菌快速检测试纸的检测方法

(1)检测样品的制备

取疑似患副溶血弧菌对虾鳃、附肢以及血淋巴，或取疑似患副溶血弧菌病鱼炎症组织、肾或血液，每1g组织样品用5mL 0.01mol/L无菌PBS或0.9％无菌生理盐水，冰浴条件下充分研磨3～5min，用筛绢过滤得到的研磨液作为检测样品液。

(2)副溶血弧菌快速检测试纸的应用

平放本发明试纸卡，向样品孔中滴加检测样品液100μL，等待10～15min，肉眼观察检测结果，根据检测线T1、T2、T3和T4显色情况来判断对虾或鱼是否感染副溶血弧菌。

(3)检测结果的判断

Ⅰ：C线呈现红色条带，T1、T2、T3、T4线皆不显色，结果为副溶血弧菌阳性；

Ⅱ：C线及T1、T2、T3、T4线皆出现红色条带，结果为副溶血弧菌阴性，或者该菌浓度低于检测限；

Ⅲ：C线及T4检测线显色，T1、T2、T3线出现1条或多条线不显色，结果为副溶血弧菌阴性，但感染了与副溶血弧菌抗原存在交叉反应的其他病原菌，结果判定为其他菌的交叉反应。

Ⅳ：C线不显色，试纸失效或本次操作出现问题，检测结果无效。

同时使用试纸检测PBS作为阴性对照，C线及T1-T4检测线皆显色，各条带显色的深浅作为试纸条检测待检样品的参考标准。(图2)

实施例4：副溶血弧菌快速检测试纸的特异性、重复性和稳定性测试

(1)特异性

使用本发明试纸检测纯化的鳗弧菌、鱼肠道弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌，以PBS为阴性对照。结果显示，检测结果为鳗弧菌、鱼肠道弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌和PBS使检测线T1、T2、T3、T4和质控线均显色(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)，表明副溶血弧菌检测结果为阴性；副溶血弧菌使检测线T1、T2、T3和T4均不显色，质控线显色(Ⅵ)，表明有副溶血弧菌(图3)。这些结果表明本发明的快速检测试纸可以准确区分副溶血弧菌感染与其他菌的交叉反应，具有良好的特异性。

(2)重复性

使用不同批次试纸检测副溶血弧菌和PBS，每组重复5次，结果无明显差别。

(3)稳定性

本发明试纸分别以4℃和室温下避光密封储存，每隔1个月使用试纸检测副溶血弧菌和PBS。结果为4℃下储存有效期为12个月，室温下有效期为6个月。

(4)试纸条最低检测限

将纯化的副溶血弧菌用PBS调至5×10⁷、5×10⁶、5×10⁵、5×10⁴CFU/mL。用副溶血弧菌快速检测试纸检测这4种浓度的菌液(图4)。结果当5×10⁴CFU/mL时检测试纸的检测线T1-T4出现较浅的显色，则本发明试纸检测样品中副溶血弧菌的最低浓度下限为5×10⁵CFU/mL。

实施例5：患病大菱鲆中副溶血弧菌的检测

患病大菱鲆体表有不同程度的溃疡，各鳍、肛门红肿，腹部膨大解剖后发现有大量积血性腹水，肝、脾肿大，并且肠道严重出血。无菌操作取病鱼肝、脾、肾等组织，每1g组织样品用5mL 0.01mol/L无菌PBS，冰浴条件下充分研磨3～5min，用筛绢过滤得到的研磨液作为检测样品液。健康大菱鲆组织和PBS同时检测作为阴性对照。

平放本发明试纸检测卡，向样品孔中滴加检测样品液100μl，等待10～15min，肉眼观察检测结果，发现患病大菱鲆样品液使C线显红色，T1-T4检测线皆不显色，表明样品液中具有副溶血弧菌(图5：ⅲ)。健康大菱鲆组织样品液和PBS皆使C线及4条检测线显红色(图5：ⅰ、ⅱ)。

将上述患病大菱鲆的肝、脾、肾等组织研磨液，划线接种于2216E平板，25℃培养24h，挑取形态一致的优势菌落进行纯化培养，直至获得纯培养菌株，利用生理生化及分子生物学方法进行鉴定，采用16S rRNA和hsp60基因序列的扩增，扩增产物送某基因科技有限公司进行测序，分析结果显示为副溶血弧菌感染，表明本发明的副溶血弧菌快速检测试纸具有很好的检测特异性。

Claims (9)

1.一种病原性副溶血弧菌检测试纸，其特征在于，所述的检测试纸包括载体板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫和吸水垫位于载体板的两端，硝酸纤维素膜位于载体板的中部；样品垫与硝酸纤维素膜交界处设有载有金标兔抗副溶血弧菌抗体的金标垫，金标垫一端边缘重叠在样品垫之下，另一端边缘重叠在硝酸纤维素膜之上；硝酸纤维素膜上从靠近金标垫一侧开始设有依次排列的四条检测线T1、T2、T3、T4和一条质控线C，其中四条检测线T1、T2、T3、T4分别是副溶血弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外产物和全菌破碎蛋白；靠近吸水垫的质控线C为羊抗兔IgG；

所述的检测线T1、T2、T3、T4上抗原蛋白的划线浓度分别为外膜蛋白0.8mg/mL、鞭毛蛋白0.3mg/mL、胞外产物1.0mg/mL、全菌破碎蛋白0.4mg/mL。

2.如权利要求1所述的检测试纸，其特征在于，所述的兔抗副溶血弧菌抗体的制备方法如下：

将副溶血弧菌扩大培养，并将病原菌浓度调至1×10⁸CFU/mL，福尔马林灭活后，分4次免疫纯种新西兰大白兔；第一次混入弗氏完全佐剂，背部皮下注射免疫，间隔一周后加强免疫，将副溶血弧菌与弗氏不完全佐剂混匀，背部皮下注射免疫，间隔两周后重复一次；最后一次于耳缘静脉免疫，一周后取血，分离得到血清，辛酸-硫酸铵法纯化得到兔抗副溶血弧菌抗体。

3.如权利要求1所述的检测试纸，其特征在于，所述的副溶血弧菌外膜蛋白，其制备方法如下：

将副溶血弧菌扩大培养，离心后磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤、重悬至原体积1/25，加入少量10％蔗糖，混匀后-20℃下作用15min；室温下加入等体积0.4％Triton-X100，作用一段时间后离心取上清，加入2.5倍体积冰乙醇-20℃过夜；离心取沉淀，洗涤重悬后，加入等体积KI溶液，37℃作用1h；离心取上清，加入2.5倍体积冰乙醇-20℃过夜；离心取沉淀，重悬后透析、冻干得到副溶血弧菌外膜蛋白。

4.如权利要求1所述的检测试纸，其特征在于，所述的副溶血弧菌鞭毛蛋白，其制备方法如下：

将副溶血弧菌扩大培养，离心后PBS洗涤、重悬至原体积1/20，用1mol/L HCl调整pH＝2.0，搅拌30min；低温离心取上清，然后低温超高速离心再取上清；用1mol/L NaOH调整pH中性，加入(NH₃)₂SO₄，4℃放置过夜；低温超高速离心，取沉淀，重悬后透析、冻干得到副溶血弧菌鞭毛蛋白。

5.如权利要求1所述的检测试纸，其特征在于，所述的副溶血弧菌胞外产物，其制备方法如下：

将副溶血弧菌接种于液体培养基中培养24h，取液体培养物涂布于预先放置了一层玻璃纸的固体琼脂平板上，37℃培养36h；每平板用少量PBS洗下菌体，收集后4℃下高速离心；上清液经微孔滤膜过滤，加入(NH₄)₂SO₄，4℃放置过夜；低温离心取沉淀，重悬后透析、冻干得到副溶血弧菌胞外产物。

6.如权利要求1所述的检测试纸，其特征在于，所述的副溶血弧菌全菌破碎液，其制备方法如下：

将副溶血弧菌扩大培养，将菌液置于超声波破碎仪中低温破碎10min，所得即为全菌破碎液，冻干得到副溶血弧菌全菌破碎蛋白。

7.权利要求1所述的检测试纸在检测副溶血弧菌中的应用。

8.一种检测副溶血弧菌的方法，其特征在于，所述的方法，是使用权利要求1所述的检测试纸进行检测。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法的判定标准如下：

Ⅰ：C线呈现红色条带，T1、T2、T3、T4线皆不显色，结果为副溶血弧菌阳性；

Ⅱ：C线及T1、T2、T3、T4线皆出现红色条带，结果为副溶血弧菌阴性，或者该菌浓度低于检测限；

Ⅲ：C线及T4检测线显色，T1、T2、T3线出现1条或多条线不显色，结果为副溶血弧菌阴性，但感染了与副溶血弧菌抗原存在交叉反应的其他病原菌，结果判定为其他菌的交叉反应。