CN102363802B

CN102363802B - 一种副溶血性弧菌显色培养基及其快速检测卡

Info

Publication number: CN102363802B
Application number: CN2011102984942A
Authority: CN
Inventors: 孙霞; 卢新
Original assignee: GUANGZHOU OASIS BIOCHEMISTRY TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: GUANGDONG DAYUAN OASIS FOOD SAFETY TECHNOLOGY CO., LTD.; Guangdong Zhong Da Da Detection Technology Co., Ltd.
Priority date: 2011-10-08
Filing date: 2011-10-08
Publication date: 2013-08-07
Anticipated expiration: 2031-10-08
Also published as: CN102363802A

Abstract

本发明公开了一种副溶血性弧菌显色培养基及其快速检测卡：显色培养基含有蛋白胨、酵母粉、氯化钠、蔗糖、β-葡糖苷、硫代硫酸钠、生物缓冲剂；快速检测卡是一个稳定的微生物培养装置，包括底板、吸水凝胶层、培养基层和盖膜，培养基层上吸附有显色培养基。本发明的副溶血性弧菌显色培养基以β-葡糖苷作显色剂，添加生物缓冲剂，大大提高了检测准确性，且对副溶血性弧菌可进行定性定量分析检测，阳性结果显色明显且观察方便。本发明的快速检测卡具有检测周期短，操作简便，灵敏度高，成本低廉等优点，适用于处理大通量的样本。

Description

一种副溶血性弧菌显色培养基及其快速检测卡

技术领域

本发明属于食品安全微生物检验领域，涉及一种副溶血性弧菌显色培养基，还涉及用显色培养基制作的快速检测卡。

背景技术

食品是人类赖以生存的物质基础，保证食品的安全卫生、防止有毒有害物质通过食品对人体造成危害，是关系人类健康和社会发展的重大问题。近年来，国内外食品安全的恶性事件不断发生，其中食源性致病菌是食品安全事故的重要原因，全世界每年约有220万人因食源性致病菌而丧生，因此，食源性疾病的控制已成为国内外普遍关注的问题。

副溶血性弧菌（Vibrio Parahaemolyticus，简称VP）为常见的一类食源性致病菌，广泛分布于海岸线区域、海水沉积物、鱼贝类等水产动物以及海产品中，能感染人类以及鱼类、虾类、甲壳类等多种水产动物，人类食用了受该菌污染的生的或者未煮熟的食品时会引起腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发热等典型胃肠炎反应，重症患者还会脱水、休克昏迷，甚至死亡。

目前副溶血性弧菌食物中毒占细菌性食物中毒的第三位，有的沿海城市可占第一位；副溶血性弧菌发病呈世界性分布，尤其在沿海地区发病率较高，是进出口水产品检验的重要项目，在食品检测、食品中毒源调查、传染病源调查等项目中，也经常需要对该菌进行检测。

目前，传统的副溶血性弧菌检测方法为：样品经过分离培养、镜检观察、生化鉴定、嗜盐性试验等，操作繁琐，程序复杂，所用试剂繁多，费时费力，检测周期长，需要4～7天，且检出效率低，灵敏度较低；近年来，有大量的报道证实基于PCR的方法已经成功用于检测副溶血性弧菌，虽然具有特异性好、灵敏度高等特点，但其通常需要昂贵、精密的仪器设备，对实验环境和操作者技术要求也比较高。免疫学检测技术快速简便，成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则会导致准确性不够，目前只能是辅助检测手段。另外还有一些检测方法，比如免疫色谱法、DNA杂交法，虽然检测灵敏度高，但是所需设备昂贵，操作过程比较复杂，推广应用上有一定的难度。因此，找到一种简便快速、特异性好、灵敏度高的诊断试剂及其检测方法对于预防控制副溶血性弧菌传播，保证人民生命健康和国家经济健康发展具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于根据现有技术中存在的上述缺陷，提供一种副溶血性弧菌显色培养基及其快速检测卡，以达到检测时间短，检测成本低，简单便捷的目的，从而为食品安全提供科学的依据和指导作用。

本发明解决其技术问题的解决方案是：

一种副溶血性弧菌显色培养基，每1000mL培养基含有蛋白胨8～25g，酵母粉3～8g，氯化钠10～20g，蔗糖15～30g，β-葡糖苷0.01～1g，硫代硫酸钠1～15g，生物缓冲剂0.5～5g，其中，所述生物缓冲剂为甘油，吐温中的至少一种。

优选的，副溶血性弧菌显色培养基，每1000mL培养基含有蛋白胨10～15g，酵母粉3～5g，氯化钠10～15g，蔗糖20～25g，β-葡糖苷0.3～0.45g，硫代硫酸钠8～10g，生物缓冲剂1～3g。

优选的，吐温为吐温80。

一种副溶血性弧菌快速检测卡，其结构由下至上依次为：底板、吸水凝胶层、培养基层、盖膜，培养基层上吸附有上述的显色培养基。

优选的，所述培养基层是由吸附有培养基的吸水滤纸构成。

相对于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明的副溶血性弧菌显色培养基以β-葡糖苷作显色剂，添加生物缓冲剂甘油、吐温，大大提高了检测准确性，且对副溶血性弧菌可进行定性定量分析检测，阳性结果显色明显且观察方便。

本发明用副溶血性弧菌显色培养基制作的快速检测卡，将传统的多步培养鉴定过程简化到一步完成，16～24h即可报告结果，节省了大量时间，方便快捷；省却了繁重的准备、收尾工作，体积轻巧，便于携带，随用随取；相对于倾注平板的方法，每张检测卡上只需要较少的培养基，从而能大大降低成本；操作简单，样品可直接加入，无需特别技巧；检测过程不需要昂贵或复杂的仪器，适用于处理大通量的样本，有利于在食品加工企业和基层监测部门推广应用，能大幅度提高食品安全监测的力度和效率。

附图说明

图1是实施例的副溶血性弧菌快速检卡结构示意图。

具体实施方式

优选的，一种副溶血性弧菌显色培养基，每1000mL培养基含有蛋白胨10～15g，酵母粉3～5g，氯化钠10～15g，蔗糖20～25g，β-葡糖苷0.3～0.45g，硫代硫酸钠8～10g，生物缓冲剂1～3g。

一种副溶血性弧菌快速检测卡，检测卡结构如图1所示，注：1为标签、2为盖膜、3为培养基层、4为吸水凝胶层、5为底板。底板5上方涂有一层胶水，将吸水凝胶层4粘附在底板5上，吸水凝胶层4上方粘连培养基层3，培养基层3上方盖有一张盖膜2，盖膜2通过标签1与底板5连在一起。其中，培养基层上吸附有上述的培养基。

优选的，培养基层是由吸附有培养基的吸水滤纸构成。

本发明的快速检测卡是一个稳定的微生物培养装置。底板是作为承载培养基层和吸水凝胶层的载体，防止水分进出。标签的作用是为了方便对检测样品进行标记，盖膜的作用是为了形成一个有利于微生物生长的优良环境，防止污染和方便结果观察计数。

上述的副溶血性弧菌快速检测卡的检测方法，包括如下步骤：

1) 样品处理：取样品 25 mL（g）放入含有225 mL灭菌生理盐水的取样罐或均质杯内，制成1：10体积比（W/V）的样品匀液；

2) 接种：将本发明所述检测卡置于平坦实验台面，揭开上层盖膜，用灭菌吸管吸取1mL样品匀液，缓慢均匀地滴加到检测卡中央的吸水滤纸上，然后再将上层膜缓慢盖下，静置几秒钟使吸水凝胶层凝固，用手指在吸水滤纸中间轻轻推刮一下，以赶走气泡；

3) 培养：将接种后的检测卡正面朝上水平置于恒温培养箱内，在36±1℃下培养16~24h；

4) 结果判断：对检测卡进行观察，呈紫红色的菌落为副溶血性弧菌。

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1

一种副溶血性弧菌显色培养基，含有蛋白胨15g，酵母粉4g，氯化钠10g，蔗糖25g，β-葡糖苷0.4g，硫代硫酸钠10g，甘油1g，吐温80 1g；

将上述成分溶于水至1000mL，充分溶解，放在磁力搅拌器上混合均匀，即可使用。

实施例2

一种副溶血性弧菌显色培养基，含有蛋白胨13g，酵母粉5g，氯化钠15g，蔗糖22g，β-葡糖苷0.45g，硫代硫酸钠9g，甘油0.5g，吐温80 0.5g；

实施例3

一种副溶血性弧菌显色培养基，含有蛋白胨10g，酵母粉3g，氯化钠13g，蔗糖20g，β-葡糖苷0.3g，硫代硫酸钠8g，甘油1g，吐温80 2g；

实施例4

一种副溶血性弧菌显色培养基，含有蛋白胨25g，酵母粉5g，氯化钠20g，蔗糖30g，β-葡糖苷1g，硫代硫酸钠15g，甘油4g；

实施例5

一种副溶血性弧菌显色培养基，含有蛋白胨20g，酵母粉6g，氯化钠12g，蔗糖18g，β-葡糖苷0.5g，硫代硫酸钠7g，吐温80 0.5g；

实施例6

一种副溶血性弧菌显色培养基，含有蛋白胨8g，酵母粉8g，氯化钠10g，蔗糖15g，β-葡糖苷0.01g，硫代硫酸钠1g，甘油3g，吐温80 2g；

实施例7

一种副溶血性弧菌快速检测卡，结构如图1所示，其培养基层的吸水滤纸吸附有实施例1～6任一种可使用的副溶血性弧菌显色培养基。

上述副溶血性弧菌快速检测卡均包括培养基层、吸水凝胶层、底板、盖膜、标签。所述培养基层的吸水滤纸为天然纤维素材料制成的无纺布，其尺寸为边长45mm的正方形；所述底板为白色，其长度为75mm，宽度为65mm；所述盖膜为聚酯PET透明膜，防水透气，长度为70mm，宽度为65mm，所述标签为不干胶标签，长度是65mm，宽度是15mm。

上述副溶血性弧菌快速检测卡制备方法为：在底板上涂布面积与吸水滤纸的尺寸大小相对应的胶水层，粘覆一层吸水凝胶，将吸水滤纸浸透在液体显色培养基中，取出后粘贴在吸水凝胶层上，放在无菌室内让吸水滤纸自然晾干，再用标签将盖膜和白底板粘贴在一起使其形成一个稳定的微生物培养装置，检测卡制作好后，放入气体消毒器中进行灭菌3h，放入阴凉避光处保存备用。

生物缓冲剂实验：

一种副溶血性弧菌显色培养基的基础配方（不加入任何生物缓冲剂）：将蛋白胨15g，酵母粉4g，氯化钠10g，蔗糖25g，β-葡糖苷0.4g，硫代硫酸钠10g，溶于水至1000mL。

分五组作对比实验： 1）1‰的Triton X-100：在基础配方中加入终浓度为1‰（体积）的Triton X-100；2）1‰的吐温80：在基础配方中加入终浓度为1‰（体积）的吐温80；3）5‰的甘油：在基础配方中加入终浓度为5‰（体积）的甘油；4）混合配方：在基础配方中同时加入终浓度为1‰（体积）的吐温80和终浓度为5‰（体积）的甘油；5）基础配方。

将上述五组配方各成分充分溶解，放在磁力搅拌器上混合均匀，再将其分别制作成副溶血性弧菌快速检测卡。

将副溶血性弧菌（ATCC17802）标准菌株复壮纯化后，挑取单个菌落接种3%NaCl营养琼脂平板（3%NaCl NA平板），培养过夜后稀释成10^-5 、10^-6 、10^-7三个不同浓度的菌液，分别取1ml菌液接种到上述五组快速检测卡，并同时接种3%NaClNA平板做对照，于36±1℃培养16～24h后,计数菌落数目，最后计算出相对于3%NaCl NA平板，快速检测卡的符合率，实验重复3次。实验结果见表1。

Figure 2011102984942100002DEST_PATH_IMAGE002

从表1中可以看出，1）未添加任何生物缓冲剂的基础配方，检测卡上的菌点较清晰，颜色较鲜艳，符合率平均为79%；2）加入1‰的Triton X-100后，检测卡上的出点率急剧减少，符合率最高才达到了50%，且菌点颜色较浅；3）加入1‰的吐温80后，检测卡上菌点颜色较鲜艳，菌点清晰；出点率与平板相比3次试验符合率为89%，比未添加的基础配方提升了10%； 4）加入 5‰的甘油的检测卡效果最好，紫红色菌点清晰不扩散，颜色鲜艳；与平板的符合率也最高，均在90%以上，3次试验结果平均达到了97%，与未添加的基础配方相比提升了19%；5）加入了1‰吐温80和5‰甘油的混合配方，检测卡上的菌点清晰不扩散，紫红色颜色较鲜艳；出点率与平皿相比，3次试验符合率平均为92%，比未添加的基础配方提升了14%。

可见，本发明培养基配方中添加不同的生物缓冲剂对副溶血性弧菌检测的灵敏度和准确度起着不同的效果，生物缓冲剂Triton X-100对副溶血性弧菌的检测起负作用，降低了检测的灵敏度和准确度，而生物缓冲剂吐温80、甘油却大大提高了检测的灵敏度和准确度。

特异性实验：

将副溶血性弧菌（ATCC17802）、金黄色葡萄球菌（CMCC26003）、大肠杆菌（ATCC25922）、大肠杆菌O157（ATCC12900）、肠炎沙门氏菌（39111）、阪崎肠杆菌（ATCC51329）、蜡样芽孢杆菌(CMCC63303)和铜绿假单胞菌(ATCC15442)等8种标准菌株复壮纯化后，分别挑取单个菌落接种相应的营养琼脂平板，培养过夜后稀释成约100cfu/ml的菌液，分别取1ml菌液接种到吸附有实施例1显色培养基的副溶血性弧菌快速检测卡，在36±1℃下培养16～24h，实验重复3次。结果如表2所示。

Figure 2011102984942100002DEST_PATH_IMAGE004

从表2中可以看出，副溶血性弧菌快速检测卡的选择性较强，所有试验的菌株中，只有副溶血性弧菌在检测卡上出现典型的紫红色菌斑，其余非目标菌多数在检测卡上不生长，少数的菌在检测卡上能生长，但菌斑呈蓝色，明显区别于目标菌。可见，副溶血性弧菌快速检测卡特异性很强，可以用于副溶血性弧菌的检测。

最低检出限试验：

将副溶血性弧菌（ATCC17802）标准菌株复壮纯化后，挑取单个菌落接种3%NaCl营养琼脂斜面，培养过夜后用生理盐水洗脱，先制成1.0麦氏度的菌悬液，再稀释成适宜浓度后取1 ml接种到吸附有实施例1显色培养基的副溶血性弧菌快速检测卡，在36±1℃下培养16～24h，检测菌落数目，同时采用平板计数法确定菌落数目，重复实验3次。试验结果如表3所示。

从表3中可以看出，副溶血性弧菌快速检测卡对纯菌的检测灵敏度可达到10⁰数量级，对含菌落数目在0～9范围内的样品液，快速检测卡与平板计数法都能检测出来，检测卡结果与平板计数法结果相比，最低检出量可提高一个稀释度。

人工染菌试验：

用本发明的副溶血性弧菌快速检测卡做样品人工染菌试验，包括以下步骤：

1) 制备菌液：将副溶血性弧菌（ATCC17802）标准菌株复壮纯化后，挑取单个菌落接种3%NaCl营养琼脂斜面，培养过夜后用生理盐水洗脱，先制成1.0麦氏度的菌悬液，再稀释成适宜浓度备用；

2) 样品处理：用小黄鱼作为检测样品，购回后马上在无菌条件下处理：先将样品用流水刷洗，用灭菌镊子和剪刀剪取肠管和鳃，称取25g，放入225mL灭菌3%NaCl 碱性蛋白胨水中，用均质器拍打1min，再倒回样品罐中，即为样品匀液；

3) 准备检测样：吸取步骤1）中的菌液2ml污染步骤2）中的样品匀液，摇匀成检测样。再经过适当的10倍系列稀释使副溶血性弧菌的终浓度分别为100、50、10和1cfu/ml，备用；

4) 接种培养：将以上稀释好备用的检测样品液，分别取1ml接种到吸附有实施例1显色培养基的副溶血性弧菌快速检测卡，于37℃培养16～24h后观察记录结果，重复实验3次，染菌样品液同时按照GB/T 4789.7-2008方法进行比对。

结果与分析：实验结果见表4，由表可知，用本发明所述的副溶血性弧菌快速检测卡检测人工染菌的样品，结果与国标法结果基本一致，当染菌量数目在10个以下时，本发明的副溶血性弧菌快速检测卡也能检测出来，说明其灵敏度非常高。

自然样品的检测试验：

用本发明的副溶血性弧菌快速检测卡做自然样品的检测试验，包括如下步骤：

1) 样品处理：从市场上购回麻虾、小黄鱼、扒皮鱼和白鱼共四种水产品作为检测样品，先将鱼虾样品用流水刷洗，用灭菌镊子和剪刀切取：鱼类剪取肠管和鳃，虾剪取头胸节内的内脏和腹节外沿处的肠管，各称取25g，放入225mL灭菌3%NaCl 碱性蛋白胨水中，用均质器拍打1min，再倒回样品罐中，即为样品匀液；

2) 接种培养：根据对样品污染情况的估计，选择三个连续的适宜稀释度，每个浓度取1ml分别接种到吸附有实施例1显色培养基的副溶血性弧菌快速检测卡，于37℃培养16～24h后观察记录结果。其余样品匀液按照GB/T 4789.7-2008进行检验，比较检测结果。

结果与分析：用国标法检测的结果均为阳性，接种以上四种样品匀液的副溶血性弧菌快速检测卡上都有紫红色的阳性菌斑出现，结果也为阳性。为了更进一步的进行验证，挑取快速检测卡中吸水滤纸上的紫红色菌斑，纯化培养后用API 20E生化鉴定试剂盒进行了鉴定，结果均为副溶血性弧菌。

Claims

1.一种副溶血性弧菌显色培养基，每1000mL培养基含有蛋白胨8～25g，酵母粉3～8g，氯化钠10～20g，蔗糖15～30g，β-葡糖苷0.01～1g，硫代硫酸钠1～15g，生物缓冲剂0.5～5g，其中，所述生物缓冲剂为甘油，吐温中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的副溶血性弧菌显色培养基，其特征在于：每1000mL培养基含有蛋白胨10～15g，酵母粉3～5g，氯化钠10～15g，蔗糖20～25g，β-葡糖苷0.3～0.45g，硫代硫酸钠8～10g，生物缓冲剂1～3g。

3.根据权利要求1所述的副溶血性弧菌显色培养基，其特征在于：吐温为吐温80。

4.一种副溶血性弧菌快速检测卡，其结构由下至上依次为：底板、吸水凝胶层、培养基层、盖膜，其特征在于：培养基层上吸附有权利要求1～3任一项所述的显色培养基。

5.根据权利要求4所述的一种副溶血性弧菌快速检测卡，其特征在于：所述培养基层是由吸附有培养基的吸水滤纸构成。